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胃癌相关基因表达与Wnt，NF-κB和Stat3信号途径活化的相关性

胃癌相关基因表达与Wnt，NF-κB和Stat3信号途径活化的相关性

引用

作者：韩竞春大连医科大学

学位级别：博士

背景与目的胃癌是我国乃至全球范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一。胃癌的发生具有多阶段性,大致经历了由正常黏膜→癌前病变(慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生)→胃癌(肠型、弥漫型和混合型)的演变过程。同时,胃癌的发生发展涉及癌... 详细信息

背景与目的胃癌是我国乃至全球范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一。胃癌的发生具有多阶段性,大致经历了由正常黏膜→癌前病变(慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生)→胃癌(肠型、弥漫型和混合型)的演变过程。同时,胃癌的发生发展涉及癌基因的表达、抑癌基因的失活以及修复基因的异常,并且与生活饮食习惯相关,其确切的发病机制还不明确。大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室与澳大利亚墨尔本大学癌症研究中心合作,利用基因芯片杂交技术,对胃癌及其相关病变的基因表达谱进行的研究,发现在各类胃癌中存在着一些具有共性的上调基因,即胃癌相对特异性基因。在此基础上,我们对胃癌相对特异性基因按功能加以分类,筛选出一些在肿瘤发生发展的某些过程中具有代表性并起重要作用的基因,包括与细胞生存和增殖相关的c-Myc,与细胞周期调节相关的cyclin D1,参与迁移与转移的CD44和MMP-7,与新生血管形成密切相关的VEGF以及和凋亡逃逸相关的survivin,并对所选择基因在胃癌和癌前病变组织中的表达进行检测,分析这些基因的表达规律,探讨基因表达调控及其在肿瘤治疗学方面的意义。结果发现上述基因在胃癌的发生发展中遵循着相似的动态变化,具有明显的趋同性。此外还发现这些基因的转录均与Wnt信号通路的活化有关,即这些胃癌相对特异性基因均为Wnt通路的靶基因。研究表明,Wnt信号传导通路是一种对细胞增殖和分化等多种功能具有重要调节作用的信号传导系统,包括信号启动、分子传递、靶基因转录活化等几个主要环节,是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系。在多种人类恶性肿瘤中存在Wnt途径的异常。Wnt途径功能的实现依赖于Wnt信号表达上调,导致β-catenin易位于细胞核,与TCF/LEF结合形成复合物,该复合物通过与靶基因启动子区域的TCF/LEF结合区域的序列相作用,解除TCF/LEF对下游靶基因的转录抑制而启动靶基因的转录。我们前期的基因芯片分析和分子病理学检测结果均显示,在胃癌的进展过程中出现了Wnt信号的异常,包括Wnt表达频率的上调,膜上的E-cadherin减少和β-catenin的细胞内聚集,以及出现TCF4和β-catenin的核易位。目前的研究多单独针对Wnt途径的几个关键环节,如Wnt2,或β-catenin,或TCF4等,以其中某个环节的表达来代表整条Wnt途径的活化,而针对Wnt传导通路总体水平的活化状态与胃癌及靶基因表达相互关系的研究尚未见报道。本研究采用石蜡组织芯片技术,应用免疫组织化学染色方法,对Wnt通路的关键环节Wnt2,β-catenin和TCF4在不同病变胃组织中的表达进行检测,并针对同一样本群7种靶基因的表达状态,首次从完整通路角度探讨活化的Wnt传导途径在胃癌中的作用以及与各靶基因表达的相关性。诸多研究表明,基因的转录可以由多个信号通路调控,就Wnt信号的靶基因而言也是如此。研究中发现,所检测Wnt途径的部分靶基因(如survivin、VEGF和c-Myc等)同时也是NF-κB和Stat3信号途径的靶基因。这说明,不同的信号传导通路可以通过调控共同的下游基因表达而在肿瘤发生发展中发挥协同作用。因此,NF-κB和Stat3介导的信号传导通路很有可能在调节上述基因表达方面与Wnt传导通路起协同和互补作用,甚至在胃癌发生的某个(些)阶段扮演更为重要的角色。本课题以胃癌临床术后标本和4个胃癌细胞系作为研究对象,胃癌组织按Lauren法分为肠型胃癌和弥漫型胃癌两个亚型,以癌前病变组织(慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生)为对照,检测利用基因芯片杂交技术所筛选的胃癌相对特异性基因在胃癌和癌前病变组织中的表达,利用同一个肿瘤实验体系检测Wnt, NF-κB和Stat3信号途径的活化状态,分析探讨它们与胃癌相对特异性基因表达的相关性。迄今为止,还没有关于利用一个肿瘤实验体系同时检测这三个信号通路的活化状态及其与一系列下游基因表达相关性的研究报道。阐明这些学术问题可以为胃癌的发病机制、早期诊断、预防乃至治疗方法的选择提供新的依据和思路,具有明显的肿瘤生物学和预防肿瘤学意义。材料与方法胃癌及癌旁组织均选自大连医科大学辽宁省高校癌症基因组学重点实验室/基础医学院生物学教研室建立的人胃癌冰冻组织库。实验所需胃癌细胞系AGS和HGC-27购于美国ATCC(American Type Cell Culture)细胞库。MGC803(人胃低分化粘液癌)和BGC823(人胃低分化癌)从北京肿瘤研究所引进。本研究基于石蜡组织微阵列技术,采用免疫组化、免疫荧光、RT-PCR、Western蛋白印迹分析等方法,在不同病变胃组织和胃癌细胞系中检测所筛选的胃癌相对特异性基因表

