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1 篇 哲学
- 1 篇 哲学

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7 篇 rna干扰
7 篇 肿瘤
6 篇 细胞周期
6 篇 凋亡
6 篇 网络药理学
6 篇 预后
6 篇 增殖
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5 篇 白血病
5 篇 前列腺癌
5 篇 动物模型
5 篇 基因表达
5 篇 基因突变

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23 篇 河北医科大学
17 篇 上海第二医科大学
11 篇 大连医科大学
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7 篇 上海医科大学
7 篇 广西医科大学
5 篇 中国协和医科大学
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4 篇 重庆医科大学
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3 篇 广州医科大学
3 篇 第二军医大学长海...
3 篇 福建医科大学
3 篇 复旦大学
3 篇 长海医院
3 篇 山西医科大学

作者

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4 篇 赵涵芳
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3 篇 蔡在龙
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3 篇 刘玉环
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2 篇 古航
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排序：

高血压基因组扫描及去甲肾上腺素转运蛋白、缓激肽β2受体基因多态性与高血压关系的研究

高血压基因组扫描及去甲肾上腺素转运蛋白、缓激肽β2受体基因多...

引用

作者：李莹中国医科大学

学位级别：博士

背景和目的：　　高血压是严重危害人类健康的常见复杂疾病之一，已成为世界范围的重要的公共卫生问题。在我国其发病率高、致残率高、致死率也高，是脑卒中、冠心病的危险因素。目前认为，高血压是多种遗传因素和环境因素以及基因-基... 详细信息

背景和目的：　　高血压是严重危害人类健康的常见复杂疾病之一，已成为世界范围的重要的公共卫生问题。在我国其发病率高、致残率高、致死率也高，是脑卒中、冠心病的危险因素。目前认为，高血压是多种遗传因素和环境因素以及基因-基因间，基因-环境间相互作用的结果，具有遗传异质性，延迟显性及种族差异等特征。研究表明血压变异的30％-50%受到遗传因素的影响[1]，而这些遗传因素包括多个基因的作用，每个基因的作用可能是微效的。如果能对高血压相关基因多态性与高血压的相关性进行研究，确定与高血压相关的位点，就可以通过基因分子生物学等方法对高血压及其相关疾病采取早预防早诊断和早治疗等措施，对患者、患者家庭及社会都具有极重要的意义。　　一般认为微效基因作用模式在原发性高血压(EH)的遗传机制中起主要作用，即来自多个位点的大多数风险等位基因在群体中的发生频率都很低，它们之间通过数量性状的剂量-效应关系进行相互作用，达到疾病发生的临界阈值，共同决定EH的遗传易感性。目前对高血压遗传研究尚无既定的方法模式，其中主要的几种策略如候选基因克隆、定位候选基因克隆与全基因组扫描、中间表型、动物模型及比较基因组学等。　　 EH相关的基因多存在于肾素-血管紧张素.醛固酮系统(RAAS)、交感神经系统、内皮系统和某些信号通路等系统中。交感神经反应性增强与高血压的形成密切相关。交感神经系统基因多态性与高血压的关系成为研究的热点之一。激肽释放酶-激肽系统(KKS)是机体重要的调节系统，广泛地存在于许多组织和器官中，参与多种生理和病理生理过程，如心血管、肾脏和神经系统的功能调节，平滑肌收缩、葡萄糖代谢、细胞增殖、炎症与疼痛及休克过程等。近年来特别是在心血管方面的研究进展很快，许多临床研究和基础实验已证实KKS具有强大的心血管保护作用，如调节血压、抑制心肌肥厚的形成、减少缺血再灌注损伤和参与缺血预适应形成。KKS对于增加肾血流及Na+排出具有十分重要的意义。本实验通过全基因组扫描筛查原发性高血压的相关基因位点，并对交感神经系统的去甲肾上腺素转运蛋白基因及激肽释放酶.激肽系统的缓激肽β2受体基因多态位点与高血压的关系进行分析，为高血压的发病机制研究提供线索。　　研究方法：　　 1、高血压家系及对照组的采集、流行病学问卷调查　　在辽宁省阜新地区筛选两代或三代以上有高血压的家系，在家系中选择高血压患者(SBP≥140mmHg和/或DBP≥90mmHg，或两周内服降压药者)作为家系高血压组(n=850);在阜新地区收集年龄≥55岁，血压<140/90mmHg的非家系非高血压健康人群作为对照组(n=380)，对两组人群进行流行病学问卷调查。　　 2、体格检查　　对收集的研究对象进行血压、身高、体重、腹围的测量。　　 3、采外周血行实验室检查及DNA提取　　对研究对象行外周血的采集，黄色生化管进行血液生化检查，紫色抗凝管行基因组DNA的提取。　　 4、DNA浓度测定及DNA混合池构建　　用nano-drop分光光度仪对已提取的DNA进行浓度测定，每份样本分别抽取100ng，在高血压组(可用样本740份)和非家系非高血压组(可用样本361份)分别构建DNA混合池14个。　　 5、全基因组扫描　　采用Affymetrix SNP6.0芯片(上海晶泰生物技术有限公司)对DNA混合样本行全基因组扫描，定位SNP位点。　　 6、目的基因多态性分析　　用聚合酶链式反应(PCR)，Sanger测序等方法对Affymetrix SNP6.0芯片不包含的四个位点，即交感神经系统的去甲肾上腺素转运蛋白基因的rs1805067和rs2397771两个SNP位点多态性及激肽释放酶.激肽系统的缓激肽β2受体基因的rs1799722和rs1046248两个SNP位点多态性进行测定，研究其与EH的关系。　　实验结果：　　 1、高血压组收缩压、舒张压、体重指数、血肌酐和饮酒百分率高于对照组，年龄低于对照组，差异有显著性;高血压组总蛋白、白蛋白、TC、HDL-C、LDL-C、TG、FPG和吸烟百分率均与对照组无显著性差异。　　 2、高血压组和对照组间有两个位点rs4540261和rs9625367有显著性差异P<10-5。　　 3、去甲肾上腺转运蛋白基因rs1805067和rs2397771两个位点经PCR扩增后电泳产物分别为640bp和437bp的目的基因片段。rs1805067(A/G)多态性在高血压组G占100%，A占0%，在对照组G占100%，A占0%，两组间没有差异(P>0.05)。rs2397771(C/G)多态性在高血压组G占46.30%，C占53.70%，在对照组G占61.19%，C占39.81%，两组间有显著性差异(P<0.05)。　　 4、缓激

