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Eya2在人神经胶质瘤中过表达并通过调控ERK促进细胞的侵袭转移

Eya2在人神经胶质瘤中过表达并通过调控ERK促进细胞的侵袭转移

引用

作者：温志锋中国医科大学

学位级别：博士

目的:神经胶质瘤在全世界范围内都称得上是常见的恶性肿瘤，并且其每年的发生率仍然在不断攀升。在过去的数十年里，医学诊断技术和治疗手段在不断第提高，然后神经胶质瘤总体不良的预后情况仍然未得到根本性的改变。在各类型恶性肿瘤... 详细信息

目的:神经胶质瘤在全世界范围内都称得上是常见的恶性肿瘤，并且其每年的发生率仍然在不断攀升。在过去的数十年里，医学诊断技术和治疗手段在不断第提高，然后神经胶质瘤总体不良的预后情况仍然未得到根本性的改变。在各类型恶性肿瘤发生和发展的过程中，肿瘤抑制基因和致癌基因保持相对平衡的状态非常重要。寻找新的致癌基因对于更深入地了解神经胶质瘤以及针对神经胶质瘤的治疗手段的发展都具有十分重要的意义。\n 磷酸酶以及transactivator eyes absent(Eya)家族能够编码一系列转录辅酶因子，这些转录产物在眼睛的形成过程中发挥重要作用，同时发现该蛋白家族依赖EGFR，TGF, Hedghog，Notch等多条分子信号通路在人体器官的形成过程中占据重要地位。最新研究表明在人类恶性肿瘤细胞的增殖以及转移过程中该家族蛋白质可能扮演重要角色。已经有报道指出在人类卵巢癌细胞中，Eya2表达上调，并且与患者不良预后情况和较低的生存率有关联。在感染人乳头状瘤病毒的宫颈角质细胞中，敲除Eya2基因后细胞的活力，细胞的增殖能力以及转移能力都受到不同程度的抑制。已有的这些研究成果提示我们在人类恶性肿瘤细胞中Eya2可能是一种致癌基因。但是截至目前，Eya2在人胶质瘤细胞中的生物学作用以及表达模式还未见深入研究。在本次课题研究过程中，我们通过免疫组织化学方法分析人胶质瘤组织中Eya2的临床意义并探究胶质瘤细胞系中Eya2的生物学特性。\n 研究方法:本研究方法经过中国医科大学第一附属医院相关机构批准通过。90例样本取自于2012-2014年间在中国医科大学附属第一医院诊断为胶质瘤，并接受外科手术切除的患者。根据WHO分类原则对胶质瘤组织样本进行组织学分级。\n 采用免疫组织化学方法对胶质瘤组织病理切片进行分析，所用试剂盒为Maixin Elivision plus kit。病理切片在柠檬酸盐缓冲液中进行脱蜡以及抗原修复，时间为2min。然后在室温条件下用过氧化氢对内生性的过氧化物酶进行阻断。接着进行一抗孵育，孵育条件为4℃过夜，使用抗体为Eya2兔多克隆抗体。一抗孵育后用PBS缓冲液对病理切片进行漂洗，接着孵育第二抗体。染色所用试剂盒为DAB plus kit。病理切片经苏木精进行复染，然后经过浓度梯度乙醇脱水，最后封片。\n 细胞核染色则被认定为阳性。样本核染色小于15％时可判定为Eya2低表达，肿瘤样本核染色大于15％时可判定为Eya2高表达。\n 本实验所用细胞系为胶质瘤细胞系U251，U87，A172，购买单位为美国模式培养物保藏中心(ATCC)。细胞所用培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基，并用无菌培养瓶对胶质瘤细胞系进行培养。转染用Eya2质粒购买于Origene公司，配套使用的转染试剂为Lipofectamine3000。Eya2干扰所用siRNA以及相对应的阴性对照购买于美国Dharmacon公司，配套使用的转染试剂为DharmaFECT。\n 使用PCR仪为7900 Real-Time PCR System，反应程序为95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，循环数为40。反应体系为20μl，所用试剂为TAKARA公司所售SYBR Green PCR master mix。PCR实验所用内参为β-actin，基因表达的相对水平测算方法是参照2-△△Ct法。本实验过程中所用的引物为Eya2以及β-actin，其引物序列如下:Eya2 forward，5\'CACTCCCTGAAGGCACTAAACCTCATC3\'，Eya2 reverse,5\'CTGCATTATC CTCTCGAAGCAGCTCTC3\';Actin forward,5\'ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC3\'，Actinreverse,5\'CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG3\'.\n 基质胶侵袭实验所用材料为Transwell小室，首先要对小室进行包膜处理，每孔用18μl Matrigel，稀释比例为1∶4。siRNA转染后48小时，用胰蛋白酶对细胞进行消化制备细胞悬液，制备细胞悬液所用培养基为无血清DMEM培养基，并将该细胞悬液100μl加入上室。下室加入含有15％胎牛血清的DMEM培养基。穿过基底膜的细胞经过固定，苏木精染色后在显微镜下进行细胞计数。\n 集落形成实验:经过处理的细胞接种于直径为6厘米的培养皿中，连续培养两个星期。用吉姆萨染色液对细胞集落进行染色并于显微镜下进行观察，细胞数目超过50个即可记为一个集落。\n CCK8实验:将细胞接种于96孔板中，每孔加入20μl CCK8溶液。加入CCK8溶液后要将细胞继续孵育4个小时，然后倒掉孔板中的培养基，加入二

关键词：神经胶质瘤 Eya2蛋白致癌基因细胞侵袭细胞增殖 ERK信号通路

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单细胞水平的输尿管癌和膀胱癌转录组特征比较分析

单细胞水平的输尿管癌和膀胱癌转录组特征比较分析

引用

作者：张庆云广西医科大学

学位级别：博士

背景及目的:输尿管癌属于上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma,UTUC),具有起病隐匿、临床进展快、复发率高和生存预后差的特点。目前泌尿外科临床医生的共识是UTUC较膀胱癌恶性程度更高、预后更差,因此会采取更积极的治... 详细信息