关键词：胃癌 Wnt NF-κB Stat3 信号传导靶基因表达

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卡培他滨与放射线照射联合治疗子宫颈腺癌的效果与机制探讨

卡培他滨与放射线照射联合治疗子宫颈腺癌的效果与机制探讨

引用

作者：杨滨中国医科大学

学位级别：博士

前言卡培他滨(capecitabine,CAP)是一种口服型5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)前体类抗肿瘤新药。CAP的药物设计,使其本身无毒无活性,在胃肠道可以原药形式快速吸收,在肝脏和肿瘤组织中三种酶的作用下转化形成5-FU而发挥抗肿瘤活性。... 详细信息

前言卡培他滨(capecitabine,CAP)是一种口服型5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)前体类抗肿瘤新药。CAP的药物设计,使其本身无毒无活性,在胃肠道可以原药形式快速吸收,在肝脏和肿瘤组织中三种酶的作用下转化形成5-FU而发挥抗肿瘤活性。最终5-FU由二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase,DPD)代谢失活。在其转化过程中,胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)是其活化最后一环的一个限制酶,TP的特点在多数实体肿瘤组织中浓度较高,明显高于正常组织。这使得CAP在正常组织中生成5-FU量较少,而在肿瘤组织局部可有高浓度5-FU生成,大大增强了抗肿瘤活性,降低了5-FU对正常组织的毒副作用。因此,CAP全身毒性反应轻且选择性抗肿瘤,是目前口服制剂中唯一能超过静脉给药的氟尿嘧啶类药物,弥补了5FU毒性大用量受限的缺撼。临床上已被用于紫杉醇、阿霉素等耐药的复发转移性乳腺癌及晚期结肠癌等患者的治疗,取得了很好的效果。关于CAP疗效方面的研究,由于TP是CAP选择性作用于肿瘤的关键酶,而成为研究的焦点。人们致力于增加TP的表达来提高CAP的疗效。研究显示,放射可使多种肿瘤组织TP表达明显增高,CAP和放射联合应用无论用于辅助治疗、术前放化疗、还是姑息治疗,均能得到较好的效果,是一种有前途的肿瘤治疗方法。另外研究还发现,DPD在CAP治疗中也发挥着重要作用,TP/DPD的比值更直接的关系到CAP的疗效。提示在化疗之前测定肿瘤相关酶的水平,能选择到更适合接受CAP治疗的人群。子宫颈癌有着较高的发病率,其治疗主要还是以手术和放疗为主,可使部分患者得到根治或缓解,但有部分患者单纯放疗仍然预后不佳。尤其是宫颈腺癌,不如宫颈鳞癌对放射线敏感,临床期别较晚、淋巴结有转移的患者,初始治疗后很快又复发、转移。且其发病还有逐渐增加趋势。因此为改善预后,临床迫切需要探讨对宫颈腺癌更为有效的疗法。近年来新辅助化疗即术前或放疗前进行化疗,确实一定程度上提高了手术或/和放疗的效果。故而寻找对宫颈腺癌更有效的新辅助化疗方案的有关研究出现许多。CAP也已被用于多种人宫颈癌细胞株动物移植模型中进行研究,显示出了一定的抑癌效果,在人宫颈腺癌HeLa细胞株动物移植模型中CAP的抑瘤率可达34.6%。但CAP与放射联合在宫颈腺癌中的作用如何尚未见报道。介于CAP高效低毒的药物特点和5-FU所具有的放射增敏作用,将CAP与放射联合用于宫颈腺癌,效果值得期待。因此本研究采用人子宫颈腺癌细胞株异种移植于裸鼠建立动物模型,观察了CAP和放射线联合治疗在宫颈腺癌中的抗肿瘤效果。并通过放射线照射对宫颈腺癌细胞TP、DPD酶影响的研究,及观察联合治疗后宫颈腺癌细胞周期的变化,对其联合治疗效果的机制进行了探讨。实验材料和方法一、实验材料 1、实验动物:雌性BALB/c nu/nu裸鼠(5或6周龄,体重约20克)约220只。 2、细胞株:人宫颈腺癌CAC-1细胞株从日本札幌医科大学获得,人宫颈腺癌HeLa细胞株由中国医科大学盛京医院感染科实验室提供。 3、主要试剂及药品:CAP由F-Hofmann-Roche(Besle Switzerland)提供。5-FU购买于Kyowa Hakko Co(Tokyo Japan)和上海旭东海普药业公司。培养基(海克隆生物化学制品北京有限公司);0.1mg/ml考马斯亮蓝溶液(进口分装,上海化学试剂采购供应站);牛血清白蛋白(Sigma公司);ELISA法测定TP酶的试剂盒(德国罗氏公司);总RNA提取液Trizol(东胜创新实验技术有限公司);cDNA第一链合成逆转录试剂盒、PCR试剂盒、Taq DNA、聚合酶DNA Marker(大连宝生物工程有限公司);TP、DPD引物(上海Invitrogen英俊生物技术有限公司合成);四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma公司),DMSO试剂二甲基亚砜(北京夏斯生物技术有限公司),碘化丙啶(PI)(sigma公司)。 4、主要实验仪器和设备: 超净工作台(苏州净化设备厂);瓦里安直线加速器2300C/D-SN293(美国);超声粉碎机UP200H(德国);DV600分光光度计(美国);振荡机RS-232(美国);酶标仪GIS-1000 Tanon(上海天能科技有限公司);紫外分光光度仪Wellscan MK3(德国);电泳仪BIO-RADpower/PAC 300(美国);PCR仪PTC-100(美国);凝胶成像分析系统(基因有限公司);流式细胞仪(FACS-440型);Mitsubishi电子射线装置(机型EXL-15DP,4MeV,剂量率5Gy/分)。二、实验方法 1、人宫颈腺癌CAC-1细胞株动物