关键词：原发性高血压全基因组扫描去甲肾上腺素转运蛋白基因缓激肽β2受体基因多态性发病机制

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DMBA诱导SD大鼠胰腺癌发生发展过程中的机理研究

DMBA诱导SD大鼠胰腺癌发生发展过程中的机理研究

引用

作者：杨盈赤中国协和医科大学

学位级别：博士

目的：胰腺癌的发病率逐年上升,其致死率已经位居消化道恶性肿瘤的第二位。胰腺癌早期诊断非常困难,治疗效果及预后极差,根本原因在于目前对其细胞起源、发生和发展等机制尚不清楚。在本实验室的前期研究,诱导建立的大鼠胰腺癌模型是接... 详细信息

目的：胰腺癌的发病率逐年上升,其致死率已经位居消化道恶性肿瘤的第二位。胰腺癌早期诊断非常困难,治疗效果及预后极差,根本原因在于目前对其细胞起源、发生和发展等机制尚不清楚。在本实验室的前期研究,诱导建立的大鼠胰腺癌模型是接近人胰腺导管腺癌的体内模型,通过观察其胰腺癌发生过程的形态及组织学变化,为认识胰腺癌细胞起源提供了最新的实验证据。但为了进一步探讨胰腺癌发生和发展过程的细胞分子生物学调控机制,本课题拟在诱导大鼠胰腺癌模型过程中,收集不同时间点组织标本,通过基因芯片技术探讨胰腺癌形成和发展过程中相关基因表达调控的动态改变,以期能从细胞分子生物学水平阐明胰腺癌细胞发生和发展机制,并可以为胰腺癌的早期诊断和基因治疗提供新的线索。方法： 1.通过化学致癌剂二甲基苯并蒽(DMBA)胰腺原位包埋诱导建立SD大鼠胰腺癌动物模型。 2.利用Affymetrix大鼠全基因组表达谱芯片(Genechip Rat Expression Set 230)对胰腺癌大鼠动物建模过程中的各时间点的胰腺组织进行检测,初步筛选其差异表达基因。 3.应用Genespring软件对差异表达基因进行功能分析,根据Gene Ontology (GO)对所筛选出的差异表达基因进行分子功能及生物学过程的分类,并根据其基因表达的模式运用层次聚类分析的方法进行分析。按照固定顺序对差异表达基因进行自组织映射(SOM)聚类分析。 4.应用Mann-Kendall单调趋势检验分析基因芯片检测原始数据,并通过将人类全基因组和大鼠全基因组进行对比,筛查胰腺癌大鼠动物建模过程中的各时间点的人鼠同源的差异表达基因。 5.分别采用荧光实时定量PCR技术及免疫组织化学染色方法对芯片检测结果中经过分析确定的有重要意义的基因进行：mRNA及蛋白表达水平的验证,以确定芯片检测结果的可靠性。结果： 1.采用5mg剂量的二甲基苯并蒽(DMBA)直接置入胰腺被膜下的实质内的方法成功诱导大鼠胰腺癌发生,成癌率高,非实验性意外死亡率低。DMBA实验组术后1个月癌发生率达到80%(12／15)并伴有2例高级别]PanIN。DMBA实验组术后3个月大鼠癌发生率为100%(14／14),死亡率仅为6%(1／15)。 2.基因芯片技术对比检测正常胰腺、DMBA实验组7天、2周、1月和3月组间基因总体表达水平的改变情况。在所检测的22000个转录本中,共有661条基因在5组中表达差异均有统计学意义(P<0.05),经组间两两比较显示,随着差异倍数的增加,差异基因的数目随之减少。 3.根据GO分类,所筛选出的661条差异表达基因涉及不同的分子功能分类,并参与了多个生物学过程。根据差异表达基因表达谱的相似性,通过双向层次聚类分析,能从基因表达谱上完全区分开正常胰腺、急慢性胰腺炎、Pan IN和早期及进展期胰腺癌五组样本。其中正常胰腺和进展期胰腺癌的分叉最远,说明相似度最低,提示这些差异表达基因与胰腺癌发生之间有非常高的相关性。 4.只保留25%样本表达量超过100个荧光单位且在所有样本范围内IQR超过0.5的2,786个探针。进行Mann-Kendall单调趋势检验,获得上调基因(探针)11个,下调基因(探针)142个(P<0.05)。成功筛查出了胰腺癌大鼠动物建模过程中的各时间点的人鼠同源的差异表达基因。 5.采用荧光实时定量PCR技术及免疫组织化学染色方法对CXCR7、ATP6vlg2和UBe2c分别进行了mRNA及蛋白水平的验证,显示实时定量PCR的结果与芯片结果具有良好的一致性,蛋白表达水平也与芯片检测结果基本一致。进一步证实了本研究中基因芯片检测数据及分析的可靠性。结论： 1.可在短期内获得较高发生率的大鼠胰腺癌模型从而获得胰腺癌发生过程中不同时期的大鼠胰腺癌组织标本,使动态研究胰腺癌发生发展过程中细胞分子生物学的调控机理成为可能。 2.应用大鼠全基因组的表达谱芯片,高通量、动态地筛选出胰腺癌发生及发展过程中差异表达的基因。 3.结合胰腺癌大鼠动物模型建模过程中不同时间点的病理状态,通过对部分已知基因表达相关功能的分析,发现胰腺癌发生中涉及到炎症反应、趋化因子、细胞应激反应的增加及抗氧化损伤能力的增强、肿瘤细胞凋亡的抑制、调控增殖与生长抑制的信号途径的失衡、细胞周期及有丝分裂的紊乱以及细胞骨架结构变化等众多遗传学改变,并且这些改变在胰腺癌发生发展过程的不同时段有不同的特点,其共同作用的结果可能与胰腺癌发生密切相关。 4.筛查了大鼠胰腺癌发生和发展过程中动态的基因表达差异。并通过Blast对比成功筛查出了胰腺癌大鼠动物建模过程中的

关键词：胰腺癌动物模型基因芯片差异表达基因聚类分析实时定量PCR

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RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达对5-FU诱导大肠癌细胞凋亡的影响

RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达对5-FU诱导大肠癌细胞凋亡的影响

引用

作者：杨慧南方医科大学

学位级别：硕士

大肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界不同地区差异很大,以北美、大洋州最高,欧洲居中,亚非地区较低。我国南方,特别是东南沿海明显高于北方,发病率仅次于胃癌、食管癌。近20多年来,世界上... 详细信息

大肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界不同地区差异很大,以北美、大洋州最高,欧洲居中,亚非地区较低。我国南方,特别是东南沿海明显高于北方,发病率仅次于胃癌、食管癌。近20多年来,世界上多数国家大肠癌发病率呈上升趋势,据调查统计,世界上大肠癌的发病率正以每年2%的速度上升,在我国随着经济的进步,生活方式和饮食结构的变化,尤其是高脂肪、高蛋白、高热量、低纤维素的饮食,我国的大肠癌发病率每年也快速递增,特别是大城市上升趋势更为显著,据上海的调查显示,我国大肠癌发病率的增速是世界平均水平的两倍,达到年均增加4%。然而,大肠癌的治疗效果并不理想,大肠癌传统治疗方法,即外科手术治疗、放射治疗和化学药物治疗方法的不断发展和完善,在延长患者生存期和提高患者生存质量方面取得了长足的进步；但是手术和放疗是局部治疗,难以控制肿瘤的复发和转移,化疗虽为全身性治疗,但组织选择性和特异性差,毒副作用明显。FOLFOX方案是国内外认可的大肠癌化疗方案,其中临床最为常用的是“5-氟尿嘧啶+亚叶酸钙+铂类”,但近年来临床上频有报道大肠癌对5-FU的耐药现象,为了保证治疗效果,临床多推荐使用多种化疗药物联合,但化疗药物缺乏组织选择性和特异性,对骨髓等高代谢正常人体重要器官和组织产生严重的毒副作用,反而不仅影响了患者的生存质量,还增加了患者精神压力和经济负担。因此,探寻大肠上皮细胞癌变、演化和转移的机制,早期发现和干预大肠癌的生物学进程,以及增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,从而减轻化疗药物带来的副作用,对大肠癌的治疗具有重要的意义。近年来,3-磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和AKT通路逐渐引起了人们的关注。PI3K-AKT信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一,参与增值、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。3-磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)家族成员属于原癌基因,是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶,已发现三种PI3K同工酶。近年来发现,IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶(PI3K/Akt信号通路)与肿瘤的发生发展密切相关,该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、粘附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。在PI3K家族中,研究最广泛的是能被细胞表面受体所激活的IA型PI3K,哺乳动物细胞中IA型PI3K从酪氨酸激酶连接受体传递信号,IA型PI3K是由p85α/β/γ(调节亚基)和p110α/β/δ/γ(催化亚基)组成的异二聚体,研究表明,PI3K/Akt通路中的组成成分广泛的人类肿癌普中表达失调,特别是PI3K的调节亚基p85α在现有的研究中均显示出其在大肠癌细胞中突变的比率较高,本课题组已通过免疫组化方法证实了在正常肠粘膜组织、大肠息肉、大肠腺瘤、大肠癌组织中p85α表达呈上升趋势,PI3K p85α的表达水平与大肠癌的演进成显著正相关关系,并且相关关系非常密切,提示PI3K p85α在大肠癌演化过程中可能起重要作用,而且还进一步证实PI3K p85α表达水平和大肠癌的恶性程度有关,PI3K p85α的表达水平与大肠癌的Dukes分期成显著正相关关系。PI3K通过两种方式激活,一种是通过调节亚基p85α与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用,引起二聚体构象改变而被激活；另一种是通过Ras和p110直接结合导致PI3K的活化。PI3K激活的结果是在质膜上产生第二信使PIP3,PIP3作为一种配体把含有PH结构域的蛋白聚集到细胞膜上,使它们被膜上激酶磷酸化,激活的蛋白可以引起下游的信号转导通路。在PIP3作用的众多底物中,最引人关注的是AKT,即细胞内反转录病毒v-AKT的同源物。AKT作为蛋白激酶,它对细胞生存机制和抗凋亡的调控是通过对一系列底物的磷酸化而完成的。AKT能直接磷酸化多种转录因子,通过调控这些转录因子可以抑制凋亡基因的表达和增强抗凋亡基因的表达,从而促进细胞的存活。前者的一个典型例子是转录因子Forkhead蛋白家族。它的三个成员FoxO1、FKHRL1和AFX都含有保守的AKT磷酸化序列,在体外能迅速被AKT磷酸化。AKT是通过改变Forkhead蛋白在细胞内的定位来起作用的。AKT激活时,磷酸化Forkhead蛋白使其发生细胞核内到细胞核外转位,磷酸化的Forkhead蛋白能抑制促凋亡基因的转录功能,Forkhead蛋白的靶基因包括FasL、TRAIL和Bcl-6、Bim、Bax,从而负调控凋亡信号,促进细胞存活,甚至发生恶变。目前,通过基因干预方法敲除或小分子药

关键词： PI3K p85α 大肠癌细胞蛋白 hoechst33258染色 JC-1 线粒体膜电位

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RNAi干扰HPV16 E6基因对宫颈癌Siha细胞的影响

RNAi干扰HPV16 E6基因对宫颈癌Siha细胞的影响

引用

作者：欧阳云雁南方医科大学

学位级别：硕士

子宫颈癌是威胁妇女健康的第二大恶性肿瘤。近年来发病率不断上升,尤其是在发展中国家。每年大约有46万新发病例,大约27.4万患者死于子宫颈癌,且发病有年轻化趋势。子宫颈癌的发生是一个由癌前病变逐渐衍变为癌的长期、连续的病理过程,... 详细信息