背景及目的:输尿管癌属于上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma,UTUC),具有起病隐匿、临床进展快、复发率高和生存预后差的特点。目前泌尿外科临床医生的共识是UTUC较膀胱癌恶性程度更高、预后更差,因此会采取更积极的治疗手段,但由于输尿管癌发病率低相关研究较少,而且与膀胱癌有着相同的临床表现和组织学外观,所以目前输尿管癌的诊疗方案几乎都是参照膀胱癌的方案执行,对其病因及发病机制却知之甚少。越来越多的证据表明,输尿管癌相对于膀胱癌是一种独特的疾病类型,应该区别看待。随着医疗技术的迅猛发展,输尿管癌早期检出率大大提高,手术操作技术也由传统的开放手术发展到腹腔镜甚至机器人手术和腔内微创手术。与此同时,精准治疗理念的提出,包括尿路上皮癌在内的新的肿瘤分子分型不但可以为患者提供个体化的精准治疗方案而且还可以对患者的预后进行精准评估。尽管如此,输尿管癌的治疗效果并未得到实质性的提高,早期患者手术后复发率仍居高不下,晚期患者治疗方法有限,以铂类为基础的化疗和免疫治疗总体反应率低,治疗有效持续时间短,急需找到治疗UTUC新的突破点。二代高通量测序技术的发展使得我们对疾病的转录组和基因组进行全貌分析成为可能,但本身也存在一定的局限性,因为这种方法得到的结果反映的是所有细胞的平均表达水平,不能准确的定位到具体细胞类群,一些具有重要功能但数量并不多的细胞群信息也会被淹没。单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing,sc RNA-seq)技术的出现弥补了这方面的不足,使得传统的批量组织学研究转向单个细胞层面的研究。通过sc RNA-seq技术分析,不仅可以了解每个细胞的独特变化,而且还可以发现新的细胞类型和新的细胞标记基因。使得复杂组织中的细胞类型得到精准区分,以单个细胞为单位对功能状态相同的细胞进行聚类,从而在单细胞水平上进行更加精准的分子机制研究。本研究利用sc RNA-seq技术优势描绘输尿管癌单细胞转录组图谱景观及对各细胞类群功能进行深入分析。同时希望通过与膀胱癌sc RNA-seq数据进行比对,找到导致输尿管癌恶性表型明显和预后不良的原因,为输尿管癌的治疗提供单细胞层面的依据和潜在的新的治疗靶点。方法:3例人输尿管癌标本经酶消化的方法制备成单细胞悬液。通过10X Genomics设备将悬液制备成单细胞油包水结构,构建c DNA文库后进行测序。使用10X Genomics提供的Cell Ranger软件对测序数据进行初步分析,R包Seurat、Monocle2等单细胞相关分析软件对人类输尿管癌sc RNAseq数据进行质量控制和深入分析。通过q PCR、Western Blot、免疫组织化学实验对输尿管癌组织和正常输尿管组织的PPP4C表达水平进行验证。构建PPP4C重组质粒DNA转染正常尿路上皮细胞,通过细胞增殖实验、克隆形成实验和细胞迁移、侵袭实验观察过表达PPP4C基因对正常尿路上皮细胞生物学行为的影响。3例人膀胱癌标本同样通过10X Genomics设备将单细胞悬液制备成单细胞油包水结构,构建c DNA文库进行测序。将测序数据进行初步分析后采用Harmony包把输尿管癌和膀胱癌数据进行整合。使用Find Clusters、Find All Marker函数将合并后的数据进行无偏聚类分析并算出不同类型细胞之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。结果:描绘了输尿管癌单细胞水平的转录组图谱景观。通过主成份分析和无偏聚类分析,最终把人输尿管癌单细胞转录组图谱分成17群不同的细胞类型,在分类出的7种不同的肿瘤细胞亚群中,各群高表达基因富集通路不一样,通过拟时态分析重建了人输尿管癌肿瘤细胞的发育轨迹并找到了在输尿管癌分化发育过程中的关键基因。输尿管癌中的肿瘤相关成纤维细胞高表达ACTA2和TAGLN,同时表达PDGFRB和TGF-β。在验证了输尿管癌具有较高FGFR表达的同时发现输尿管癌内PPP4C基因表达上调,尤其是在肿瘤细胞核中表达显著增加,正常尿路上皮细胞过表达PPP4C后增殖和迁移的能力显著增强。成功捕获了包括人输尿管癌和膀胱癌样本在内的46180个高质量单细胞转录组信息,全面描绘了尿路上皮癌单细胞转录组图谱景观,通过主成份分析和无偏聚类分析将人尿路上皮癌细胞图谱分成27群不同的细胞类型。通过比对输尿管癌和膀胱癌单细胞转录组数据我们发现:输尿管癌和膀胱癌肿瘤微环境中各自细胞亚群的构成比不一样,输尿管癌的细胞图谱构成中以肿瘤细胞为主,占81.3%,基质细胞和免疫细胞占比较少,而膀胱癌的细胞图谱中免疫细胞却占了绝大多数,肿瘤细胞仅占22.8%;其次,输尿管癌和膀胱癌内肿瘤细胞的构成比不一样,尤其是第10群肿瘤细

关键词：上尿路尿路上皮癌输尿管癌膀胱癌单细胞RNA测序

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CoCl<,2>对神经型一氧化氮合酶表达的作用及其调控机制研究

CoCl<,2>对神经型一氧化氮合酶表达的作用及其调控机制研究

引用

作者：李光宇中国医科大学

学位级别：博士

目的:缺血性脑损伤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率，致残率和复发率极高。对其深入研究具有重要的理论和临床应用价值。神经细胞对缺血十分敏感，神经系统很多的疾病的发生，发展和缺血过程相关。在神经外科疾病的治疗中缺血... 详细信息

