检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：肖家雯中国医科大学

学位级别：硕士

前言胃癌是严重威害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一,但长期以来包括手术切除和其它综合性治疗并未带来令人满意的生存率,因此在肿瘤基因水平上寻找新的突破口并开展靶向治疗已成为目前肿瘤研究的热点之一。O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移... 详细信息

前言胃癌是严重威害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一,但长期以来包括手术切除和其它综合性治疗并未带来令人满意的生存率,因此在肿瘤基因水平上寻找新的突破口并开展靶向治疗已成为目前肿瘤研究的热点之一。O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT）是细胞中一种修复DNA损伤的酶,近些年研究表明MGMT基因不仅是对抗亚硝脲类药物的耐药基因,而且是与肿瘤发生有关的潜在癌基因或抗癌基因。DNA依赖的蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase,DNA-PK）由3个亚基组成:Ku80、ku70与DNA依赖的蛋白激酶催化亚单位（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）。研究发现DNA-PK的功能广泛,是因为DNA-PK是磷酸化的蛋白酶,底物包括肿瘤抑制蛋白的p53转录因子（原癌基因）、C-Fos等等,特别在调节DNA转录、复制、修复中起重要作用。本研究通过应用免疫组化的方法,检测两种蛋白在胃癌中的表达情况,分析其与胃癌临床病理特征之间的关系,以及两者之间的相互联系,旨在探讨MGMT,DNA-PKcs在胃癌组织中的表达及其临床意义。材料和方法 1、病例和标本收集中国医科大学附属第一医院及辽宁省肿瘤医院2005年10月～2006年8月手术切除的胃癌组织标本124例。其中男性92例,女性32例。年龄24-85岁,中位年龄60岁。所有患者术前均未接受化疗、放疗。病理均为腺癌,高分化（乳头状腺癌,高分化管状腺癌）40例,中分化（中分化管状腺癌）25例,低分化（低分化腺癌,印戒细胞癌,粘液腺癌）59例。组织分期采用1997年国际抗癌联盟（UICC）制定的TNM临床分期标准,Ⅰ期17例,Ⅱ期46例,Ⅲ期37例,Ⅳ期24例。 2、试剂鼠抗人MGMT单克隆抗体（工作浓度为即用型）;鼠抗人DNA-PKcs单克隆抗体（工作浓度为即用型）,SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。 3、方法将124例胃癌标本与24例正常胃组织标本制作成组织芯片,采用免疫组化S-P法,按照S-P检测试剂盒说明书所示步骤进行,切片经柠檬酸缓冲液（PH=6.0）高压热修复预处理。组织芯片由上海芯超生物科技有限公司制作。 4、结果判定 MGMT和DNA-PKcs均以胞核和或胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性染色,依照阳性细胞比例和显色强度分别得分,将两项得分相乘得到该视野的最终得分,选取的5个视野得分的平均值为最后得分。最后该切片按照得分分为以下三个等级:0.1分为（一）,2-4分为（+）,＞4分为（++）。（一）为阴性表达,（+）为阳性表达,（++）为强阳性表达。 5、统计分析方法采用SPSS13.0统计软件,卡方检验及Spearman秩相关分析,采用双侧检验,P＜0.05为具有统计学意义。实验结果 1、MGMT,DNA-PKcs在124例胃癌组织中阳性表达率分别为58.9%（73/124）,31.5%（39/124）。 2、男性中MGMT的阳性表达率为66.3%（61/92）,女性中MGMT的阳性表达率为37.5%（12/32）,两者有统计学差异,P＜0.01。高中分化胃癌中MGMT的阳性表达率为70.8%（46/65）,低分化中阳性表达率为45.8%（27/59）,两者有统计学差异,P＜0.01。MGMT蛋白表达与分化程度、性别相关,与年龄、肿瘤侵润深度、淋巴结转移情况、远处转移情况、TNM分期无关,而DNA-PKcs均与之无关。 3、两种蛋白的表达强度之间存在正相关,相关系数及P值为r=0.342,P=0.000。结论 1、MGMT在胃癌中高表达,DNA-PKcs在胃癌中低表达。 2、MGMT蛋白表达与分化程度、性别相关,与年龄、肿瘤侵润深度、淋巴结转移情况、远处转移情况、TNM分期无关,而DNA-PKcs均与之无关。 1、两种蛋白的表达强度之间呈正相关。

关键词：胃癌 MGMT DNA-PKcs 免疫组织化学

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2003～2008年河北省人群甲型流感病毒对金刚烷胺的耐药性研究

2003～2008年河北省人群甲型流感病毒对金刚烷胺的耐药性研究

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作者：王晓晖河北医科大学

学位级别：硕士

目的：流行性感冒（influenza，简称流感）是由流感病毒引起的一种严重威胁人类健康的急性呼吸道传染病，由于流感病毒传播速度快及抗原的易变性，目前尚未能有效控制，流感依然是对人类健康构成威胁的主要呼吸道传染病之一，被我国列... 详细信息