关键词：卡培他滨放射线子宫颈腺癌氟尿嘧啶胸苷磷酸化酶二氢嘧啶脱氢酶细胞周期裸鼠

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eNOS基因转移联合西地那非对大鼠低氧性肺动脉高压的预防作用

eNOS基因转移联合西地那非对大鼠低氧性肺动脉高压的预防作用

引用

作者：金强中国医科大学

学位级别：博士

本文拟建立大鼠低氧性PH模型，应用携带人类eNOS基因的重组腺病毒AdCMVceNOS基因导入，并联合口服枸橼酸西地那非，通过血流动力学、组织学、生化学、分子生物学等方法，研究腺病毒介导eNOS基因转移联合西地那非，预防急性低氧性肺血管... 详细信息

本文拟建立大鼠低氧性PH模型，应用携带人类eNOS基因的重组腺病毒AdCMVceNOS基因导入，并联合口服枸橼酸西地那非，通过血流动力学、组织学、生化学、分子生物学等方法，研究腺病毒介导eNOS基因转移联合西地那非，预防急性低氧性肺血管收缩(HPV)和慢性低氧性肺动脉高压(CHPH)的可行性、疗效及相关毒副作用，为此法用于临床奠定理论基础，为PH治疗开创出更为安全有效的新方法。研究材料： 1、实验材料：重组腺病毒载体AdCMVceNOS病毒DNA 由Dr Robert Gerard惠赠重组腺病毒载体AdCMVLacZ 东方肝胆医院惠赠pXC1载体加拿大Microbix Biosystems公司腺病毒E1区转化人胚胎肾细胞株293 加拿大Microbix Biosystems公司引物Vt01、Vt02、Vt001和Vt002 Takara公司合成I125-cGMP放射免疫试剂盒上海中医药大学小鼠抗人eNOS单克隆抗体 BD公司一氧化氮试剂盒南京建成生物工程研究所免疫组化试剂盒北京中杉生物技术公司弹力纤维染色试剂盒北京中杉生物技术公司ECL试剂盒北京中杉生物技术公司X-gal(5-溴-4-氯-β-吲哚-p-半乳糖苷) Takara公司枸橼酸西地那非辉瑞制药公司10％氮氧混合气沈阳液化空气有限公司100％氮气沈阳液化空气有限公司。 2、实验设备PCR仪德国BIOMETRA公司N02120MAX21g电子天平 NAVIGATOR公司TDL-40B离心机上海安亭科学仪器有限公司721型分光光度计上海精密科学仪器有限公司GC-2016放射免疫计数器科大创新股份有限公司TKR-200C小动物呼吸机江西特力麻醉呼吸设备有限公司。 3、实验动物Wistar大鼠126只沈阳军区总医院实验动物中心研究方法： 1、第一部分： (1)AdCMVceNOS病毒DNA用脂质体法体外转染293细胞，且在细胞内部包装。经PCR鉴定后在293细胞株内扩增，继而经CsC1密度梯度离心纯化及TCID50法测定滴度。 (2)雄性Wistar大鼠54只，随机分为对照(C)组、Ad-Lacz组和Ad-eNOS组，每组18只。分别应用病毒保存液、5×10<'9>PFU/mlAdCMVLacZ和AdCMVceNOS各600u1经气管导管注入大鼠肺脏。3、5和17天后，每组各取6只，测定HR和血压，并行肺组织X-gal染色、eNOS免疫组化染色、HE染色、eNOS Westemblot检测及cGMP和NO含量测定。转染病毒后5天的大鼠，同时行肝、脾、肾脏的组织化学染色。 2、第二部分：雄性Wistar大鼠36只，随机分为常氧(N)组、低氧(H)组、低氧LacZ(H-LacZ)组、低氧eNOS(H-eNOS)组、低氧西地那非(H-S)组和低氧eNOS-西地那非(H-eNOS-S)组，每组6只。首先经气道转基因(N、H和H-S组应用病毒保存液，H-LacZ组应用5×10<'9>PFU/ml AdCMVLacZ 600μl，H-eNOS和H-eNOS-S组应用5×10<'9>PFU/ml AdCMVceNOS 600gl经气管导管注入大鼠肺脏)。3天后，N组常氧(吸入空气)30min，其它组大鼠急性低氧(吸入10％氧气)30min。H-S和H-eNOS-S组大鼠在低氧前30min，应用0.3％西地那非25mg/kg灌胃，其它组大鼠灌入等量生理盐水(8.33ml/kg)。低氧结束后，测定大鼠体循环血压(SAP)、HR和MPAP，动脉血气分析，检测肺组织cGMP、NO含量。 3、第三部分：雄性Wistar大鼠36只，随机分为常氧(N)组、低氧(H)组、低氧LacZ(H-Lacz)组、低氧eNOS(H-eNOS)组、低氧西地那非(H-S)组和低氧eNOS-西地那非(H-eNOS-S)组，每组6只。首先经气道转基因(N、H和H-S组应用病毒保存液，H-LacZ组应用5×10<'9>PFU/ml AdcMVLacz 600μl，H-eNOS和H-eNOS-S组应用5×10<'9>PFU/ml AdCMVceNOS 600μl经气管导管注入大鼠肺脏)。之后常氧饲养3天，每日灌胃1次。3天后，N组常氧处理(吸入空气)2周，其它组慢性常压低氧处理(吸入10％氧气，每天8h)2周，并于每日低氧前30min灌胃。H-S和H-eNOS-S组应用的灌胃溶液含0.3％枸橼酸西地那非25mg/kg，其余各组灌入等容量生理盐水(8.33ml/kg)。低氧结束后，行血动力学检测、肺血管结构重塑指标检测、右室肥大指标检测、Hct检测，并行肺组织eNOS Westemblot检测及