目的:缺血性脑损伤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率，致残率和复发率极高。对其深入研究具有重要的理论和临床应用价值。神经细胞对缺血十分敏感，神经系统很多的疾病的发生，发展和缺血过程相关。在神经外科疾病的治疗中缺血和低氧也是影响病人预后的重要因素之一。神经型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)最早发现于大鼠的小脑组织，现已被证明广泛的存在于神经系统中，在维持神经元的功能如神经递质的传递，神经元发育，突触塑形，调节基因表达等方面发挥重要的作用，同时参与许多神经系统疾病的病理过程。除了神经系统外，还在其他很多组织如骨骼肌，肺，肾脏中发现了nNOS的表达。nNOS在体内具有多样而复杂的功能，它的基因结构和表达调节也十分复杂。一氧化氮合酶尤其是神经型一氧化氮合酶在神经系统缺血过程中起到重要作用。但是现在对它在神经系统缺血中的作用和调控的研究存在较大的分歧。我们的研究拟通过低氧化学模拟物CoCl2刺激神经母细胞瘤SK-N-SH，进而探讨nNOS在模拟低氧条件下的表达情况和调控机制。预适应是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护现象，在多种动物的心脏，肝、肾和脑等多种组织、器官和细胞中都发现了这种机制的存在，其中在心脏和脑中这种现象受到特别的关注。有研究认为nNOS在低氧预适应中起到重要作用，我们拟通过低氧的化学模拟物CoCl2刺激神经母细胞瘤SK-N-SH建立预适应模型，进而研究nNOS在低氧预适应中的作用，并对其预适应的机制进行初步研究。材料与方法:1.实验材料：RNA提取试剂TRIzolReagent购自GIBCOBRL，逆转录试剂盒购自Promega，Real-timePCR试剂盒购自Takara，一氧化氮荧光染料DAF-Ⅱa购自Anxora，Real-timePCR相关引物和探针购自上海博亚生物技术有限公司，人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH购自中国科学院上海细胞生物研究所，PCR产物纯化试剂盒及柱离心胶回收纯化试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自MERCK公司产品，琼脂糖购自Promega公司，载体连接系统pMD18-TVector购自Takara公司，PGL3-basic报告基因载体购自Promega公司，γ-32pATP购自北京福瑞德公司，双重荧光素酶报告基因检测试剂盒购自promega公司，抗体购自Santacruz公司。 2.实验方法：以CoCl2为低氧的模拟刺激刺激人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH，提取RNA，进行Real-timePCR定量分析nNOSmRNA的表达情况。以荧光染料DAF-ⅡA检测在刺激后NO产生情况;Western-blot方法分析在刺激后nNOS蛋白的表达情况。设计探针，以同位素标记，以EMSA的方法检测nNOSExon1f启动子区域的低氧反应元件(HRE)和C/EBPα反应元件的活性，并以ChIP的方法验证。构建PGL3-basic荧光素酶报告基因表达载体，在CoCl2的刺激下检测其报告基因的表达，鉴定反应元件的活性。以CoCl2为低氧的模拟刺激对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH进行预适应刺激，以无血清模拟低氧刺激，MTT法检测细胞增殖，流式细胞方法检测细胞凋亡。提取RNA，进行RT-PCR分析nNOSmRNA和BCL-2，Apaf-1的表达情况。结果:***2刺激对SK-N-SH细胞nNOS基因表达的影响：Real-timePCR检测结果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中nNOS的表达升高，并且呈时间和剂量依赖性。DAF-ⅡA荧光染料分析表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中NO的含量升高，在应用了nNOS特异性拮抗剂7-NI后可以使NO的含量下降，表明了在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中NO的含量升高至少有一部分来源于***-blot结果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中nNOS的蛋白表达增高，而7-NI可以拮抗这种作用。 ***1f启动子区域低氧反应元件HRE的鉴定：EMSA的结果显示nNOSExon1f启动子区域的HRE可以和转录因子HIF-1α结合。ChIP结果表明在CoCl2的刺激下HIF-1α和该HRE的结合增强。pGL3荧光素酶报告基因的检测结果表明在CoCl2的刺激下含HRE的启动子活性增加60％。 ***1f启动子区域C/EBPα反应元件的鉴定：EMSA的结果显示nNOSExon1f启动子区域的C/EBPα结合位点可以和转录因子C/EBPα结合。ChIP结果表明在CoCl2的刺激下HIF-1和该C/EBPα反应元件的结合增强。pGL3荧光素酶报告基因的检测结果表明在CoCl2

关键词：神经型一氧化氮合酶低氧诱导因子 CCAAT增强子结合蛋白低氧预适应

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TRPM7在压力超负荷下小鼠心肌纤维化形成中的作用

TRPM7在压力超负荷下小鼠心肌纤维化形成中的作用

引用

作者：秦鑫中国医科大学

学位级别：博士

高血压(Hypertension)是最常见的心血管疾病，由于发病率较高已成为全球范围重要的公共健康问题。长期高血压的患者会发生代偿性的心肌肥厚(Cardiachypertrophy)，最终导致心功能障碍和心力衰竭，其发生与心肌重构(Myocardialremodeling... 详细信息