子宫颈癌是威胁妇女健康的第二大恶性肿瘤。近年来发病率不断上升,尤其是在发展中国家。每年大约有46万新发病例,大约27.4万患者死于子宫颈癌,且发病有年轻化趋势。子宫颈癌的发生是一个由癌前病变逐渐衍变为癌的长期、连续的病理过程,目前流行病学和实验室研究数据均显示HPV感染是子宫颈癌的主要致病因素,尤其是高危型HPV感染与子宫颈癌高度相关。HPV16型是高危型人类乳头瘤病毒中最常见的类型之一,其早期蛋白E6及E7在宫颈鳞状上皮细胞恶性转化及恶性表型维持中均扮演着非常重要的角色。E6蛋白可与细胞内的E6相关蛋白(E6AP)形成E6/E6AP复合体,并与P53蛋白结合,E6AP将活化的泛素连接到P53蛋白,通过泛素介导的泛素途径使P53蛋白降解;E7与生长抑制蛋白pRB结合,使pRB蛋白磷酸化,释放转录因子E2F,使感染细胞得以实现基因转录、增殖。抑癌基因P53、pRB的下调,可激活端粒酶,阻断干扰素的产生,增加外源DNA的整合及突变,抵抗细胞凋亡,最终导致癌变。RNA干扰(RNA interference,RANi)技术是近年来新发展的一项以一个特异的mRNA降解为目标的基因沉默技术,RNAi不仅具有更高的基因特异性,而且抑制效率及抑制稳定性均比核酶或反义核酸要高。我们采用RNAi技术沉默宫颈癌Siha细胞株中HPV16 E6基因的表达,以观察HPV16 E6沉默后对宫颈癌Siha细胞的生长及细胞凋亡的影响,为探索高危型人类乳头瘤病毒导致宫颈癌发生的机制研究提供新的理论依据,以期为宫颈癌的基因治疗寻找新的思路。　　目的:　　利用RNA干扰(RNAi)技术,使用基因特异性的靶向于HPV16 E6基因的小干扰RNA(SiRNA)作用于HPV16 E6阳性的宫颈癌细胞株SiHa,沉默宫颈癌Siha细胞的HPV16 E6基因,通过检测干扰组与未干扰组之间HPV16 E6 mRNA及蛋白的变化、抑癌蛋白P53的变化,以及各组之间Siha细胞凋亡率的改变,探讨HPV16 E6 SiRNA对HPV16阳性SiHa细胞E6基因的特异性抑制作用,以及对细胞凋亡的影响,为探索高危型人类乳头瘤病毒导致宫颈癌发生的机制研究提供新的理论依据,为使用RNAi技术治疗宫颈癌的可行性提供实验基础。　　方法:　　 (1)SiRNA序列的构建:根据SiRNA的设计原则和GenBank中HPV16 E6cDNA序列,应用Ambion公司的在线设计软件,分别在其序列不同位点针对HPV16 E6设计两对DNA片段,并分别连接至pSilencerTM 3.1-H1 hygro,构建两对小干扰RNA:SiRNA-109(S Ⅰ)及SiRNA-142(S Ⅱ),以及通用阴性对照NC(NegativeControl)和阳性对照SiRNA:GAPDH(Human GAPDH)SiRNA,均带荧光标记绿色荧光蛋白(FAM)。测序结果显示构建的两对SiRNA序列与设计的DNA序列完全一致。由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。　　 (2)细胞培养与转染:SiHa细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养,培养条件为37℃、5％CO2。于转染前24d'时铺至6孔板,培养至细胞30-50％融合时使用LipofectamineTM2000脂质体转染。实验分5个组:空白对照组(未转染组)、脂质体组(LIPO对照组)、阴性对照SiRNA转染组(NC转染组)、SiRNA-109转染组(SⅠ转染组)、SiRNA-142转染组(S Ⅱ转染组)。以脂质体6μl:SiRNA100pmol比例进行转染,按照转染试剂盒说明书操作,于OPTI MEMI中培养6小时后换完全培养基。　　 (3)RT-PCR检测HPV16 E6基因表达:以GAPDH做为内参,由上海生工生物技术服务公司合成引物,参照TAKARA逆转录试剂盒要求的条件进行反转录。PCR反应条件:预变性94℃ 3min,94℃ 30s,58℃ 45s,72℃ 45s,32个循环,72℃1min。取反应产物行琼脂糖凝胶电泳,观察目的条带、摄片并应用灰度分析软件分析。　　 (4)Western Blot检测蛋白表达:于转染后48h收获各组细胞各约1×106个,蛋白裂解液裂解蛋白,变性,10％SDS-PAGE电泳,湿法转印PVDF膜,TBST漂洗后,5％脱脂奶粉封闭,分别与P53、HPV16 E6及GAPDH一抗、二抗孵育,ECL显色,应用灰度分析软件分析。　　 (5)流式细胞仪检测细胞凋亡:于转染后48 h,各组细胞分别消化、离心收集。PBS洗涤细胞后,加入annexin V孵育30min,加PI至终浓度为50mg/L,用流式细胞仪检测。　　 (6)统计学分析:采用SPSS13.0软件统计分析,服从正态分布的计量资料采用均数±标准差((x)±

关键词：宫颈癌 Siha细胞人类乳头瘤病毒 E6基因小干扰RNA

来源：评论

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GnT-V RNAi对人前列腺癌PC-3细胞侵袭和增殖能力的影响

GnT-V RNAi对人前列腺癌PC-3细胞侵袭和增殖能力的影响

引用

作者：王炳卫南方医科大学

学位级别：硕士

[课题背景] 前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是男性生殖系统最为常见的恶性肿瘤,其发病率为欧美国家男性恶性肿瘤的第1位和死亡率第2位。我国PCa的发病率虽低于欧美国家,但随着生活方式改变、人口老龄化及前列腺特异性抗原(PSA)广泛应... 详细信息

[课题背景] 前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是男性生殖系统最为常见的恶性肿瘤,其发病率为欧美国家男性恶性肿瘤的第1位和死亡率第2位。我国PCa的发病率虽低于欧美国家,但随着生活方式改变、人口老龄化及前列腺特异性抗原(PSA)广泛应用于筛查,近年来,PCa的发病率呈明显上升趋势。国内一项PSA筛查研究发现,50岁以上男性的前列腺癌发病率为0.78%,提示中国的前列腺癌实际发病率并不低。因此,寻找前列腺癌有效治疗方法已成为一个急待解决的世界性公共卫生问题。生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。N-糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤,在肿瘤细胞中,复杂糖链的结构发生异常改变,且这种变化与肿瘤侵袭转移密切相关。N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V (N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)是一个与肿瘤及肿瘤转移相关的酶,研究表明GnT-V在很多恶性肿瘤中增多,其产物GIcNAcβ1,6Manαl,6结构有利于外链的延伸,已发现该结构与细胞的恶性转化和肿瘤的转移有密切关系。基因治疗是一种有前景的肿瘤治疗手段,RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年来迅速发展起来的一项新的基因功能研究手段,它是利用与靶基因同源的小片段双链RNA(dsRNA),即：siRNA,转染靶细胞,促进靶基因mRNA降解,从而特异性诱导转录后基因沉默。将siRNA所对应的模板DNA双链序列克隆入质粒转染细胞,DNA模板在细胞内转录成小片段发夹状]RNA (shRNA),与化学合成的小干扰RNA (siRNA)具有相同的基因封闭作用,但作用时间可长达2个月,因其特异性和高效性成为当前肿瘤基因治疗的热点。本实验利用RNAi原理和技术,针对前列腺癌中高表达基因GnT-V的shRNA表达质粒,将其转染高转移潜能的人前列腺癌PC-3细胞,观察RNAi对GnT-V基因表达的抑制效应,寻找抑制效率较高的RNAi片段,为寻找有效治疗前列腺癌分子靶向研究中新靶点提供实验依据。 [实验方法] 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA质粒的构建及鉴定 (1) GnT-V siRNA序列的设计：根据NCBI数据库中GnT-V基因已知序列(NM02410.3)和siRNA设计原则,设计针对GnT-VcDNA的RNA片段,其序列为：GnT-V/1079 sense’GGAAGTGCATGCAACTGTTTA 3’;经Blast检索确认与GnT-V以外的人类已知基因序列无同源性。将其中一对的序列打乱排列,通过Blast分析无同源性超过70%的序列,作为阴性对照干扰序列,序列为：GnT-V/NC sense5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3’。由上海吉玛公司采用化学合成方法合成上述siRNA。 (2)shRNA转录模板DNA的设计：根据前面设计的siRNA序列,设计模板DNA链,其顺序分别为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9nt loop连接序列、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子(6个T)、BamHⅠ酶切位点。 (3)质粒pGPU6/GFP/Neo GnT-V的构建及鉴定：先将各组2条模板单链退火处理,再与双酶切后的pGPU6/GFP/Neo质粒连接,构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素抗性克隆,利用限制性内切酶BbsⅠ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。大量扩增摇菌后,抽提质粒纯化。 2、细胞培养与转染人前列腺癌细胞株PC-3在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,37℃、5%CO2湿度下培养,每周传代2～3次。PC-3细胞培养至对数生长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000TM产品说明书,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入PC-3细胞。 3、干扰效果检测 (1)半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测GnT-V mRNA表达转染成功后,继续培养PC-3细胞48h后,收集细胞,经Trizo1一步法提取总RNA,采用AMV逆转录合成cDNA,进行PCR反应。GnT-V上游引物为5’AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC3’,下游引物为5’TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3’,产物长度为555bp。PCR反应条件：94℃预变性5min,94℃变性30s,40℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环;最后72℃再延伸10min.以β-actin为内参,上游引物为5’GAMCTACCTTCAACTCCATC3’下游引物为5’CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3’,产物长度为219 bp。以扩增产物3μl在2%琼脂糖凝胶中