关键词：肺动脉高压腺病毒介导 eNOS基因转移西地那非联合

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泌乳素对SLE患者外周血单个核细胞共刺激分子及干扰素调节因子-1表达的影响

泌乳素对SLE患者外周血单个核细胞共刺激分子及干扰素调节因子-1...

引用

作者：王娜南方医科大学

学位级别：硕士

选题依据：泌乳素（Prolactin，PRL）是由垂体前叶合成和分泌的一种多肽类激素，其经典作用是调节哺乳动物乳腺、卵巢及男性附属生殖器官的生长和分化过程，促进泌乳。除此之外，PRL的免疫调节作用也日益受到关注。研究表明PRL不仅可以... 详细信息

选题依据：泌乳素（Prolactin，PRL）是由垂体前叶合成和分泌的一种多肽类激素，其经典作用是调节哺乳动物乳腺、卵巢及男性附属生殖器官的生长和分化过程，促进泌乳。除此之外，PRL的免疫调节作用也日益受到关注。研究表明PRL不仅可以调节生理性细胞及体液免疫反应，而且对于病理状态（如自身免疫性疾病）时细胞及体液免疫功能的调节也有十分重要的作用。它的具体作用包括：①参与T细胞分化，调节TH1／TH2平衡向TH1方向偏移；②活化蛋白激酶C和鸟氨酸环化酶；③具有促有丝分裂原的作用，诱导淋巴细胞的IL-12受体表达和各种生长因子相关基因的表达；④通过干扰素调节因子促进干扰素r的表达：⑤刺激自身抗体的产生。淋巴细胞的激活需要双信号系统，第一信号系统为抗原肽MHCⅡ类分子和TCR-CD3组成的复合物，第二信号为共刺激分子，包括CD28／B7（CD80和CD86）分子和CD40／CD40配体（CD154）分子。CD28／B7主要与T细胞活化、增殖及凋亡有关，CD40／CD154主要与B细胞活化、增殖及凋亡有关。系统性红斑狼疮（SLE）是人类自身免疫病的原型，免疫调节异常在其发病中起主导作用，其中包括许多免疫细胞的功能异常。临床研究表明，活动期SLE患者PBMC中CD154的表达明显增加，且与疾病活动性相关。SLE活动期及静止期淋巴细胞上CD28的表达与正常对照组之间差异无显著性，而CD80及CD86的表达水平均明显高于正常对照，且活动组又显著高于静止组，其表达水平与SLEDAI呈正相关。可见共刺激分子CD28／B7和CD40／CD154在系统性红斑狼疮的发生、发展中具有重要的作用。在红斑狼疮模型小鼠，注射PRL加速狼疮小鼠的死亡，而抑制PRL的合成和分泌，则降低小鼠的死亡率。一些临床研究报道SLE患者血清PRL水平升高，且与ANA滴度和临床疾病活动性指标呈正相关，可以推测PRL在红斑狼疮的发病中起重要作用，但其具体的作用机制尚不清楚，是否与共刺激分子的表达有关，这是本研究所要解决的主要问题。研究发现PRL能诱导多样的TCR／CD3复合蛋白快速磷酸化，潜在地影响抗原受体功能，参与细胞活化第一信号过程。目前国内外均未见有PRL在细胞活化第二信号中作用的研究报道，为此我们研究了SLE患者PRL与PBMC表面共刺激分子表达的关系，以期阐明其参与狼疮发病的作用机制。PRL的胞内信号转导途径是近年来的研究热点，目前已经达成共识的是，PRL与PRLR结合形成三聚体后引发以JAK-STAT为主要途径的跨膜信号转导作用，将信息传入细胞核，引起目标基因如干扰素调节因子-1（IRF-1）的转录和表达。IRF-1是一种多功能转录因子基因，属于一个小的转录因子家族，参与多种免疫功能的调节，包括肿瘤抑制、骨髓细胞分化、巨噬细胞激活、抗原提呈、凋亡等，尤其重要的是IRF-1可通过与干扰素（IFN）诱导性基因中顺式作用元件结合而调控Ⅰ型干扰素及其相关基因的表达，而Ⅰ型干扰素及其相关基因的异常表达在SLE的发病中起重要作用。因此本研究对SLE患者中IRF-1基因的表达情况及PRL对其的干预作用也进行了探讨。溴隐亭（BRC）是一种多巴胺2型受体的激动剂，可减少垂体PRL细胞中脱氨核糖核酸和信息核糖核酸的产生，从而抑制垂体PRL细胞的过度分泌，也可抑制外周血循环中PRL的生物活性。目前一些临床研究使用BRC治疗某些自身免疫性疾病，有报道BRC25mg／日可明显减轻SLE病情。SLE患者产后口服BRC可以迅速消除高泌乳素和高雌激素对SLE的负面影响，显著地减少产后SLE病情加重的发生率，而且显著地减少产后1年内激素和免疫抑制剂的用量。我们通过研究BRC对SLE患者PBMC共刺激分子表达的影响，从而探讨其治疗SLE的主要机制。目的： 1．检测女性SLE患者血清PRL水平，分析其与SLE疾病活动性、临床表现及实验室指标的关系； 2．研究PRL对SLE患者外周血单个核细胞（PBMC）表面共刺激信号分子CD40、CD154、CD28、CD86、CD80表达的影响，从而探讨其参与狼疮发病的机制； 3．研究在加入BRC后，SLE患者PBMC表面共刺激信号分子CD40、CD154、CD28、CD86、CD80表达变化，从而证实其治疗SLE的主要机制。 4．研究SLE患者中IRF-1基因的表达情况及PRL对其的干预作用。方法： 1．应用电化学发光仪检测了30例女性SLE患者与20例健康人在清晨静息状态下的血清PRL水平。 2．将样本分以下几组：①高PRL的SLE患者组（N=18