高血压(Hypertension)是最常见的心血管疾病，由于发病率较高已成为全球范围重要的公共健康问题。长期高血压的患者会发生代偿性的心肌肥厚(Cardiachypertrophy)，最终导致心功能障碍和心力衰竭，其发生与心肌重构(Myocardialremodeling，MR)密切相关。临床观察和实验室研究证明，心肌纤维化(Myocardialfibrosis)是心肌重构的重要病理表现之一，也是造成心力衰竭的主要原因。因此，明确心肌纤维化的发生机制，将有利于寻找新的治疗靶点，对临床防治心脏疾病具有重要意义。\n 心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts，CFs)是心肌纤维化产生的细胞学基础。在某些病理因素如心肌损伤、缺氧应激、机械牵拉、炎性刺激等作用下，心肌成纤维细胞会过度增殖、迁移和发生表型转变，分化成为肌纤维母细胞(Myofibroblasts，MFB)。肌纤维母细胞通过分泌细胞外基质蛋白(Extracellular-matrix，ECM)、生长因子、细胞介素、趋化因子和蛋白酶等，对纤维化的形成起着重要作用。然而，关于调控心肌成纤维细胞分化，进而促进纤维化形成的分子机制还不清楚。\n Ca2+信号参与细胞的多种功能，包括细胞的增殖、分化、基因表达、细胞的凋亡等。研究表明，在心肌成纤维细胞上并不存在功能性电压依赖性Ca2+离子通道，这与其静息膜电位(-20 mV)下电压门控离子通道处于失活状态有关，提示非电压门控的Ca2+通道可能对心肌成纤维细胞的生理功能起主导作用。瞬时感受器电位(Transient receptor potential，TRP)通道是近年来发现的非电压门控性离子通道，能被多种刺激所激活，包括氧化应激、机械牵拉、细胞代谢产物、热刺激等。TRPM7(Transient receptor potential melastatin related7)通道是TRP家族成员之一，广泛存在于机体的组织器官中，参与细胞的增殖和分化、运动和迁移、胚胎的发育、氧化应激反应以及细胞的凋亡等。最近的研究发现，在人类心房肌成纤维细胞上，TRPM7通道是对Ca2+通透的主要的功能性离子通道，并且参与心房肌成纤维细胞的增殖、分化和胶原的生成。由此我们推测，TRPM7可能参与心肌成纤维细胞的促纤维化作用。\n 转化生长因子-β1(Transforming growth factor beta-1，TGF-β1)是体内促进心肌纤维化的重要细胞因子之一，研究表明，TGF-β1具有促进心肌成纤维细胞向肌纤维母细胞分化、促进胶原基因表达、ECM合成与沉积等作用。而细胞内Ca2+信号是TGF-β1信号转导通路中重要的第二信使，使用Ca2+通道阻滞剂能够部分抑制TGF-β1介导的心肌纤维化形成。TRPM7通道作为心肌成纤维细胞上主要的功能性Ca2+离子通道，很可能与TGF-β1介导的心肌纤维化过程相关联。\n 神经鞘脂类(Sphingolipids)分子是细胞膜的一个重要组成成分，同时在细胞的信号转导过程中发挥着重要作用。神经鞘脂类分子主要包括神经酰胺(Ceramide，Cer)、神经鞘氨醇(Sphingosine，SPH)、1-磷酸神经鞘氨醇(Sphingosine1-phophate，S1P)等。它们参与细胞的多种生物学过程，被称作“具有生物活性的脂类”。最新的研究发现，某些神经鞘脂类分子对TRP通道家族中的一些成员具有调节作用。因此我们推测神经鞘脂类分子可能对TRPM7通道也有调节作用。\n 为明确心肌纤维化的发生机制，本研究通过主动脉弓缩窄术(Transverse AorticConstriction，TAC)模拟和建立压力超负荷(高血压)致小鼠心肌纤维化模型，采用心脏超声、免疫组织化学方法、电生理学方法、钙比率荧光成像技术以及基因敲除等多种分子生物学技术，探讨TRPM7在心肌纤维化形成中的作用和潜在的分子机制以及内源性的神经鞘磷脂分子及其结构类似物对TRPM7通道活性的影响，以期为临床上心肌纤维化的治疗寻求新的干预靶点和新药开发提供实验依据。\n 实验材料和方法\n 将20只雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄)随机分为TAC模型组和假手术组，每组10只，运用心脏超声监测各实验条件下小鼠心功能变化情况。于术后8周处死小鼠切取心脏，检测心脏及肺脏的重量，计算心脏肥厚指数和肺重量指数。通过HE染色方法观察心脏结构变化；采用苦味酸.天狼猩红胶原染色(Picro-siriusred)检测心肌纤维化程度并计算心肌胶原容积分数(Cardiac collegen volumefraction，CVF)；通过Western blot检测心肌组织中TRPM7蛋白表达水平。\n 另将20只TR

关键词：心肌成纤维细胞钙离子信号转化生长因子-β1 TRPM7通道发病机制

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人大肠癌肿瘤相关抗原的鉴定及性质分析

人大肠癌肿瘤相关抗原的鉴定及性质分析

引用

作者：陈航中国医科大学

学位级别：博士

目的:大肠癌是世界性的恶性肿瘤，发病率已占到常见肿瘤的第三位，是严重危害生命健康的疾病。早期大肠癌治疗以手术为主，结合术后化疗，但这些治疗仍然难以避免患者面临的肿瘤复发风险。因此寻找大肠癌的肿瘤标志物与特异抗原或相关... 详细信息