目的：流行性感冒（influenza，简称流感）是由流感病毒引起的一种严重威胁人类健康的急性呼吸道传染病，由于流感病毒传播速度快及抗原的易变性，目前尚未能有效控制，流感依然是对人类健康构成威胁的主要呼吸道传染病之一，被我国列为丙类法定传染病。流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感抗原变异频繁，在上世纪曾经导致三次世界性大流行。　　目前，国际上预防与治疗流感的主要措施是疫苗接种、药物治疗和预防。由于疫苗的免疫效果受到多方面的影响，其使用有一定局限性，多年的临床实验表明疫苗接种并不能提供满意的保护，有时保护率低于50％。抗病毒药物既能用于预防流感，又能为急症患者提供治疗，在控制流感方面发挥着重要作用。目前抗流感病毒的药物主要包括两大类，一种为M2离子通道阻滞剂，包括金刚烷胺和金刚乙胺，主要用于甲型流感的预防和治疗;另一类为神经氨酸酶抑制剂，包括奥斯它韦和扎那米韦，可用于甲型和乙型流感的预防和治疗。2003年以前，社区分离株研究结果显示，流感病毒对烷胺类药物耐药性产生的机率很小，但2003年以后从使用金刚烷胺的流感病人中分离得到的耐药突变株频率逐渐增高。研究表明，这种突变株可能会经密切接触进行传播，并使得化学药物预防无效。河北省甲型流感病毒对金刚烷胺类药物的耐药情况还不清楚，鉴于对金刚烷胺类药物耐药的分子机制已经比较清楚，主要与M2蛋白跨膜区密切相关，因此，本研究对2003～2008流行期河北省分离的甲型流感病毒M2蛋白基因进行了测序，分析耐药性位点变异情况，掌握对金刚烷胺耐药发生率，为流感临床合理用药和预防提供科学依据。　　方法：　　（1）选取河北省2003-2008年流行期河北省疾病预防控制中心全国流感监测网络实验室分离到的全部甲1、甲3亚型流感毒株作为研究对象，所有毒株均经国家流感中心进行复核鉴定。共选取甲型流感病毒305株，其中，甲3亚型229株，甲1亚型76株。　　（2）提取病毒RNA，用RT-PCR一步法扩增流感病毒M2基因片段，产物测定核酸序列。　　（3）用生物信息软件与烷胺类药物敏感毒株进行分析比较，以M2蛋白跨膜区26、27、30、31和34位氨基酸中任一位置发生突变为标准判定是否为耐药毒株。　　结果：　　（1）2003-2008流行期流感监测网络实验室共分离出流感病毒436株，其中甲型流感病毒305株（H1N1 76株，H3N2229株），占69.95％，乙型流感病毒131株，占30.04％。　　（2）305份标本用特异引物对M2基因片段进行扩增，2.0％琼脂糖凝胶电泳后，均出现预期大小约152bp的条带扩增片段。　　（3）河北省305株甲型流感病毒中，有250株为对烷胺类药物耐药毒株，耐药率为81.97％。2003-2008年5个流行期耐药率分别为90.32％（84/93）、78.94％（30/38）、29.62％（16/54）、100％（113/113）和 100％（7/7）。　　（4）229株H3N2亚型流感病毒中有212株耐药，耐药率为92.57％。76株H1N1亚型流感病毒中有38株耐药，耐药率为50.00％（38/76）。　　（5）250株对烷胺类药物耐药的甲型流感毒株有6株在M2蛋白跨膜区氨基酸发生了V27A点置换，占2.40％;244株发生了S31N位点置换，占97.60％;26、30和34位氨基酸均未发生改变。　　（6）212株H3N2亚型流感病毒耐药株中，有5株发生了V27A置换，占2.36％;207株发生了S31N置换，占97.64％，其中5株同时发生了V271和S31N位点置换，占2.36％，3株同时发生了A29T和S31N位点置换，占1.42％。　　（7）38株H1N1耐药株中，有1株发生了V27A置换，占2.63％，37株发生了S31N置换，占97.37％。　　（8）212株H3N2亚型流感病毒耐药株中，有3株同时发生了A29T和S31N位点置换，占1.42％，未见相关文献报道。　　结论：　　（1）用M2蛋白跨膜区氨基酸变异分析方法显示，2003-2008流行期河北省分离到的305株甲型流感病毒有250株对烷胺类药物耐药，各流行期耐药率分别为90.32％、78.94％、29.62％、100％和 100％，平均耐药率为81.97％。　　（2）河北省甲型流感病毒M2蛋白跨膜区耐药位点以S31N为主，其次为V27A，26、30和34均未发生改变。　　（3）发现了H3N2亚型毒株M2蛋白跨膜区A29T和S31N位点同时突变的现象，文献未见报道。　　（4）在甲型流感病毒金刚烷胺敏感株重新在人群流行之前，不应该使用金刚烷胺类药物预防或治疗流感。　　（5）应进行联合用抗流感病毒药物，加强新药研发和耐药性监测工作。

关键词：河北省甲型流感病毒耐药性 M2蛋白金刚烷胺金刚乙胺基因测序

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诺氟沙星与磺胺嘧啶在凹凸棒土上的吸附行为研究

诺氟沙星与磺胺嘧啶在凹凸棒土上的吸附行为研究

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第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会