关键词：系统性红斑狼疮泌乳素 CD154 CD86 IRF-1基因

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人巨细胞病毒部分抗原决定簇基因的克隆、表达及初步应用

人巨细胞病毒部分抗原决定簇基因的克隆、表达及初步应用

引用

作者：姜永玮南方医科大学

学位级别：硕士

人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）为疱疹病毒科β属的双螺旋DNA病毒，在世界范围内分布。HCMV不仅是人类先天性病毒感染的主要病原，而且是免疫功能低下人群（艾滋病患者、器官移植者、免疫抑制治疗者等）并发感染死亡的常... 详细信息

人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）为疱疹病毒科β属的双螺旋DNA病毒，在世界范围内分布。HCMV不仅是人类先天性病毒感染的主要病原，而且是免疫功能低下人群（艾滋病患者、器官移植者、免疫抑制治疗者等）并发感染死亡的常见原因之一。由于HCMV感染者通常无症状或无特异性症状，建立HCMV快速、敏感、特异的实验室检测方法并采取早期治疗措施对优生、优育及阻止HCMV的传播具有重要意义。 HCMV感染的检测方法包括病毒分离培养、核酸测定、抗原检测和血清学检测等，每种方法各有优缺点。HCMV原发感染的检测，主要采用血清学方法。HCMVIgM是机体受病毒抗原刺激后最早产生的抗体，是活动性HCMV感染的重要指标之一，因而是检测HCMV感染的常用指标。目前国内存在大量检测血清HCMV IgM的试剂盒，多使用从HCMV感染的人胚肺二倍体细胞中粗提取的完整病毒抗原，各种检测方法对相同血清的检测结果有很大差别，即是符合率较差。其主要原因为：1．病毒抗原的制备及纯化方法各不相同；2．提取物中含有多种抗原成分，很难进行标准化：3．制备抗原所需的HCMV要在人胚肺细胞中培养，此细胞的蛋白可能对制备的抗原产生污染；4．疱疹病毒有共同抗原，完整的HCMV抗原可以与其它非HCMV病毒感染产生的抗体发生交叉反应。由于病毒来源的抗原存在敏感性、特异性、标准化等问题，将通过基因工程方法获得的表达产物作为检测用抗原已引起各国学者重视。国内外研究工作者对人巨细胸病毒的一些抗原决定簇进行了免疫原性和特异性研究，期待能够应用于人巨细胞病毒感染的早期诊断。其中gp52（UL44）、pp150（ppUL32）、pp65（ppUL83）、ppUL80a均为强免疫原性蛋白且具有保守的DNA序列，能够特异性识别HCMV IgM抗体。因此，本研究选择HCMV gp52（UL44）、pp150（ppUL32）、pp65（ppUL83）、ppUL80a抗原性好、特异性强的部分基因片段作为目的基因，应用基因工程技术，得到高效表达的目的工程菌，并对表达产物进行了抗原性研究。此次研究从HCMV感染的细胞上清液中提取HCMV基因组，本试验用PCR方法从基因组中扩增获得pp150 aa595-614（A）、pp150 aa1006-1042（B）、gp52aa202-434（C）、pp65 aa297-510（D）、ppUL80a aa117-373（E）氨基酸之间的多肽片段的编码基因，用重组PCR的方法将前三个片段重组为新的DNA片段（F），将D、E、F片段分别克隆至pMD-18T载体测序，核苷酸序列分析证明了PCR扩增目的序列的正确性。测序正确的片段克隆至原核表达载体pGEx-4T-1。构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后成功表达了上述三种蛋白，分别命名为GST-ppUL83、GST-ppUL80a、GST-LINK。通过Western blotting检测其免疫特性，结果显示三种蛋白均能被羊抗人巨细胞病毒多克隆抗体及HOMV IgM阳性血清特异性识别，而载体蛋白与多克隆抗体及阳性血清并不能发生反应，证明这三种蛋白具有良好的抗原特异性，可期待应用于人巨细胞病毒感染的诊断。经蛋白电泳分析表达产物主要以包涵体的形式存在，根据这三种蛋白不同的理化特性，采用不同的方法进行蛋白纯化，获得了较好的纯化效果。时间分辨荧光免疫分析（Time-resolred fluoroimmunoassay，TRFIA）是上世纪八十年代兴起的一种新型非放射性标记技术，TRFIA巧妙利用镧系元素的荧光特点，克服了普通荧光检测中背景荧光强度大、干扰强的缺点，使强特异性荧光和背景荧光分辨开，几乎可以完全消除背景荧光的干扰，提高了检测的灵敏度。与现在广泛使用的放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、化学发光免疫分析（CLIA）、电化学发光免疫分析（ECLIA）相比，具有灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染、对标记物分子生物活性影响小、多标记等优点，现已成为生物学研究和临床超微量生化检验中一项颇有发展前景的分析手段。为分析本实验所表达纯化的三种目的蛋白与HCMV IgM的反应能力，将目的蛋白及Microbix Biosystems公司的完整病毒裂解抗原CMV grade2 antigen，运用捕获法TRFIA检测已知HCMV IgM阳性及阴性的血清，两种反应结果进行直线相关分析。分析结果显示，三种目的蛋白单独应用检测血清的结果与完整裂解抗原的检测结果呈正相关，但效果不甚理想（rs分别为0.947，0.879，0.95