目的:大肠癌是世界性的恶性肿瘤，发病率已占到常见肿瘤的第三位，是严重危害生命健康的疾病。早期大肠癌治疗以手术为主，结合术后化疗，但这些治疗仍然难以避免患者面临的肿瘤复发风险。因此寻找大肠癌的肿瘤标志物与特异抗原或相关抗原，早期发现大肠癌，使患者早期接受手术治疗，提高5年生存率就显得十分重要。癌胚抗原(CEA)是大肠癌临床诊断的指标之一，但特异性不高。　　近年来，分子标志物在肿瘤治疗中的作用日益受到关注，一些在肿瘤组织特异性表达或高表达的肿瘤抗原是肿瘤标志物的主要组成部分。研究肿瘤抗原的分子机制，可以为临床上肿瘤免疫诊断和治疗提供理论基础。　　抗体为基础的免疫治疗一直是极有前景的肿瘤治疗方法，许多单克隆抗体药物已经被批准应用到临床治疗并有效提高临床患者的生存率。本研究室成功制备鼠抗人大肠癌单克隆抗体ND-1，可识别人类大分子量结肠癌细胞表面抗原LEA。间接免疫荧光实验结果表明，百分之九十的大肠癌细胞系表达抗原LEA，而46株非大肠癌细胞系不表达抗原LEA，人类肿瘤冰冻切片组织和正常胎儿组织也表达抗原LEA，近千例临床病理显示，抗原LEA在正常组织、非大肠癌组织和良性病变中几乎不表达或表达量很低，而对中高分化的大肠癌是较特异的肿瘤相关抗原。间接免疫荧光实验证实LEA的表达不同于CEA，在大肠癌诊断特异度方面，抗原LEA强于CEA。因此，本文的研究集中鉴定单克隆抗体ND-1的特异性抗原LEA，进而探讨此蛋白在肿瘤发生中的作用。　　90年代第一次建立了重组cDNA表达文库的筛选方法，开创了检测肿瘤抗原的新时代，通过筛选文库已克隆出上千种目的基因。为了提高筛选的特异性，在此基础上，单克隆抗体因其对相应靶抗原具有高度的特异性而成为抗肿瘤药物研发和肿瘤靶向治疗的主要领域，运用特异性抗体筛选文库将更有利于找到靶抗原。因此，本研究构建了人大肠癌细胞系CCL-187 cDNA表达文库，用单克隆抗体ND-1筛选文库得到与肿瘤生物行为相关的抗原基因。　　同时，大规模蛋白质组学已成功用于差异蛋白的表达分析。因此，本文采用质谱分析的方法，通过免疫沉淀分离出单克隆抗体ND-1特异结合的抗原LEA，通过质谱鉴定及一系列细胞生物学和生化方法验证，最后推测抗原LEA为血影蛋白βⅡ(Beta-Ⅱ spectrin，β2SP)。尤为重要的是，免疫显微镜观察到β2SP特异性的细胞膜定位;用Beta-Ⅱ spectrin siRNA干扰后，细胞膜表面抗原LEA的表达显著抑制。此外，我们对Beta-Ⅱ spectrin表达进一步研究，结果表明:β2SP在大肠癌组织表达和分布与LEA一致。因此，我们认为抗体筛选联合质谱鉴定用于寻找细胞表达蛋白的方法是有效的。　　综上所述，本文通过一系列研究从抗原LEA鉴定、功能验证等方面，推断抗原LEA可能为血影蛋白βⅡ，在大肠癌细胞膜表面的表达与肿瘤分化和转移相关。抗原LEA作为新的大肠癌膜表面标志，有可能成为肿瘤诊断和治疗的新靶标。　　方法:人大肠癌细胞系CCL-187λZAP cDNA表达文库构建及筛选:1、从人大肠癌细胞系CCL-187中提取出总RNA，并纯化出mRNA，将mRNA反转录合成双链cDNA。2、双链cDNA经酶切、分离、除去小片段。3、大于400bp的双链cDNA连接载体，构建表达文库。4、采用蓝白筛选和PCR方法来鉴定cDNA文库并扩增。5、单克隆抗体ND-1筛选文库，获得阳性克隆。6.、阳性克隆复筛，体内剪切，测序及BLAST同源性分析。鉴定和分析单克隆抗体ND-1特异性结合抗原LEA∶1、Western Blot检测单克隆抗体ND-1特异性结合抗原LEA在大肠癌细胞系CCL-187中的表达情况。　　2、免疫沉淀结合质谱分析来鉴定单克隆抗体ND-1特异性结合抗原LEA。3、相互免疫沉淀和免疫印迹实验验证质谱结果。4、抗原LEA与β2SP在细胞表面的特异性定位分析。5、生物素化标记纯化膜蛋白，Western Blot检测蛋白定位细胞膜。6、单克隆抗体ND-1与β2SP抗体竞争结合实验。7、siRNA实验验证质谱结果。8、免疫组织化学方法检测LEA及β2SP在癌变组织中的表达情况。9、鉴定靶蛋白在肿瘤细胞系的表达。　　结果:成功构建了人大肠癌细胞CCL-187的cDNA表达文库:1、构建了人大肠癌CCL-187细胞株cDNA表达文库，原始库容量为2.3×106 pfu/ml，重组率97％。表达文库中的cDNA片段平均大小1 kb以上。可以用其它的抗体或寡核昔酸探针筛选大肠癌的肿瘤相关基因。2、以单克隆抗体ND-1筛选该文库，获得2个阳性克隆。基因序列分别与Homo sapiens KIAA0141(KIAA0141)，transcript variant2、mRNA和Homo sapiens enolase1，(alp

关键词：大肠癌肿瘤标志物特异抗原手术治疗临床诊断

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RNF146在非小细胞肺癌中的表达及其调节肺癌增殖侵袭机制研究

RNF146在非小细胞肺癌中的表达及其调节肺癌增殖侵袭机制研究

引用

作者：高英中国医科大学

学位级别：博士

目的： 　　肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，肺癌的发病率和死亡率已跃居各类恶性肿瘤的首位，而非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的75-80％。目前肺癌的治疗效果及肺癌患者的长期生存率仍不尽人意。肺癌发展进程中多种... 详细信息

目的： 　　肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，肺癌的发病率和死亡率已跃居各类恶性肿瘤的首位，而非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的75-80％。目前肺癌的治疗效果及肺癌患者的长期生存率仍不尽人意。肺癌发展进程中多种因子的激活、抑制、相互协同或拮抗均对肺癌的发生和转移产生影响。因此，寻找肺癌发生、转移过程中的有用的生物学标记物，揭示肺癌新的治疗靶点是目前肿瘤分子生物学研究的热点。 　　E3泛素连接酶能够调节多种细胞功能，如细胞增殖、细胞周期阻滞和细胞凋亡等。一些E3泛素连接酶及其相关的泛素网的失调通常与人类疾病有关，特别是肿瘤和神经退行性疾病。E3泛素连接酶可以是癌基因，也可以是抑癌基因，主要取决于它们所降解的靶蛋白是抑癌蛋白还是促癌蛋白。许多含有RING-finger结构域的蛋白都拥有泛素连接酶活性，其中有些参与了肿瘤的生成和转移。 　　RNF146(RING finger protein146)基因定位于人类染色体6q22，33上。其蛋白含有WWE和N末端RING finger结构域，被鉴定是一种E3泛素连接酶。研究发现，RNF146通过与PAR结合而抑制Parthanators，具有神经保护作用。RNF146还能够促进DNA修复，防止DNA损伤性药物或γ射线诱导的细胞死亡。在细胞损伤之后，RNF146能转移到核内，促进参与DNA损伤修复的各种核蛋白的泛素化和降解。更重要的是，RNF146能够作为PAR核糖基化调控下的E3泛素连接酶，调节tankyrase依赖的axin的降解，从而正向调节Wnt信号通路。 　　Wnt信号转导通路与肺癌的转移、扩散、复发密切相关，是在肺癌细胞和已扩散肺癌细胞中保持高活性的通路。Wnt信号转导通路激活后可增加肺癌细胞转移和增殖的能力。Wnt通路可以通过多种机制异常活化，其主要功能是抑制磷酸化调控下的β-catenin的蛋白水解。从APC/Axin/GSK-3β/β-catenin降解复合体中被释放的β-catenin能够进入细胞核，激活Wnt的靶基因。在这一过程中Axin作为一种构架蛋白参与β-catenin降解复合体的形成，其稳定性至关重要。Tankyrase(PARP5)能够催化PAR转移至Axin的残基上，导致Axin的PAR核糖基化。RNF146能够通过自身的PAR结合域与PAR核糖基化的Axin结合，然后发挥其E3连接酶的作用，降解Axin，从而引起β-catenin降解复合体的解散，胞质内β-catenin聚集，促进Wnt信号通路。之前的研究已经证明Axin与肺癌的侵袭和增殖能力密切相关，因此我们推测，RNF146可能通过调节Axin的稳定性而影响肺癌中β-catenin的表达与定位，从而对肺癌细胞的增殖、侵袭和转移产生影响。 　　为了证实我们的推测，我们首先采用RT-PCR、Western-Blot和免疫组织化学方法检测手术切除的肺癌和癌旁肺组织中RNF146的表达水平及其与临床病理因素和肺癌预后的关系、并分析RNF146与Axin和β-catenin表达的相关性。然后在人非小细胞肺癌细胞系中转染RNF146过表达或者干扰质粒，通过上调或干扰RNF146检测肺癌细胞中Axin和β-catenin的变化，以及上调和干扰RNF146后对肺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并探讨其可能的分子机制。 　　方法： 　　1、组织来源 　　133例NSCLC肺癌组织和40例癌旁肺组织石蜡标本来自2005年1月至2008年12月在中国医科大学附属第四医院行外科手术切除的标本。其中鳞癌62例，腺癌71例，有淋巴结转移60例，无淋巴结转移73例。Ⅰ期69例，Ⅱ-Ⅲ期64例。20例新鲜肺癌组织和癌旁肺组织来自2010-2011年原发性肺癌患者外科手术切除标本。癌旁组织距离癌巢达5cm以上。一部分标本在切除后5分钟内取材并迅速置液氮中速冻，然后置于-80℃深冻冰箱保存备用。另一部分标本离体后用中性福尔马林固定。 　　2、支气管上皮、肺鳞癌和肺腺癌细胞系 　　正常支气管上皮细胞系HBE，腺癌细胞系A549、H1299购自美国标准菌种收藏所。肺鳞癌细胞系LK2、LH7和腺癌细胞系LTE、SPC购自中国科学院上海细胞库。 　　3、免疫组织化学染色 　　将石蜡组织切成4μm厚切片，脱蜡，脱水，在PH6柠檬酸盐修复液中高温高压修复3分钟，3％H2O2孵育20分钟。抗RNF146多克隆抗体、抗Axin和抗β-catenin多克隆抗体4℃孵育过夜。采用EnVision试剂盒检测抗体结合。以PBS代替一抗作为阴性对