作者：李美兰刘青孙成杨绍贵南京大学环境学院

抗生素由于其广谱抗药性,而被广泛地用来预防和治疗动植物疾病以及作为饲料添加剂,但它不易被生物体消化吸收,最终以母体化合物或代谢产物形式随尿液、粪便排泄进入环境中。土壤是环境重要的污染物贮藏室,所以土壤中抗生素浓度水平更高,... 详细信息

抗生素由于其广谱抗药性,而被广泛地用来预防和治疗动植物疾病以及作为饲料添加剂,但它不易被生物体消化吸收,最终以母体化合物或代谢产物形式随尿液、粪便排泄进入环境中。土壤是环境重要的污染物贮藏室,所以土壤中抗生素浓度水平更高,达mg/kg级别。土壤对抗生素的吸附会影响抗生素在环境中的迁移、转化及生物可利用性,是影响抗生素环境行为的重要过程之一。进入环境中的抗生素不但能诱发微生物获得抗药基因,还能影响微生物的新陈代谢过程,给人类健康和生态平衡带来了一定的威胁。目前,已有报道研究了抗生素在粘土矿

关键词：凹凸棒土吸附行为磺胺嘧啶氟沙星

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重组腺病毒介导TIMP1基因对类风湿关节炎大鼠滑膜新生血管的影响

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第41期13卷 8097-8103页

作者：张育刘晓华顾健沈维干孟德钎李国青扬州大学临床医学院江苏省扬州市225001 南京医科大学第一附属医院江苏省南京市210029

背景:滑膜血管翳形成后可分泌一系列酶如基质金属蛋白酶等,可促进血管新生和炎症反应,形成软骨和骨的破坏。目的:研究重组腺病毒介导的基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)基因对类风湿关节炎模型大鼠关节炎症及滑膜血管新生的影响。设... 详细信息

背景:滑膜血管翳形成后可分泌一系列酶如基质金属蛋白酶等,可促进血管新生和炎症反应,形成软骨和骨的破坏。目的:研究重组腺病毒介导的基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)基因对类风湿关节炎模型大鼠关节炎症及滑膜血管新生的影响。设计、时间及地点:基因治疗动物体内实验,于2005-07/2007-06在扬州大学完成。材料:HEK-293A细胞系购于中科院上海细胞生物研究所细胞库,ECV-304细胞为自备,带有绿色荧光蛋白(GFP)基因或/和基质金属蛋白酶组织抑制因子1基因的重组腺病毒(rAD-GFP-TIMP1及rAD-GFP)的病毒贮存液由南京师范大学分子医学实验室惠赠。清洁级4～6周龄SD大鼠40只。方法:将rAD-GFP-TIMP1和rAD-GFP扩增、纯化,用紫外分光光度法检测重组腺病毒的颗粒数。用rAD-GFP-TIMP1感染ECV-304细胞检测病毒活力。30只大鼠注射Ⅱ型胶原建立类风湿关节炎大鼠模型,分为:①模型组注射PBS。②模型+rAD-GFP-TIMP1组注射rAD-GFP-TIMP1。③模型+RAD-GFP组注射rAD-GFP,均为膝关节腔内注射;10只大鼠注射生理盐水造模做对照组。1次/周,4周。主要观察指标:①rAD-GFP-TIMP1及rAD-GFP在HEK-293A细胞中扩增、纯化后病毒的颗粒数及GFP蛋白表达。②各组大鼠每周进行1次关节炎指数评分。③于造模第4周处死大鼠取膝关节行滑膜病理免疫组织化学染色及微血管密度检测。④取血清采用WesternBlot检测大鼠体内基质金属蛋白酶组织抑制因子1、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶1,2,3,9的表达。结果:①纯化后的rAD-GFP-TIMP1和rAD-GFP滴度分别为:5.7×1012,4.8×1012pfu/mL;A260nm/A280nm均>1.3;用rAD-GFP-TIMP1感染ECV-304细胞获得成功提示病毒活力正常。②感染rAD-GFP-TIMP1的关节炎大鼠血清中基质金属蛋白酶组织抑制因子1获得了高表达,rAD-GFP-TIMP1治疗组大鼠血清中基质金属蛋白酶组织抑制因子1的相对含量明显高于模型组和rAD-GFP治疗组。③rAD-GFP-TIMP1治疗组的关节炎指数评分明显低于模型组。④感染rAD-GFP-TIMP1可使滑膜新生血管数目明显减少,同时能抑制基质金属蛋白酶1,3,9的表达,而对血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶2的抑制作用不明显。结论:①感染rAD-GFP-TIMP1的大鼠体内基质金属蛋白酶组织抑制因子1基因获得了有效的表达。②感染rAD-GFP-TIMP1能明显降低模型大鼠的关节炎指数评分。③血管内皮生长因子,基质金属蛋白酶1,2,3,9共同参与促进关节炎大鼠滑膜血管新生的形成和发展,rAD-GFP-TIMP1可能通过抑制基质金属蛋白酶1,3,9的表达而发挥抗血管新生的作用。

关键词：关节炎胶原Ⅱ诱导型基质金属蛋白酶组织抑制因子1 重组腺病毒血管新生

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细胞凋亡相关基因异常表达与胰腺癌生物学行为关系的研究

细胞凋亡相关基因异常表达与胰腺癌生物学行为关系的研究

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作者：董明董齐张浩岳丽爽田利国丁思悦程红周建平路迢迢马刚郭克建中国医科大学附属第一医院