关键词：人巨细胞病毒抗原决定簇基因 IgM 检测表达时间分辨荧光免疫分析技术

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Cathepsin L与人腰椎间盘退变关系的研究

Cathepsin L与人腰椎间盘退变关系的研究

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作者：智春升中国医科大学

学位级别：硕士

组织蛋白酶L与人腰椎间盘退变关系的研究前言人类椎间盘退变开始很早，并且是引起后背痛和神经并发症的最主要的原因。但关于椎间盘退变的病理过程我们还知之甚少。最近研究表明蛋白水解酶在椎间盘组织的破坏过程中起作用。除基质金属... 详细信息

组织蛋白酶L与人腰椎间盘退变关系的研究前言人类椎间盘退变开始很早，并且是引起后背痛和神经并发症的最主要的原因。但关于椎间盘退变的病理过程我们还知之甚少。最近研究表明蛋白水解酶在椎间盘组织的破坏过程中起作用。除基质金属蛋白酶（MMPs）外，组织蛋白酶（Cathepsins）也是能够降解胶原和粘蛋白的蛋白水解酶。已有研究表明Cathepsins在骨性关节炎和类风湿关节炎的关节软骨的破坏过程中起作用。然而，关于Cathepsins在椎间盘退变中的作用的研究还较少。本次试验采用免疫组织化学S-P法和逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测人腰椎间盘细胞Cathepsin L蛋白表达，研究Cathepsin L与人腰椎间盘退变的关系。实验对象实验所用间盘取自术中（2005年1月至2005年12月在中国医科大学附属第一医院骨科手术治疗的患者），退变组25例（腰椎间盘突出症患者，男11例，女14例，23～68岁。）；并根据术中所见将腰间盘突出分为非包含型组（11例）和包含型组（14例）；对照组间盘5例（胸腰段骨折行前路手术患者，取手术中切除的间盘组织，并经MRI T2加权间盘信号改变程度验证其为正常间盘，男3例，女2例，21～32岁）。实验方法一、HE染色组织学观察 4μm石蜡切片经脱蜡至水，苏木素浸染10分钟，蒸馏水15分钟，而后伊红染色数秒钟，显微镜下观察。二、免疫组织化学S—P法检测椎间盘细胞Cathepsin L的蛋白表达 4μm石蜡切片脱蜡至水；用体积分数3％的H2O2室温孵育10分钟，封闭内源性过氧化氢酶；P B S浸泡冲洗3次，每次4分钟；5％正常山羊血清室温孵育20分钟封闭非特异性染色；滴加兔抗人Cathepsin L单克隆抗体适量，4℃过夜；P B S浸泡冲洗3次，每次4分钟，滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃20min；DA B显色，麦氏苏木素轻度复染，封片后显微镜观察。三、逆转录—聚合酶链式反应（R T—P C R）检测Cathepsin L基因mRNA转录水平美国Medline国立图书馆基因库检索基因，应用电脑软件primer 5.0版自行设计Cathepsin L引物，北京三搏远志生物技术有限公司合成。上游：5′-CAA CCAAGG CTT TGA GAT-3′；下游：5′-TCC AAG GGA GTG TTC AGG-3′。Cathepsin L预计扩增片段为366bp，并选用β肌动蛋白（β—actin）为参照物，半定量检测Cathepsin L基因转录水平。（1）提取总R N A。（2）R N A含量及纯度测定。（3）逆转录反应合成cDNA，反应条件为：65℃1min→30℃5min→15-30min内匀速升温至65℃→65℃30min→98℃5min→5℃5min。（4）P C R反应扩增，反应条件为：①94℃3 min→②84℃45sec→③56.7℃1min→④72℃1min→⑤72℃7min②-④循环35次。（5）P C R产物于2％琼脂凝胶电泳，Kodak电泳凝胶图像分析系统下观察、摄像及扫描分析。以Catepsin L基因条带的吸光度容积与β—actin条带的吸光度容积的比值作为目的基因的mRNA的相对含量。四、统计分析利用SPSS 10.0 For Windows统计软件进行χ2检验及t检验，比较退变组和对照组、非包含型组和包含型组样本间盘细胞Cathepsin L阳性率及CathepsinL基因mRNA转录水平差异是否有统计学意义。实验结果一、HE染色组织学观察在退变组间盘中，各标本均表现出一定的退变特征：纤维环原有的板层结构紊乱，细胞数量减少，失去原有软骨细胞形态，常有多个细胞被晕轮环绕，部分细胞浆成分极少。二、免疫组织化学S—P法检测椎间盘细胞Cathepsin L的蛋白表达 Cathepsin L阳性染色定位于细胞浆。在对照组间盘中，多数样本CathepsinL阳性细胞率低；但是个别样本阳性细胞率较高。在退变间盘中，多数样本Cathepsin L阳性率较高，但也有个别样本阳性细胞率较低，在非包含型组与包含型组相比有较高的Cathepsin L阳性细胞率。三、逆转录—聚合酶链式反应（R T—P C R）检测Cathepsin L基因mRNA转录水平 Cathepsin L基因mRNA转录水平在对照组中均较低；退变组中均有较强表达。在非包含