关键词： RNF146基因非小细胞肺癌细胞增殖细胞侵袭

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粘蛋白MUC1在乳腺癌免疫诊断和免疫治疗中的作用研究

粘蛋白MUC1在乳腺癌免疫诊断和免疫治疗中的作用研究

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作者：张凯丽河北医科大学

学位级别：博士

乳腺癌(breastcancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年有120万妇女发生乳腺癌。北美和欧洲等西方国家是乳腺癌高发区，据统计，美国妇女平均每9人中将有1人最终患乳腺癌。从20世纪70年代起，原为乳腺癌低发区的亚洲国家发病率... 详细信息

乳腺癌(breastcancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年有120万妇女发生乳腺癌。北美和欧洲等西方国家是乳腺癌高发区，据统计，美国妇女平均每9人中将有1人最终患乳腺癌。从20世纪70年代起，原为乳腺癌低发区的亚洲国家发病率逐年上升，在我国，特别是在北京、上海等发达城区己成为危害妇女健康的主要恶性肿瘤。随着分子生物学的飞速发展及各种高新技术的不断涌现，乳腺癌基础研究取得了长足的进步。乳腺癌的早期发现是提高乳腺癌生存率和降低转移复发率的重要手段，而乳腺癌的治疗也从单一的手术治疗发展为结合手术、化疗、放疗、内分泌治疗及免疫治疗、基因治疗的综合治疗体系，进一步提高了乳腺癌的治愈率和生存率。在乳腺癌的基础研究新进展中，筛选特异性肿瘤标志物成为重要的一个方面。筛选特异性肿瘤标志(tumormarker)可用于肿瘤的早期发现与疗效评价，并且可以针对特异性肿瘤标志物研制特异性抗体，携带化学药物、生物毒素、放射性核素示踪迹等“生物导弹”定向杀伤肿瘤细胞，还可以研制免疫瘤苗开展对于肿瘤的生物治疗。近年研究发现的粘蛋白家族成为之一，MUC1在乳腺癌组织中的异常表达和糖基化，为免疫学诊断与生物治疗提供了新的靶点。粘蛋白1(MUC1)又称多形上皮粘蛋白(polymorphicepithelialmucin，PEM)，是一种主要分布于腺上皮细胞的跨膜糖蛋白，最先由Shimiza于1982年从人的乳汁中分离得到。2000年6月，人类白细胞分化抗原工作组将MUC1归类于白细胞分化抗原(clusterofdifferentiation，CD)，命名为CD227。研究证明,MUC1在肿瘤细胞上的表达与正常细胞是不同的，主要体现在以下几个方面：(1)MUC1在肿瘤细胞表面的表达量较正常细胞显著升高；(2)MUC1在正常细胞上呈极性分布，集中位于腺上皮细胞的腺腔面；而在肿瘤细胞上MUC1却呈失极性，均匀地分布于细胞的表面；(3)MUC1在肿瘤细胞与正常细胞中的糖基化有不同的格局，使得MUC1核心序列表位暴露，刺激机体产生免疫应答。由于MUC1在肿瘤细胞上表达的量和质都发生了变化，因此MUC1成为一种重要的肿瘤标志物，在乳腺癌诊断和治疗中具有潜在的临床应用价值。由于MUC1作为一个肿瘤相关抗原能够有效的诱导机体产生肿瘤免疫应答，因此NUC1一直是研究抗肿瘤免疫的一个热门话题。继上世纪80年代成功制备了针对MUC1单克隆抗体后，以单克隆抗体为载体，对乳腺癌的抗体治疗研究方兴未艾。乳腺癌的特异性主动免疫治疗的一个重要的突破性进展是单克隆抗体herceptin的研究和应用。而另一个进展是双特异性抗体介导效应细胞的抗肿瘤作用的研究，已成为近年来肿瘤新型免疫治疗的主要研究方向之一。本研究分以下三个部分：第一部分：粘蛋白MUC1在乳腺癌诊断、预后及侵袭转移中的作用机制研究目的：a.检测粘蛋白MUC1在乳腺癌组织及乳腺良性组织中的表达，探讨MUC1作为一种新型乳腺癌肿瘤标志物的可能性；b.检测粘蛋白MUC1在乳腺癌组织中的表达，并与乳腺癌组织中ER、PR、c-erbB2及乳腺癌患者临床病理学指标及预后指标进行相关性分析，探讨MUC1作为乳腺癌临床预后指标的意义；c.检测粘蛋白MUC1在乳腺癌组织中的表达，并同时检测黏附分子E-cadherin的表达，探讨MUC1在乳腺癌侵袭、转移中的作用机制。方法：应用免疫组织化学SP法检测5例乳腺纤维腺瘤标本、5例正常乳腺标本和40例手术切除的乳腺癌标本原发病灶中MUC1、ER、PR、C-erbB-2和E-cadherin的表达情况。依据乳腺癌的侵袭性、临床分期、癌细胞分化程度、腋窝淋巴结转移情况、肿瘤直径、患者的月经状态对40例乳腺癌组织标本进行分组，通过光学显微镜观察免疫组织化学染色情况，并应用统计学方法对结果进行分析。结果：a.乳腺良性病变组织中可见MUC1阳性表达，阳性表达主要在腺腔上皮游离缘；而乳腺癌组织中的MUC1高表达，阳性表达为深棕色及棕黄色颗粒，主要表达位于胞质内。正常乳腺上皮细胞可见MUC1弱阳性表达。MUC1在乳腺癌组织的高表达与乳腺良性病变组织及乳腺正常组织的低表达之间存在显著性差异(p＜0.05)；b.粘蛋白MUC1在乳腺癌的表达与乳腺癌的类型、分期、肿瘤大小、月经状态均无显著相关性(p＞0.05)；与组织学分级、有无淋巴结转移及ER、PR有相关性(p＜0.05)；MUC1表达与c-erbB2表达有相关性且MUC1在乳腺癌组织中的表达率明显高于c-erbB2表达(p＜0.05)；c.乳腺癌原发肿瘤组织中E-cadherin表达缺失率与正常乳腺组织之间的差异非常显著(P＜0.001)。E-cadherin表达强度在乳腺癌Ⅰ～Ⅲ级之间及有无