在发达国家,胰腺癌占恶性肿瘤死亡原因的第四位,在我国为第六位。90%的胰腺癌患者于诊断后一年内死亡,诊断后平均生存时间为三个月。适合手术治疗者低于15%,手术切除病例术后5年累积生存率低于4%。胰腺癌的发病率几乎等于死亡率。其根... 详细信息

标准号: gkls103169

在发达国家,胰腺癌占恶性肿瘤死亡原因的第四位,在我国为第六位。90%的胰腺癌患者于诊断后一年内死亡,诊断后平均生存时间为三个月。适合手术治疗者低于15%,手术切除病例术后5年累积生存率低于4%。胰腺癌的发病率几乎等于死亡率。其根本原因在于缺乏对胰腺癌生物学行为的认识。因此,探讨胰腺癌发生发展的分子生物学机理,提高胰腺癌的治疗效果,建立新的治疗策略有重要的临床意义和社会价值。基于以上目的,自1996年以来,在日本岛根大学医学部胰腺癌研究室、美国纽约州立大学石溪分校医学部癌研究中心、教育部(教外司留#2004176)、辽宁省科技厅(#20062100)以及辽宁省教育厅(#05L448)的资助下,我们运用分子生物学技术,以Ki-ras→p53→Gadd45a等癌相关基因为主线,对胰腺癌的病因学、临床病理学、预后、辅助治疗等生物学行为的关系做了系列的研究工作。内容包括以下几个部分：一、不同人群胰腺癌病人p53蛋白及Ki-ras原肿瘤基因突变表型的差异 Ki-ras原肿瘤基因位于人类第12号染色体(12p12.1),对应蛋白编码189个氨基酸,分子重量21kDa。正常功能的p21Ki-ras蛋白强化二磷酸鸟苷(GDP)和三磷酸鸟苷(GTP)的亲和力,并维持三磷酸鸟苷酶活性,从而有效控制细胞分裂和增殖。Ki-ras原肿瘤基因突变后,p21Ki-ras蛋白将失去控制细胞增殖能力,使细胞易于转型恶变。研究发现,90%以上胰腺癌组织中可以检测到Ki-ras原肿瘤基因突变。以往对此Ki-ras原肿瘤基因的研究多集中在其突变对胰腺癌发病过程的影响。我们从胰腺癌基因学角度,运用免疫组织化学、点杂交(Dot blot)、Meta分析等方法,研究不同人群胰腺癌患者p53蛋白表达或Ki-ras基因12密码子突变表型的差异,探讨生活方式对胰腺癌发病的影响。二、胰腺癌的早期诊断文献报道,胰腺癌组织中NPTX2和CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化率分别达82%和98%,而正常组织中几乎检测不到NPTX2和CLDN5基因高甲基化,说明这两个基因具有高度胰腺癌特异性。然而这种有创伤检查既受取材条件的限制,也难以提高胰腺癌早期检出率。运用甲基化特异性基因扩增(MSP)技术,我们探索取材胰液联合检测NPTX2和CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化,为胰腺癌的早期诊断探索出新的途径。三、胰腺癌侵袭机制阐明胰腺癌的侵袭机制对阻止胰腺细胞恶性转型具有重要意义。我们根据细胞内信号传导与控制理论,运用细胞增殖实验、细胞黏附实验、Transwell体外侵袭实验、明胶酶谱法分析MMP-9和MMP-2的活性、Western印迹实验检测MMP-9和uPA的蛋白表达、RT-PCR法检测MMP-9及uPA mRNA的表达、凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测NF-kB活性等方法,研究了EGF、TGF-beta1、MMPs在胰腺癌细胞浸润过程中的作用。四、与p53抑癌基因相关的细胞凋亡相关蛋白对胰腺癌生物学行为的影响 (一)p53抑癌基因 p53抑癌基因位于人类第17号染色体的短臂(17q13.1)。野生型p53基因具有监控基因的完整性功能,一旦细胞DNA遭到损害,p53蛋白与损害的DNA相应部位结合,起特殊转录因子作用,活化p21基因转录,使细胞停滞于G1期;抑制解链酶活性;并与复制因子A相互作用参与DNA的复制与修复;如果修复失败,p53蛋白即启动程序性死亡过程诱导细胞自杀,阻止有癌变倾向突变细胞的生成,从而防止细胞恶变。P53基因突变后,p53蛋白失去对细胞的监控作用,细胞容易带着受损伤的DNA进入S期,使细胞因遗传不稳定而导致细胞恶性变。P53抑癌基因突变对胰腺癌生物学行为的影响始终存在争议。 (二)Gadd45a基因 Gadd45a(Growth arrest and DNA damage-inducible)是生长抑制和DNA损害诱导基因家族成员之一。该基因位于人类第1号染色体的短臂(1p31.2-31.1)。Gadd45a基因具有4个外显子,具有维护基因组的稳定性功能。在Gadd45a基因中,p53调节区定位于该基因的第三内含子。受p53基因上调,该基因控制细胞周期的G2-M期,从而控制细胞增殖/凋亡平衡。Gadd45a蛋白广泛存在于正常组织的细胞中。然而,它在肿瘤细胞中过度表达的意义尚不清楚。特别是未见Gadd45a基因或蛋白在胰腺癌组织中表达的报告。我们报告了Gadd45a与p53基因协同表达对胰腺癌生物学行为的影响。 (三)细胞凋亡相关蛋白 PDCD4(Programmed cell death 4)即程序性细胞死亡因子4基因是一种新的肿瘤抑制基因,定位于染色体10q24,编码185