关键词： GnT-V RNAi 前列腺癌侵袭能力实验研究

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室旁核CuZnSOD过表达抑制心肌梗死大鼠交感神经活动和改善心功能

室旁核CuZnSOD过表达抑制心肌梗死大鼠交感神经活动和改善心功能

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作者：高娟南京医科大学

学位级别：硕士

背景慢性心力衰竭(CHF)是严重危害人类健康的常见病。过度激活的交感神经活动是CHF的重要特征,在CHF的病程进展中起重要作用。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是心血管活动整合的重要中枢之一,在交感神经活动调控中起重要作... 详细信息

背景慢性心力衰竭(CHF)是严重危害人类健康的常见病。过度激活的交感神经活动是CHF的重要特征,在CHF的病程进展中起重要作用。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是心血管活动整合的重要中枢之一,在交感神经活动调控中起重要作用。本实验室既往研究表明PVN中血管紧张素Ⅱ(Ang II)与CHF大鼠过度增强的交感神经活动密切相关,PVN内NAD(P)H氧化酶来源的活性氧,尤其是超氧阴离子和过氧化氢都参与了Ang II对交感神经活动的调节作用。铜锌过氧化物歧化酶(CuZnSOD),是一种胞浆内的抗氧化同工酶,能够清除超氧阴离子。CHF大鼠长期口服SOD拟似剂tempol可降低交感神经活动,但是否因为长期清除PVN中的超氧阴离子引起的CHF大鼠的交感神经活动降低和心功能改善尚不清楚。由于CuZnSOD本身存在半衰期短、代谢快的特点,给长期PVN中清除超氧阴离子制造了瓶颈。随着分子生物学的发展,基因治疗作为传统药物治疗外的新治疗手段显示出广阔的前景,重组腺病毒载体携带目的基因的蛋白过表达技术日益成熟。PVN中腺病毒转染CuZnSOD基因,能够长期降低PVN中超氧阴离子水平,为在中枢水平探讨CHF的基因治疗奠定理论和实验基础,开辟新途径。目的 1.观察PVN内微量注射携带人类CuZnSOD基因的腺病毒载体(Ad-SOD),能否降低PVN中超氧阴离子浓度。 2.探讨降低PVN中超氧阴离子浓度能否使心肌梗死导致的CHF大鼠过度增强的交感神经活动恢复正常。 3.探讨降低PVN中超氧阴离子浓度能否改善CHF大鼠心肌重构和心功能。方法和结果 SD大鼠随机分为冠状动脉结扎(CAL)致心肌梗死(MI)组和假手术(Sham)组,各组再随机分为双侧PVN内微量注射携带CuZnSOD基因的腺病毒载体组(Ad-SOD)组和空载体组(Ad-null)组。冠状动脉结扎术或假手术后,将Ad-SOD和Ad-null立即微量注射入PVN。术后8周,通过Western Blotting检测PVN内CuZnSOD的表达,紫外分光光度法测定CuZnSOD的活性,化学发光法测定超氧阴离子水平;测定基础交感神经活动(RSNA),用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆去甲肾上腺素(NE)的浓度,以心室表面应用辣椒素引起的肾交感神经活动变化评价心交感传入反射(CSAR);以心肌组织切片的苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson's三重染色、TUNEL染色评价心肌重构;用超声心动图和左心室血流动力学方法测定心功能。结果如下: ***蛋白表达水平、CuZnSOD活性和超氧阴离子水平MI-null组大鼠PVN内CuZnSOD蛋白表达水平和活性均显著低于Sham-null组,而超氧阴离子显著升高。CuZnSOD过表达组大鼠PVN内CuZnSOD蛋白表达和活性水平显著提高,并且降低超氧阴离子水平。 2.基础交感神经活动和血浆NE水平 MI组大鼠的基础RSNA和血浆NE水平均比Sham组大鼠高,PVN中CuZnSOD过表达可以抑制基础RSNA的升高,并使血浆NE浓度降至正常水平。 *** 和Sham组大鼠相比,MI组大鼠引起CSAR显著增强。CuZnSOD过表达可以减弱MI大鼠显著增强的CSAR。 4.组织重量和疤痕 MI组大鼠心脏/体重比值和湿肺/体重比值升高,心室前壁有较大的心肌梗死疤痕。PVN内CuZnSOD过表达可以降低心脏/体重比值和湿肺/体重比值,但并未减小疤痕面积。 5.心肌切片HE染色、Masson's三重染色、TUNEL染色在HE染色的心肌切片上观察到MI大鼠心肌细胞肥大,而CuZnSOD过表达明显减小了梗死周边区和非梗死区心肌细胞直径;Masson's三重染色的心肌切片上观察到MI大鼠有明显的胶原沉积,而CuZnSOD过表达明显改善MI后梗死周边区的胶原沉积;TUNEL染色的心肌切片上中观察到MI大鼠心肌细胞凋亡增多,而CuZnSOD过表达显著降低梗死周边区的TUNEL阳性细胞比例,但是并未改善非梗死区的心肌细胞凋亡。 6.超声心动图和Sham-null组大鼠相比,MI组大鼠左室舒张末期容积(LVEDV)和左室收缩末期容积(LVESV)增大,短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)的降低。PVN的CuZnSOD过表达显著改善LVEDV、LVESV增大和FS、EF降低。 7.左心室血流动力学 MI-null组大鼠左室舒张末期压力(LVEDP)显著升高而左心室内压最大上升速率(LVdP/dtmax)显著降低。CuZnSOD过表达显著改善MI引起的LVEDP升高和LV