关键词：乳腺癌粘蛋白MUC1 微转移双特异性抗体免疫治疗免疫诊断

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p120ctn-1和3亚型通过不同的机制促进肺癌细胞增殖

p120ctn-1和3亚型通过不同的机制促进肺癌细胞增殖

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作者：姜贵洋中国医科大学

学位级别：博士

在肿瘤细胞中，经典Wnt信号通路的关键因子β-catenin在细胞质中发生蓄积，进而转移入细胞核内与转录因子Lef/TCF(Lef, lymphoid enhancer factor; TCF，T-cell factor protein)结合形成转录复合体，激活包括cyclin D1等一系列Wnt下游... 详细信息

在肿瘤细胞中，经典Wnt信号通路的关键因子β-catenin在细胞质中发生蓄积，进而转移入细胞核内与转录因子Lef/TCF(Lef, lymphoid enhancer factor; TCF，T-cell factor protein)结合形成转录复合体，激活包括cyclin D1等一系列Wnt下游靶基因的转录。我们先前已经报道了p120ctn-1亚型能够上调β-catenin的表达，而p120ctn-3却不能。但有趣的是，p120ctn-1和3两种亚型均可以通过调节cycinD1进而影响细胞增殖和细胞周期的进程。有理由推测p120ctn-1是通过调节β-catenin而上调cyclin D1进而影响细胞增殖和细胞周期的。然而到目前为止，p120ctn-3亚型调节细胞增殖和周期的潜在分子机制仍不清楚。 　　我们先前的研究已经证实，在肺癌组织和肺癌细胞系中核BTB/POZ-ZF转录抑制因子Kaiso能够与p120ctn结合。尽管从理论上讲，不同p120ctn亚型均有与Kaiso结合形成复合体的能力，但每一种p120ctn亚型与Kaiso的粘附能力很可能是不同的。有意思的是，cyclin D1的启动子区恰好含有KBS序列(Kaiso-bindingsites)，Kaiso可以识别该序列并与之结合，发挥转录抑制因子的功能。因此，cyclinD1很可能是Kaiso潜在的下游靶基因之一。 　　由于Kaiso与p120ctn的结合部位—锌指结构恰恰也是Kaiso与cyclin D1启动子区KBS序列的结合部位。我们设想:p120ctn-3很可能是通过与Kaiso的结合，占据了Kaiso与KBS结合的位点，解除了Kaiso对cyclinD1的转录抑制作用，进而上调了cyclinE的表达，而影响细胞周期。为此，我们拟通过干扰p120ctn后分别恢复p120ctn-1A和3A，以及过表达和敲除Kaiso和β-catenin，探讨p120ctn-1和3亚型调控肺癌细胞增殖和周期的潜在的不同机制。并构建两种p120ctn-1和3亚型结构差异的氨基端剪切体质粒，以明确p120ctn-1和3亚型功能差异的具体分子机制。 　　材料与方法 　　一、细胞培养 　　人类肺腺癌细胞系SPC和A549购买于美国ATCC(Manassas，VA，USA)。分别在含有10％胎牛血清(GBICO Inc.，NY, USA)的RPMI1640培养基(GBICO Inc.，NY,USA)和含有10％胎牛血清的DMEM培养基(GBICO Inc.，NY, USA)中培养(37℃，5％ CO2)。 　　二、质粒构建及转染 　　 p120ctn-siRNA(由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，GeneBank＃:001331)，p120ctn-1A和p120ctn-3A(Reynold教授惠赠)，核定位质粒NLS-p120ctn-1和NLS-p120ctn-3（由大连宝生物公司构建），两个p120ctn-1氨基端剪切体质粒M1(氨基端1-55氨基酸残基缺失)和M2(氨基端56-101氨基酸残基缺失)由大连宝生物公司构建，Kaiso(Juliet ***教授惠赠)、siRNA-Kaiso（干扰序列由美国冷泉港实验室CSHL权威数据库提供，由大连宝生物公司合成）和siRNA-β-catenin、siRNA-cyclin D1和siRNA-cyclin E(Santa Cruz Biotechnology Inc,CA,USA)，以转染空质粒和未转染的细胞为对照。转染用试剂Lipofectamine2000(Invitrogen，CA,USA)或Attractene Transfection Reagent(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)，具体操作步骤按说明书进行。取各转染组细胞及未转染细胞，进行各项检测。 　　三、四甲基偶氮唑盐(tetrazolium，MTT)法检测细胞增殖 　　接种24小时后加入各种处理因素。处理后第24、48、72、96小时分别加入MTT(5mg/ml)20μl，继续孵育4小时后，每孔加入150μlDMSO溶解结晶，选择波长550nm在酶联免疫(ELISA)检测仪上测定各孔吸光度。取3次实验的平均值绘制细胞生长曲线。 　　四、流式细胞仪检测细胞周期 　　收集对数生长期细胞制成1×107个/ml细胞悬液。取1ml细胞悬液于75％冷乙醇中4℃固定过夜、离心后制成500μl的细胞悬液，加