关键词：胰腺癌癌基因生物学行为

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抗菌肽抗原虫作用研究进展

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中国公共卫生 2008年第11期24卷 1395-1396页

作者：于娟赵瑞君山西医科大学寄生虫教研室太原030001

原虫为单细胞真核生物,致病性原虫对人类健康和畜牧业生产造成了严重危害。目前,抗原虫治疗仍以化学药物为主,但由于其带来严重的副作用和日益突出的耐药性问题,使得新药的研制尤为迫切。抗菌肽是生物细胞特定基因编码,经特定外界条件... 详细信息

原虫为单细胞真核生物,致病性原虫对人类健康和畜牧业生产造成了严重危害。目前,抗原虫治疗仍以化学药物为主,但由于其带来严重的副作用和日益突出的耐药性问题,使得新药的研制尤为迫切。抗菌肽是生物细胞特定基因编码,经特定外界条件诱导产生的一类多肽,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原虫等多种生物学功能。本文就抗菌肽的抗原虫作用、作用机制及存在问题作一综述。[第一段]

关键词：抗原虫作用抗菌肽单细胞真核生物致病性原虫生物学功能人类健康化学药物基因编码

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重组改构内皮抑素30肽纯化方法的改进及活性研究

重组改构内皮抑素30肽纯化方法的改进及活性研究

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作者：赵炜明哈尔滨医科大学

学位级别：博士

肿瘤是继心、脑血管疾病之后严重威胁人类健康的一大顽症，而血管生成对肿瘤的生长、浸润和转移具有重大意义，抑制新生血管的生成可使肿瘤细胞进入休眠状态并诱导凋亡。因而以新生血管为靶点对肿瘤进行生物治疗成为近年来的研究热点。... 详细信息

肿瘤是继心、脑血管疾病之后严重威胁人类健康的一大顽症，而血管生成对肿瘤的生长、浸润和转移具有重大意义，抑制新生血管的生成可使肿瘤细胞进入休眠状态并诱导凋亡。因而以新生血管为靶点对肿瘤进行生物治疗成为近年来的研究热点。内皮抑素最初是1997年哈佛大学O'Reilly等发现的一种内源性血管生成抑制剂，由XⅧ型胶原蛋白羧基末端的184个氨基酸残基组成，分子量- 2.0×104。大量研显示内皮抑素具有广谱抗肿瘤作用及轻微毒性，无耐药性产生，不引起免疫反应。2004年本室运用定点诱变技术，成功地将人内皮抑素中的RGIRGAD序列改为RGDRGD序列，获得了抗肿瘤活性更强的重组内皮抑素。本研究在上述研究成果的基础上进一步确定引入RGD序列后的内皮抑素活性区，探索用基因重组方法生产小分子多肽的理论及技术，为内皮抑素抗肿瘤相关肽的临床应用及小分子多肽产业化开发提供实验依据，奠定理论基础。　　人工合成人内皮抑素l～30位氨基酸(30肽，序列25～31由RGIRGAD改为RGDRGD)对应核苷酸序列，与质粒pTYB2重组，转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建高表达融合蛋白的基因工程菌;通过几丁质亲和层析树脂一步纯化30肽;用MTT、细胞迁移抑制实验、鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验(CAM)、小鼠体内抑瘤实验等多种方法比较30肽和内皮抑素抗肿瘤活性;通过实验确定几丁质树脂最大承载量：改进几丁质树脂再生方法，增加几丁质树脂使用次数;研究用半胱氨酸和谷胱甘肽替代DTT作为融合蛋白裂解的诱导剂，解决DTT对细胞的毒性作用。　　研究结果显示，30肽具有比内皮抑素更强的抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、胃癌7901细胞(SGC-7901)生长和迁移的作用。30肽对HUVEC、SGC-7901半数抑制浓度IC50分别为36μg/mL、47μg/mL，显著低于内皮抑素的IC50179μg/mL、202μg/mL。CAM实验中30肽具有比内皮抑素更明显的抑制新生血管生成作用。30肽在小鼠体内抑瘤率47.8％，内皮抑素只有28.7％，抑瘤率几乎翻一番。其他实验结果也都证实30肽具有比内皮抑素更强抗肿瘤活性。　　研究结果还证明，每一毫升几丁质树脂的最大承载量为125 mL培养菌量得到的融合蛋白（30肽工程菌）;几丁质树脂只能使用5次的原因是几丁质结合蛋白与几丁质亲和力过强，每次再生都有几丁质结合蛋白没有和几丁质脱离，采用提高碱液浓度并延长浸泡时间可以提高几丁质再生效果，增加几丁质树脂的使用次数;实验结果证明半胱氨酸和谷胱甘肽可以替代DTT作为诱导剂用于小分子多肽的纯化，避免DTT对细胞引起的毒性作用。　　依据上述研究结果，得出如下结论：　　 1.内皮抑素30肽具有比内皮抑素更强的抗肿瘤活性。内皮抑素30肽对内皮细胞半数致死剂量仅为内皮抑素的1/4，对胃癌细胞半数致死剂量仅为内皮抑素的1/5，动物实验内皮抑素30肽抑瘤效果是内皮抑素的l倍。　　 2.可以用基因重组的方法生产小分子多肽,成本低于化学合成，避免化学合成产生的化学污染。　　 3.几丁质树脂使用次数受限，是几丁质与几丁质结合蛋白亲和力过强，再生不彻底的结果，强化再生条件能够延长几丁质树脂使用寿命，并且不影响30肽纯化质量　　 4.可以用半胱氨酸和谷胱甘肽等巯基试剂取代DTT作为融合蛋白裂解剂，解决产品中DTT可能带来的细胞毒性。