关键词：慢性心力衰竭过氧化物歧化酶室旁核交感神经活动基因过表达

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鼻咽癌细胞株可能相关瘤基因/抑瘤基因的初步筛选和PTHLH的过表达研究

鼻咽癌细胞株可能相关瘤基因/抑瘤基因的初步筛选和PTHLH的过表达...

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作者：樊英南方医科大学

学位级别：硕士

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种上皮源性恶性肿瘤,绝大多数属于低分化鳞状细胞癌,恶性程度高,早期易发生淋巴结和全身远处转移,具有相当高的死亡率。鼻咽癌的地区分布极不均衡,在我国南方及东南亚一带发病率较高,其中又... 详细信息

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种上皮源性恶性肿瘤,绝大多数属于低分化鳞状细胞癌,恶性程度高,早期易发生淋巴结和全身远处转移,具有相当高的死亡率。鼻咽癌的地区分布极不均衡,在我国南方及东南亚一带发病率较高,其中又以广东省的发病率最高,故有“广东瘤”之称。目前认为遗传因素、EBV(Epstein-Barr Virus)感染、遗传易感性、饮食和某些环境化学促癌物和／或致癌物因素与鼻咽癌的发生发展密切相关,在这些因素的共同作用下,正常鼻咽上皮细胞发生遗传和表观遗传学改变不断积累,最终引起细胞的恶性转化,导致鼻咽癌的发生。但NPC的发病机制尚不清楚。肿瘤的发生发展是一个多因素参与、多基因改变、多步骤演进的复杂过程,受到体内、外各种因素的作用和影响,是许多肿瘤瘤基因激活或肿瘤抑制基因失活所致。瘤基因是由于存在正常细胞中的原瘤基因在某些致瘤因素作用下激活而成,瘤基因的活化是人类肿瘤发生发展的重要因素,瘤基因数量的增加或表达活性的增加或突变,均会导致肿瘤的发生。抑瘤基因是作用细胞增殖和分化的重要调控因子,在正常细胞中起阻滞细胞增殖,促进细胞分化的功能。抑瘤基因的缺失或突变失活可使瘤基因充分发挥作用也会导致恶性肿瘤的发生发展。在鼻咽癌的发生发展,瘤基因和抑瘤基因同样起关键作用。迄今为止,鼻咽癌抑瘤基因的研究,已有重大进展,RASSF1A、BLU、BRD7、DAPK1、DLC1等多个基因已在基因表达变化沉默后对细胞生物学行为的影响等方面被证实具有鼻咽癌抑瘤基因的潜质,而且发现其分子机制主要为基因的甲基化。但鼻咽癌瘤基因的研究则相对滞后,虽然已有BCL2、CCND1、EGFR、TP73L、EVI1、HRAS、NRAS、STAT2、INT2、FGF3、MDM2、MYC、PIK3CA等基因由于在鼻咽癌中的扩增或过表达而被推测为鼻咽癌潜在的瘤基因,但鲜有报道过表达后对细胞生物学行为的影响,更没有体内报道。因此,探索鼻咽癌瘤基因及其作用机制对于揭示鼻咽癌的发病机理就显得尤为重要。本实验组前期通过收集五个实验室发表的170例鼻咽癌比较基因组杂交(CGH)数据构建鼻咽癌发病机制的树模型。研究结果提示了11个鼻咽癌的重要染色体变异事件,其中12p12-11区域的扩增是鼻咽癌发生发展的早期事件,但是该区域仍然含有上百个基因。2005年Garraway等人结合SNP芯片和表达谱芯片分析发现黑色素瘤瘤基因MITF。我们先前采用同样的办法,整合分析本实验室已有的五种鼻咽癌细胞(CNE1,CNE2,HONE1,5-8F 6-10B)和NP69的SNP芯片数据和三种鼻咽癌细胞(CNE1,CNE2, HONE1)和NP69的表达芯片数据,结果发现了12p12-11区域既扩增又过表达基因PTHLH。PTHLH是甲状旁腺激素受体家族成员,在恶性肿瘤的体液性高钙血症、乳腺癌和前列腺癌的骨转移中发挥作用,能促进结肠癌细胞的增殖、浸润、迁移及成瘤能力。因此,我们推测PTHLH基因可能在鼻咽癌发生发展中起重要作用。基于前面工作的基础上,本课题的研究目的为采用整合分析方法,筛选鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、HONE1基因组中的可能相关的瘤基因及抑瘤基因,对其进行初步的生物信息学研究。接着改变作为候选靶基因之一PTHLH的表达水平,观察其对鼻咽癌细胞株生物学行为的影响及可能的作用机制,为深入理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础,为此本课题进行了如下研究： (一)瘤基因及抑瘤基因筛选及初步生物信息学分析通过Ensembl database整合鼻咽癌细胞株SNP芯片数据、表达谱数据及已知正常拷贝数变化CNVs数据,筛选鼻咽癌细胞中可能相关的瘤基因及抑瘤基因。得到160个可能相关的靶基因,其中既扩增又过表达为102个,既缺失又低表达为58个。从160个基因当中随机抽取9个基因进行表达水平的检验,结果示除ILK外都与芯片结果一致,因此芯片结果可靠。PANTHER软件分析显示这160基因的功能包括：转录因子,核酸及脱氧核酸结合因子,膜运输蛋白及调节蛋白,各种生物酶和激酶等,参与的通路主要包括P53通路、细胞周期、凋亡通路等。由于这些生物学功能涉及到了肿瘤发生发展及侵袭转移的多个阶段,因而瘤基因／抑瘤基因在鼻咽癌中的表达失调,可能通过调控下游一系列靶基因的表达进而引起鼻咽癌细胞多方面生物学特性的改变。随后我们利用GenCLiP软件分别对三组基因(102可能相关的瘤基因、58可能相关的抑瘤基因和160二者混合基因)进行聚类分析和构建基因网络。结果三组基因都与瘤／抑瘤基因、EMT、鼻咽癌、EBV存在着密切关系。我们对其中与“瘤／抑瘤基因”的相关性进行10,000次的随机