关键词：非小细胞肺癌细胞增殖 p120ctn-3亚型分子机制生物学功能

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Mig-6在非小细胞肺癌增殖、侵袭及凋亡中的作用研究

Mig-6在非小细胞肺癌增殖、侵袭及凋亡中的作用研究

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作者：李紫璇中国医科大学

学位级别：博士

肺癌是当今世界上对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，也是临床治疗疗效最差的恶性肿瘤之一。2012年美国癌症死因统计显示肺癌的死亡率在过去的30年内上升了200％，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率近年来持续上升，2011年... 详细信息

肺癌是当今世界上对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，也是临床治疗疗效最差的恶性肿瘤之一。2012年美国癌症死因统计显示肺癌的死亡率在过去的30年内上升了200％，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率近年来持续上升，2011年卫生部统计结果显示，肺癌位居我国癌症死因的第一位。肺癌的防治是全世界共同面对的一项难题。大约有85％的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)，主要分为两种组织学类型:腺癌和鳞癌。 　　关于肺癌的病理学研究很多，目的是发现新的治疗靶点。近年来有EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)在含有EGFR突变的肺癌中使用，并取得了很好的治疗效果。 　　 Mig-6又称做RALT或Errfil最早是在对细胞周期的研究中发现的。Mig-6的表达在许多生理和病理状态下被一些因子如激素、生长因子等强烈诱导。它是EGFR通路的负向调控因子，能够通过负反馈抑制EGFR信号的激活并影响它的稳定性。它在人体分布广泛，与多种肿瘤的发生有密切关系。 　　但是，Mig-6在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素的关系并未见文献报道，Mig-6的变化影响肺癌细胞生物学功能及其作用机制也未有研究。为了明确以上问题，我们检测了NSCLC中Mig-6的表达情况，分析了Mig-6表达与临床病理因素的关系，通过干扰肺癌细胞系H1299和BE1中Mig-6基因的表达，探讨了Mig-6对肺癌细胞侵袭、增殖能力的影响及其相关机制。 　　材料和方法： 　　 1、患者及标本 　　这项研究在中国医科大学伦理委员会的批准下进行。来自2008-20101年在中国医科大学附属第一医院手术的病人，组织经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋。这些患者在手术前均未接受放化疗。组织学诊断和分化程度根据WHO分类标准进行判定，按国际抗癌联盟的肺癌P-TNM分期标准. 　　 2、免疫组织化学染色 　　将石蜡包埋的肺癌组织块切成4μm厚切片，癌旁的正常支气管上皮作为阴性对照。使用即用型非生物素免疫组化EliVisionTMplus检测试剂盒.结果判定:两位病理医生对切片分别作出判定，每张片子随机选五个高倍镜视野。 　　 3、细胞培养 　　肺癌细胞系H1299，A549，H157购自ATCC，BE1来自郑洁教授的惠赠。细胞使用RPMI1640培养基含10％的灭活小牛血清.37℃、5％CO2的条件下培养，每两天换一次液，并用0.25％的胰酶进行传代。 　　 4、EGFR突变分析 　　 75例石蜡包埋的肺癌标本用于EGFR突变检测，原发肺癌组织均来自2009-2011年在中国医科大学附属第一医院手术的病人. 　　 5、小干扰RNA实验 　　转染前24h将细胞按50％密度接种于24孔板，Mig-6的特异性siRNA及阴阳性对照均购自上海吉玛公司，采用DharmaFECT1转染试剂进行转染，转然后48h使用PCR和Western blot检测干扰效率。 　　 6、real-time PCR(SYBR Green method) 　　对于新鲜培养的细胞或新鲜肺癌组织采用RNeasy plus Mini kit提取总RNA.使用SYBR Green PCR master mix进行定量real-time PCR扩增，总体积20μl。使用7900HT实时定量PCR仪。 　　 7、Westem blot法检测蛋白表达 　　收集细胞并加入裂解液充分裂解，提取上清为总蛋白。凝胶电泳、转印、室温封闭抗体4℃孵育过夜。二抗室温孵育2h显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集进行灰度测定。 　　 8、细胞增殖能力实验 　　使用Cell Counting Kit-8(R) solution(Dojindo，Gaithersburg，MD)检测细胞的增殖能力. 　　 9、细胞侵袭能力检测 　　使用24孔Transwell小室，孔径8μm(Costar)进行细胞侵袭能力检测随机选取10个高倍镜视野取平均值。每个实验组重复三次实验。 　　 10、数据分析 　　采用SPSS16.0统计软件分析。 　　结果： 　　 1、Mig-6蛋白表达的临床意义 　　我们用免疫组化的方法检

关键词：丝裂原诱导基因6 非小细胞肺癌信号转导细胞侵袭增殖能力临床病理

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重组人5型腺病毒联合RNA干扰治疗恶性肿瘤的研究

重组人5型腺病毒联合RNA干扰治疗恶性肿瘤的研究

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华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会

作者：王丽钱关祥葛盛芳上海交通大学医学院生物化学和分子生物学教研室

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的多发性疾病。采用肿瘤增殖腺病毒治疗是近十年来兴起的一种肿瘤基因治疗的新策略,其中重组人5型腺病毒(H101)是基因治疗肿瘤的典型代表:H101可选择性地在p53异常的肿瘤细胞中增殖,进而特异性地裂解肿... 详细信息

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的多发性疾病。采用肿瘤增殖腺病毒治疗是近十年来兴起的一种肿瘤基因治疗的新策略,其中重组人5型腺病毒(H101)是基因治疗肿瘤的典型代表:H101可选择性地在p53异常的肿瘤细胞中增殖,进而特异性地裂解肿瘤细胞而几

关键词： Notchl 治疗组联合应用抑制作用恶性肿瘤 RNA

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