关键词：内皮抑素 RGD 抗肿瘤活性几丁质亲和层析生物制药

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四分子交联体5与大肠癌转移的关系

四分子交联体5与大肠癌转移的关系

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作者：耿焱南方医科大学

学位级别：博士

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,严重威胁人类的生命健康。在北美、西欧各国大肠癌占全部癌症死亡原因的第2位,在我国大部分省市占全部恶性肿瘤死亡原因的第5-6位,个别地区如浙江省嘉善市占首位。恶性肿瘤的生物学特性包括自主性、可移... 详细信息

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,严重威胁人类的生命健康。在北美、西欧各国大肠癌占全部癌症死亡原因的第2位,在我国大部分省市占全部恶性肿瘤死亡原因的第5-6位,个别地区如浙江省嘉善市占首位。恶性肿瘤的生物学特性包括自主性、可移植性、转移性、去分化等,其中最关键的是转移性。大肠癌的死亡率高,主要与其转移有关。大肠癌的浸润转移是一个十分复杂、多步骤的过程,有关其机制的研究远远落后于癌症研究的其他领域。虽然有关大肠癌浸润转移的分子机制已有所阐明,但尚存在许多不确定的因素。近年来,随着分子生物学研究迅速向纵深发展,肿瘤转移研究逐渐从细胞核的方面过渡到细胞表面上来,研究膜受体的种类及作用方式,特别是其所介导的肿瘤细胞、宿主细胞、细胞外基质（extracellular material,ECM）之间的相互作用对转移的影响。四分子交联体超家族是一组以四次跨膜及两个大小不等的细胞外环状结构为主要特征的膜表面蛋白。四分子交联体超家族成员可以通过彼此间的相互联系,以及同包括整合素在内的许多其它类型的膜表面蛋白的联系,共同形成四分子交联体网（tetraspanin web）,组织膜蛋白在细胞膜上的定位,在细胞粘附、细胞运动及信号传导方面发挥重要作用。越来越多的研究表明,这个家族的许多成员对恶性肿瘤的转移能力有重要影响。四分子交联体5（Tetraspanin 5,Tspan-5）是四分子交联体超家族中的一员。它可以与许多生长促进分子和粘附分子结合,同时,在它的胞内部分还有PKC的结合部位,可以成为整合素等和PKC联系的桥梁。目前对Tspan-5的研究,主要集中在神经系统,它在神经系统中高表达,可以影响小鼠的神经细胞及神经胶质细胞的粘附、运动和增殖,对于神经系统的形成和功能的维持起重要作用,未见有其与结肠癌关系的报道。本研究用基因芯片技术筛选三株具有不同转移潜能的结肠癌细胞株的差异表达基因,从中挑选出Tspan-5作为研究对象,从分子和细胞水平深入探讨该基因对结肠癌细胞转移能力的影响,旨在研究对大肠癌转移相关基因,不仅有利于阐明大肠癌转移的分子机制,而且还能为临床上预测转移、基因治疗和预后判断寻找新的有效靶点。一、基因芯片技术筛选三株具不同转移潜能的结肠癌细胞株的差异表达基因,确定研究目的基因,验证基因芯片检查结果 1、确定三个细胞株转移能力的差异用异质粘附实验和趋化运动实验确定LST-R1、SW480和Lovo三个细胞株之间转移能力的差异。异质粘附实验的粘附介质用collagenⅣ,细胞浓度为1×10～8/L,37℃、50mL/L CO2孵育1h。趋化运动实验用8μm孔径的transwell小室,趋化因子用NIH3T3细胞培养上清制备,调整细胞浓度为1×10～8/L,按200μL/上室加入细胞悬液,下室每室加500μLNIHSTS细胞培养上清,37℃、50mL/L CO2孵育6h。结果显示,LoVo、SW480和LST-R1三个细胞株基底膜粘附性有差异,F=84.279,P＜0.001。其中,LST-R1粘附细胞数显著少于LoVo（P＜0.001）和SW480（P＜0.001）,LoVo的粘附细胞数多于SW480（P＜0.01）。粘附性强弱顺序为LST-R1＜SW480＜LoVo。同时,这三个细胞株总体运动性有差异,F=48.786,P＜0.001。其中,LST-R1运动性弱于LoVo和SW480（P＜0.001）,SW480运动性弱于LoVo（P＜0.001）。运动性强弱顺序为LST-R1＜SW480＜LoVo。提示LoVo、SW480和LST-R1细胞株的转移潜能存在差异。。 2、基因芯片以一对样本的信号平均值＞2或个＜2而另个＞10;信号值变异系数＜0.33;信号平均值有2倍以上表达差异作为判定基因差异表达的标准。在显著表达上调的基因中与转移相关的基因主要有:发动蛋白2（Dynamin2）、ADP-核糖基化因子1（ARF1）。在显著下调表达的基因中,与转移有关系的有跨膜4超家族成员9（transmenbrance 4 super family 9,TM4SF9）,又称四分子交联体5（Tetraspan-5）。Tspan-5在结肠癌中的表达,为本研究首次报道,选择该基因作为研究对象。 3、基因水平验证基因芯片结果用半定量RT-PCR技术,结果显示Tspan-5mRNA在三个细胞株中的表达水平差异与基因芯片检测结果相符。 4、蛋白水平验证基因芯片结果细胞免疫化学技术定性,免疫印迹技术、免疫荧光技术结合流式细胞仪技术定量研究。结果显示Tspan-5蛋白表达水平差异与基因芯片检测结果相符。 5、临床大肠癌组织样本免疫组化研究:Tspan-5表达水平在正常大肠粘膜和息肉呈低表达或