关键词：鼻咽癌可能相关的瘤基因抑瘤基因 PIHLH 增殖迁移

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白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞的作用

白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞的作用

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作者：石小翠河北医科大学

学位级别：硕士

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis ,ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的慢性进行性致死性神经系统变性疾病,其病因和发病机制尚不清楚。很多研究表明氧化应激介导了神经元的死亡并在神经变性疾病的发生发展中发挥着... 详细信息

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis ,ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的慢性进行性致死性神经系统变性疾病,其病因和发病机制尚不清楚。很多研究表明氧化应激介导了神经元的死亡并在神经变性疾病的发生发展中发挥着重要作用,因此抗氧化应激治疗相应地成为了治疗ALS的一个重要方向。有研究发现在ALS患者的神经组织中存在异常的TDP-43(TAR-DNA binding protein)蛋白阳性包涵体,并出现该蛋白从核内到核外的异常分布。TDP-43由位于人类1号染色体1p36.2上的TARDBP(transactive response DNA binding protein)基因的6个外显子编码。TARDBP基因序列高度保守,广泛表达于多种组织。在后续的研究中证实,TDP-43在基因的表达调控方面起着重要作用,包括:参与剪切囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因及载脂蛋白AⅡ(ApoA-Ⅱ)基因;通过富含甘氨酸的C末端与核内不均一糖核蛋白(hnRNP)家族成员结合从而影响外显子跳跃接拼(exon skipping)、抑制剪接活性;与运动神经元生存蛋白作用为核体提供支架;参与调节mRNA稳定性、microRNA的生物合成、细胞凋亡和分裂;可能是调节神经元可塑性的神经元活性反应因子等。近两年来,数个研究小组先后在不同人群的家族性ALS(familial ALS, FALS)和散发性ALS(sporadic ALS,SALS)患者中发现了TARDBP基因的30多种突变,尤其以TDP-43Q331K与散发性ALS和TDP-43M337V与家族型ALS的相关关系研究较多,种种证据都提示TARDBP基因的异常与ALS的发生发展可能潜在相关,因此对这一基因功能及致病机制的研究也逐步深入。本实验室已做的研究证实,在转染TDP-43 Q331K、M337V突变位点的运动神经元细胞系(motor neuron-like cell line,简称NSC34)出现比转染Empty vector、TDP-43 Wide type组显著的氧化损伤、线粒体功能的障碍。白藜芦醇(Resveratrol,简称Res)最早是由葡萄的皮和种子中提取的一种植物抗毒素,化学名称为3, 4’,5-三羟基-1,2-二苯乙烯(亦称芪三酚),是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物,其具有多种生物学活性:如抗氧化作用,神经保护作用,抗肿瘤增殖作用,心血管保护作用,激活延寿基因等作用。研究证实,白藜芦醇上述生物学活性中,最受关注的是抗氧化清除自由基和神经保护作用。本研究应用稳定转染TDP-43 Q331K和TDP-43 M337V的NSC34细胞系作为ALS的细胞模型,深入研究不同浓度白藜芦醇对转染TDP-43突变位点的NSC34细胞系的作用。以细胞增殖速度和细胞总体损伤状况为切入点,寻求白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞的保护浓度。目的:探索稳定转染TDP-43的NSC34细胞系的培养方法;利用稳定转染TDP-43 Q331K和TDP-43 M337V的NSC34细胞系作为ALS的细胞模型,以此模型为基础,研究白藜芦醇干预后细胞的变化,探讨白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞的保护浓度。方法:参照NSC34细胞细胞株的培养程序,将本实验室现有的稳定转染TDP-43的NSC34细胞系进行复苏、传代、消化、冻存等,观察其生长和增殖变化。在成功培养稳定转染TDP-43的NSC34细胞基础上,于传代24小时后进行换液,待细胞恢复6-12小时后,将细胞分为对照组和Res干预组,Res干预组分别给予Res1、5和25μmol/L作用24小时,用四甲基噻唑蓝(MTT)法进行细胞活力分析;收集各组培养液,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果:⑴成功培养了稳定转染Empty vector、TDP-43 Wide type、TDP-43 Q331K、TDP-43 M337V四个NSC34细胞系,倒置显微镜下观察细胞生长状态良好;⑵稳定转染TDP-43的NSC34细胞系在给予Res作用24小时后,倒置相差显微镜下观察,1和5μmol/L干预组各组细胞形态可见突起细长光滑,彼此间可见丰富的联系,胞体圆润、折光性强、贴壁能力好;Res25μmol/L干预组可见各组细胞突起短,细胞彼此间多形成聚集,胞体皱缩、折光性差甚至成球形亮点、贴壁能力差;⑶给予Res1、5μmol/L作用24小时后,较未干预组和Res25μmol/L干预组细胞增殖程度明显升高、培养液LDH水平明显下降,具有统计学意义(P<0.05);⑷给予Res25μmol/L作用2

关键词：神经系统变性疾病 NSC34细胞 TDP-43 氧化应激乳酸脱氢酶白藜芦醇

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胃癌细胞MGC803中miR-200a作用机制的初步研究

胃癌细胞MGC803中miR-200a作用机制的初步研究

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作者：徐影琪中国医科大学

学位级别：硕士

前言胃癌是源自胃粘膜上皮的恶性肿瘤,在我国发病率及死亡率很高。胃癌涉及到多种癌基因的激活及抑癌基因的失活,揭示这些基因变化的规律,不仅可以阐明癌变的机制,更可以协助肿瘤的诊断、治疗和预后。近年来,miRNA分子对基因表达的调控... 详细信息