关键词：椎间盘退变组织蛋白酶

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重组葡激酶的临床研究及新剂型研制

重组葡激酶的临床研究及新剂型研制

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2003年7月8月，中国食品药品监督管理局(SDA)批准了由中国科学院上海植物生理研究所(简称植生所)与成都金鹏生物技术有限公司(简称金鹏公司)研制的溶血栓创新药物(新生物制品第一类)-“注射用重组葡激酶”的新药注册，颁发了新药证书。... 详细信息

标准号: 0800490029

2003年7月8月，中国食品药品监督管理局(SDA)批准了由中国科学院上海植物生理研究所(简称植生所)与成都金鹏生物技术有限公司(简称金鹏公司)研制的溶血栓创新药物(新生物制品第一类)-“注射用重组葡激酶”的新药注册，颁发了新药证书。全世界第一个“注射用重组葡激酶”基因重组创新药物在中国诞生，研究者率先注册了以汉字命名的生物制品的新药，并首先制定了新药的质量标准和使用说明书。该项研究已获得多项中国发明专利，是一个有完全自主知识产权的研究成果。该药的临床试验是由北京协和医院和南京医科大学第一附属医院作为研究负责单位，并由中国人民解放军总医院、北京大学第一、第三临床医学院等国内15家重点医院参加研究，经过I、II期临床及对照试验、开放试验，历经六年时间，完成了300多例临床病例，经国家药监部门对试验结果的综合评价，证明该药是治疗急性心肌梗塞的安全有效的药物。创新--是技术研发的灵魂，正是由这一理念驱使，该项目的研究者们完成了第一阶段研制工作，取得了阶段性的重大成果。由于重组葡激酶有较广泛的临床应用前景，所以研究工作还在继续进行，研究单位将认真总结经验，继续走创新之路，争取研究工作取得更大成果。现将项目概况简介如下：1、药物的应用现状及前景在各种疾病中，血栓病是一种危及生命的疾病，死亡率较高。急性血栓病大致可以分为两类：一类是急性心肌梗塞，另一类是脑梗塞。据统计，国内急性血栓病年平均发病率为64.55人/10万人，心肌梗塞平均发病率为42人/10万人；而国内脑梗塞年平均发病率为216.6人/10万人，与发达国家相比，中国急性血栓病的发病率在世界上处于发展中国家水平，还比较低，但分布不平衡，北方大城市已接近发达国家的发病率。而且随着营养状况的改善，以及城市化进程的加速，发病率呈增长趋势，根据预测，年均增长率可达到5%左右。国外有关r-Sak研究文献仍在陆续发表，主要集中在新的临床适应症的研究以及降低免疫原性和长效剂型的研究方面，其结果对r-Sak的广泛的临床应用前景的评价是肯定的。据研究证实，其原因也是由于溶栓后的血栓残片由微血管再向主血管倒流形成的，因此临床上需要治疗微血管血栓的药物。此外，r-Sak具有高稳定性、长半衰期、易于制备及生产成本低等特点，可以通过改变给药途径或方法，使r-Sak适用于多种血拴病的临床治疗。还可以通过改构新的剂型，使其成为无抗原、长效型的具有保健功能的药品，用于心脑血管及其他血拴病的预防性治疗，该药将有很好的临床应用前景。新的临床适应症的研究以及新剂型的制备及临床前研究工作正在进行。2、项目的产业化情况1996年12月，技术方(四方股东)与通化鸿淘茂药业有限公司联合组建了项目的产业化公司--通化玉金药业股份有限公司，合资公司注册资金3亿元人民币，技术资产作价1.2亿元人民币投资入股。这次资产重组为项目的产业化和临床研究打下了很好的基础。产业化公司经过历时六年的建设和管理经营，r-Sak的生产车间已竣工并投入试运行，使用的生产设备及辅助设施均为九十年代世界上的先进产品，从1999年试运行至今，生产的多批药品通过国家药检所检定后，用于临床试验证明完全符合质量标准。企业已通过国家GMP认证的预检，一旦通过正式认证，即可投入大规模生产。3、国家及各级政府部门的支持该项目的研究开发得到了国家科技部、国家经贸部、中国科学院、上海市政府、四川省政府和吉林省政府等国家部门和地方政府给予的政策、资金方面的大力支持。在产品的申报审批过程中也得到了国家食品药品监督管理局及所属部门的大力支持。在临床前研究、I期临床、Ⅱ期临床第一阶段、开放试验以及试验药品检定等审批和检定工作中，药品审批的有关部门都是用加快审批的程序进行工作，技术审评及行政审批的高效率大力支持了研究工作。R-Sak的研究从开题、试验室基因克隆及表达、中试研究、临床前研究、I、II期临床及开放试验，到批准新药注册，取得新药证书，整整花费20多年时间，耗资近数千万元人民币，30多个科研单位和大学中的约150多名科研人员先后参加了研究工作，所形成的论文及文献约40余篇，各种文件、资料总共近100万字。这些数字表明，创新药物的研究之路是漫长而艰难的，是需要各个学科的密切合作，是要付出大量艰辛的科研劳动，克服各种困难，排除干扰，并需要具有长时间忍耐寂寞的毅力，只有这样才能完成创造性的研究工作。研究工作还在进行，课题组将认真总结经验，继续走创新之路，争取研究工作的更大成果，为中国创新药物的研究事业和人类的健康事业作出应有的贡献。