关键词：大肠癌转移四分子交联体超家族四分子交联体5

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凋亡相关蛋白PNAS-2参与白血病发病机制的研究

凋亡相关蛋白PNAS-2参与白血病发病机制的研究

引用

作者：刘佳上海交通大学

学位级别：硕士

目的和意义：PNAS-2 是一种凋亡相关基因，本实验室初步研究发现其可能参与白血病起病。我们试图通过研究该蛋白在不同细胞中表达量和定位的差异及药物处理前后两者的变化以探寻PNAS-2蛋白参与白血病起病的机制。实验方法和结果： ... 详细信息

目的和意义：PNAS-2 是一种凋亡相关基因，本实验室初步研究发现其可能参与白血病起病。我们试图通过研究该蛋白在不同细胞中表达量和定位的差异及药物处理前后两者的变化以探寻PNAS-2蛋白参与白血病起病的机制。实验方法和结果：第一部分，PNAS-2 单克隆抗体的制备和初步鉴定。根据PNAS-2 一级结构推测二级结构，选取符合条件的肽段作为抗原决定簇，化学合成后和BSA 偶联;通过动物免疫，细胞融合，有限稀释克隆化，腹水扩增获得敏感性高，特异性好的单克隆抗体及分泌稳定的杂交瘤细胞株S-31-7。在Wstern蛋白定量研究及免疫荧光定位研究实验中效果理想，可作为后续实验的可靠工具。第二部分，PNAS-2蛋白在细胞中表达和定位的研究。我们运用上述获得的PNAS-2单抗检测该蛋白在不同细胞中表达量和定位的差异。研究发现PNAS-2蛋白在白血病细胞株中表达量较人类非肿瘤细胞株高，在白血病初发患者的原代细胞中，其蛋白表达较缓解及非肿瘤患者高;且在白血病细胞株及白血病初发、复发患者的原代细胞中，其定位与非肿瘤细胞株及非肿瘤患者原代细胞中的定位有明显差异。第三部分，PNAS-2蛋白抑制白血病细胞凋亡的机制研究。比较U937细胞株中抑制PNAS-2 表达的RNA 干扰组及对照组间凋亡相关蛋白表达差异，探讨其抑制白血病细胞凋亡的机制。Western Blot检测发现，抑制PNAS-2蛋白表达后，细胞株中的GraB，AIF，P53，Rb，caspase3蛋白的表达量均明显上升，说明抑制PNAS-2蛋白的表达有促进细胞凋亡,抑制肿瘤生长的作用。且PNAS-2 通过AIF 介导的非caspase 依赖途径及caspase 依赖途径中的GraB-Perforin 通路抑制细胞凋亡。第四部分，磷酸氯喹对白血病细胞的影响及与PNAS-2蛋白的关系。磷酸氯喹是一种生物膜稳定药物，我们发现其对白血病细胞株有诱导凋亡的作用，并且发现药物处理后细胞内PNAS-2的异常定位能够被纠正，并且表达量也相应减少。白血病患者的原代细胞经同样处理，也可得到类似效果。本文推断，PNAS-2是一种凋亡抑制蛋白，在白血病细胞中可能存在多泡体膜稳定性下降的异常现象，从而使得原本应局限于MVB膜上的PNAS-2发生异常定位及过量表达，其抑制细胞凋亡的作用被放大，最终导致细胞的恶性增殖。结论：PNAS-2蛋白在白血病细胞中存在异常定位和过量表达，其通过MVB途径抑制了细胞凋亡而参与了白血病的起病。磷酸氯喹能够增加MVB膜稳定性，纠正PNAS-2蛋白的异常定位和过量表达，从而促进白血病细胞凋亡，有应用临床治疗白血病的潜在价值。