前言胃癌是源自胃粘膜上皮的恶性肿瘤,在我国发病率及死亡率很高。胃癌涉及到多种癌基因的激活及抑癌基因的失活,揭示这些基因变化的规律,不仅可以阐明癌变的机制,更可以协助肿瘤的诊断、治疗和预后。近年来,miRNA分子对基因表达的调控作为肿瘤发生发展的又一可能原因,受到越来越多的关注。 MicroRNAs是长约21-25个核苷酸的小RNA分子,在真核生物中发挥基因表达调控作用,通过调节肿瘤相关基因的表达,参与肿瘤的发生发展。本实验室前期利用多重连接依赖式探针扩增(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA)技术对50例胃癌组织进行基因组水平的分析,发现有58%的病例存在染色体1p36区域的缺失,提示该区域可能存在胃癌特异性的抑制基因或调控序列。人类miR-200a定位于染色体1p36区,在乳腺癌、卵巢癌及结肠癌细胞中已证实miR-200a通过抑制转录因子ZEB2的表达,间接调节E-cadherin的表达,抑制肿瘤细胞的迁移,抑制上皮向间质转化(Epithelial to mesenchymal transition, EMT),但在胃癌中miR-200a的作用及可能的作用途径尚不清楚。E-cadherin是细胞粘附分子cadherin家族成员,对于上皮的形成和维持具有重要作用,其功能缺失与肿瘤的侵袭和转移有关。有研究表明：E-cadherin参与调控EphA2与其配体的结合及后续降解,EphA2的功能活化也依赖于适当的E-cadherin蛋白表达及功能定位。EphA2在许多肿瘤组织中呈过度表达,尤其高表达于高侵袭性的肿瘤细胞。新近研究发现EphA2在胃癌组织中高表达,且与胃癌的侵袭和淋巴转移相关。本研究以胃癌MGC803细胞为研究对象,试图探讨胃癌中miR-200a的作用及可能参与的信号途径,以期为胃癌发生发展的研究提供一定的实验依据。材料与方法 1、化学合成的miR-200a及相应阴性对照(Negative control, NC) mimics miR-200a:5'-UAACACUGUCUGGUAACGAUG U-3'; Negative control:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' 2、miR-200a及NC转染MGC803细胞,使miR-200a过表达,应用steam-loop RT-PCR检测转染后表达效率。 3、转染niRNA mimics 24及48h,利用TRIzol法提取总RNA,反转录合成cDNA,应用实时定量RT-PCR检测ZEB2、E-cadherin、EphA2的mRNA表达。 4、转染miRNA mimics 24及48h,应用western blot方法检测E-cadherin、EphA2的蛋白表达。 5、应用MG1 32阻断蛋白降解,分析miR-200a对EphA2降解的调节。实验结果 1、miR-200a及NC mimics转染后表达效率的检测经steam-loop RT-PCR检测,转染miR-200a组中miR-200a的表达为转染NC组的1838±5.3倍,表明miRNA片段转染后成功高效表达。 2、胃癌细胞MGC803中miR-200a对ZEB2表达的调节 MGC803细胞转染miR-200a 24 h,转染miR-200a组ZEB2的表达量为对照组的0.7倍；转染后48 h,转染miR-200a组ZEB2的表达量为对照组的0.71倍。 3、胃癌细胞MGC803中miR-200a对E-cadherin表达的调节 MGC803细胞转染miR-200a 24及48h,转染miR-200a组E-cadherin表达均高于对照组。在RNA水平,实验组E-cadherin表达量约为对照组的2.381、6.337倍；在蛋白水平,实验组E-cadherin表达量约为对照组的1.57、5.43倍。 4、胃癌细胞MGC803中miR-200a对EphA2表达的调节 MGC803细胞转染miR-200a 24h后,转染miR-200a组EphA2表达明显高于对照组。在RNA水平,实验组EphA2表达量约为对照组的4.78倍；在蛋白水平,实验组EphA2表达量约为对照组的3.4倍。而48h后转染miR-200a组EphA2表达略高于对照组。在RNA水平,实验组EphA2表达量约为对照组的1.39倍。在蛋白水平,实验组EphA2表达量约为对照组的1.12倍。 5、miR-200a可部分抵消MG132介导的EphA2降

关键词：胃癌 miR-200a EphA2 E-cadherin

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RNA干扰抑制大鼠肝星状细胞CTGF表达的实验研究

RNA干扰抑制大鼠肝星状细胞CTGF表达的实验研究

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作者：姜晓笛中国医科大学

学位级别：硕士

目的肝纤维化是多种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理基础,严重危害人类健康,而多种细胞因子在肝纤维化形成中有重要的作用。本研究通过构建针对结缔组织生长因子(CTGF)的RNA干扰重组质粒及其对照质粒,将其转染到体外培养的大鼠肝星状细... 详细信息

目的肝纤维化是多种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理基础,严重危害人类健康,而多种细胞因子在肝纤维化形成中有重要的作用。本研究通过构建针对结缔组织生长因子(CTGF)的RNA干扰重组质粒及其对照质粒,将其转染到体外培养的大鼠肝星状细胞(HSC)中,进一步应用Real-time PCR方法检测CTGFmRNA的表达,从而为进一步研究肝纤维化的基因治疗提供依据。材料与方法 1、材料 (1)大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),北京金紫晶生物制品有限公司购入。(2)主要试剂：DMEM高糖培养液(美国GiBco公司)、胎牛血清(美国Hyclone公司)、胰蛋白酶(Invitrogen公司)；引物序列(Takara公司)；pGCsi质粒(含绿色荧光蛋白、耐新霉素、H1启动子) (上海吉凯基因化学技术有限公司)；Lipofectamine2000 (invitrogen公司)；质粒小量提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；酶标仪(Labsystems Dragon公司)；RNAiso Plus (Takara公司)；Real-timePCR试剂盒(Takara公司)。 2、方法 (1)利用pGCsi载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA(shRNA)表达的质粒重组体,并通过基因测序分析进行鉴定。 (2)将构建成功的4组重组质粒转染大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),另设空白对照组,24小时后,共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)表达,分析转染效果。 (3)检测CTGFmRNA表达水平,筛选出有效抑制CTGF表达的序列。 3、统计学处理应用SPSS 13.0软件对数据进行方差分析。结果 1、成功构建了能表达CTGFshRNA的三组重组体pGCsi-CTGFshRNA。 2、pGCsi-CTGFshRNA成功转染到肝星状细胞中。 3、与空白对照组相比,pGCsi-CTGFshRNA1组及pGCsi-CTGFshRNA2组细胞CTGFmRNA不同程度下降,pGCsi-CTGFshRNA3组细胞及非特异性shRNA组mRNA表达水平无明显变化。结论 1、成功构建了pGCsi重组质粒。 2、重组质粒成功转染到大鼠肝星状细胞中。 3、筛选出pGCsi-CTGFshRNA1和pGCsi-CTGFshRNA2两条有效抑制CTGF基因表达的序列,pGCsi-CTGFshRNA质粒能高效抑制大鼠肝星状细胞中CTGF的表达。

关键词：结缔组织生长因子 RNA干扰短发夹RNA 肝星状细胞

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