关键词： NAS-2蛋白白血病发病机制细胞凋亡 PNAS-2蛋白

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Pin1、β-catenin与CyclinD1在肝癌中的表达及意义

Pin1、β-catenin与CyclinD1在肝癌中的表达及意义

引用

作者：敖然中国医科大学

学位级别：博士

目的:\n Pin1是一独特的肽基脯氨酰顺反异构酶，可特异性催化已磷酸化的丝（苏）脯氨酰基序发生顺反异构，从而导致蛋白活性、蛋白间相互作用、蛋白的亚细胞定位及稳定性发生变化。研究显示Pin1在人类多种肿瘤中过表达，是多个致癌... 详细信息

目的:\n Pin1是一独特的肽基脯氨酰顺反异构酶，可特异性催化已磷酸化的丝（苏）脯氨酰基序发生顺反异构，从而导致蛋白活性、蛋白间相互作用、蛋白的亚细胞定位及稳定性发生变化。研究显示Pin1在人类多种肿瘤中过表达，是多个致癌信号通路的关键效应分子。Pin1的过表达和肿瘤的关系越来越引起人们的关注。\n β-连环素(β-catenin)是上皮钙黏素-连环素复合体(E-cadherin/catenin)和Wnt信号传导通路的关键分子，当β-连环素在细胞核内蓄积时，能激活Wnt信号传导通路，启动c-myc、cyclin D1等靶基因转录，导致细胞增殖、侵袭和转移。CyclinD1是细胞增殖周期从G1期到S期的关键蛋白，CyclinD1在G1期到S期的转变中起关键的正向调节作用，因而又被称为原癌基因。细胞周期失控是细胞增殖癌变的重要原因。\n WULF等研究证明，在乳腺癌中，可以检测到Pin1、β-catenin与CyclinD1的过度表达;也有文献指出，在直肠癌和甲状腺癌中可分别检测到Pin1与β-catenin、Pin1与CyclinD1过度表达，并且两者的过表达有相关性。\n 本实验通过免疫组化、Western-blot、RT-PCR、免疫荧光及免疫共沉淀的方法来检测Pin1、β-catenin与CyclinD1在肝癌中的表达及意义。\n 材料与方法:\n 一、.材料\n 24例肝癌及其癌旁正常组织标本均来自中国医科大学附属第一临床医院普外科2005年5月至2007年9月手术切除标本及存档蜡块。其中12例肝癌及其正常癌旁组织新鲜标本冷冻于-80℃冰箱用于Western-blot。人肝癌Be17402细胞株来源于中国医科大学遗传教研室。\n 二、主要试剂和来源\n 实验药品:浓缩型免抗人Pin1多克隆抗体、即用型CyclinD1单克隆抗体、梯度蛋白标准均购自美国Santa Cruze公司;即用型S-P超敏免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、β-action一抗和浓缩型辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。\n 三、质粒及引物\n Pin1的质粒由大连宝生物公司合成并鉴定，β-catenin及CyclinD1的引物由上海生工技术有限公司合成。\n 四、方法\n （一）免疫组织化学染色:检测Pin1、β-catenin与CyclinD1的表达采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化（S-P法）。\n （二）Western-blot检测\n 取新鲜样品（1-2克）加5倍裂解缓冲液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳，转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。结果判定为转印膜上出现清晰的棕色条带。\n （三） RT-PCR\n PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并以EB染色后，采用Gel Doc1000成像系统(Bio2Rad，USA)进行图像扫描和分析。mRNA含量的计算:用图像分析仪对电泳结果进行扫描，测定各条带的A值，将样本条带的积分A值与相应的β-actin mRNA条带的A值相比较，即为样本mRNA的相对含量。\n （四）细胞培养和转染:将bel细胞传代后置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中常规培养，根据细胞生长情况天换液1次，细胞长满后用0.25％胰蛋白酶消化传代，当细胞生长稳定、呈对数生长时进行实验\n （五）免疫荧光:将对数生长期的细胞转染48小时后，用蛋白酶消化，接种于置有消毒盖玻片的孔培养板内，进行免疫共荧光检测。\n （六）免疫共沉淀:用琼脂糖珠法收集裂解细胞蛋白，取上清跑电泳。在19kD和34kD处出现清晰条带，即为有免疫复合物沉淀。\n 统计学方法\n 用SPSS11统计软件包进行统计分析。采用X2检验，确切概率法和相关分析，以P＜0.05为有统计学意义。\n 结果:\n 一、免疫组化结果:\n Pin1在癌旁正常组织中不表达或呈微弱的核表达。在肝癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。CyclinD1在癌旁正常组织中不表达。在肝癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。\n β-catenin在癌旁正常组织中阳性表达定位于细胞膜，胞浆中极少。在肝癌细胞的胞浆和/或胞核内呈异位表达。\n 二、Western-blot结果\n Pin1、 CyclinD1和β-catenin在肝癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织。\n 三、RT-PCR结果\n Pin1、 CyclinD1和β-catenin mRNA在肝癌细胞株中的表达明显高于癌旁正常组织。\n 四、

关键词：肝癌免疫组化 β-连环素相关性

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