关键词：注射用重组葡激酶基因重组药物急性心肌梗塞治疗

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小干扰RNA靶向VEGF基因在体内外抑制乳腺癌细胞增殖的研究

小干扰RNA靶向VEGF基因在体内外抑制乳腺癌细胞增殖的研究

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：张淑华葛银林青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double strands RNA,dsRNA)分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程。本研究采用化学修饰的siRNA在体内外抑制VEGF基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术在乳腺癌基因治疗的可行... 详细信息

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double strands RNA,dsRNA)分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程。本研究采用化学修饰的siRNA在体内外抑制VEGF基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性。选用阳离子脂质体 Lipofectamine2000TM作为转染试剂,将针对人VEGF基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA) 转染人类乳腺细胞株MCF-7和裸鼠移植瘤,在体内外诱导RNAi。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT) 法,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),蛋白印迹试验等检测siRNA治疗组和对照组VEGF基因表达及细胞增殖变化。体外实验结果显示:靶向VEGF基因 siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,细胞生长抑制率达52．5%;VEGF的mRNA和蛋白表达水平显著降低(p<0．01);裸鼠体内实验结果显示:siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;RT-PCR结果同时表明治疗组VEGF表达下调。体内外对照组各指标无显著变化。化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功下调靶基因VEGF的表达,抑制MCF-7细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法。

关键词： RNA干扰 siRNA MCF-7细胞血管内皮生长因子基因治疗

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CoCl<,2>对神经型一氧化氮合酶表达的作用及其调控机制研究

CoCl<,2>对神经型一氧化氮合酶表达的作用及其调控机制研究

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作者：李光宇中国医科大学

学位级别：博士

目的:缺血性脑损伤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率，致残率和复发率极高。对其深入研究具有重要的理论和临床应用价值。神经细胞对缺血十分敏感，神经系统很多的疾病的发生，发展和缺血过程相关。在神经外科疾病的治疗中缺血... 详细信息

目的:缺血性脑损伤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率，致残率和复发率极高。对其深入研究具有重要的理论和临床应用价值。神经细胞对缺血十分敏感，神经系统很多的疾病的发生，发展和缺血过程相关。在神经外科疾病的治疗中缺血和低氧也是影响病人预后的重要因素之一。神经型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)最早发现于大鼠的小脑组织，现已被证明广泛的存在于神经系统中，在维持神经元的功能如神经递质的传递，神经元发育，突触塑形，调节基因表达等方面发挥重要的作用，同时参与许多神经系统疾病的病理过程。除了神经系统外，还在其他很多组织如骨骼肌，肺，肾脏中发现了nNOS的表达。nNOS在体内具有多样而复杂的功能，它的基因结构和表达调节也十分复杂。一氧化氮合酶尤其是神经型一氧化氮合酶在神经系统缺血过程中起到重要作用。但是现在对它在神经系统缺血中的作用和调控的研究存在较大的分歧。我们的研究拟通过低氧化学模拟物CoCl2刺激神经母细胞瘤SK-N-SH，进而探讨nNOS在模拟低氧条件下的表达情况和调控机制。预适应是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护现象，在多种动物的心脏，肝、肾和脑等多种组织、器官和细胞中都发现了这种机制的存在，其中在心脏和脑中这种现象受到特别的关注。有研究认为nNOS在低氧预适应中起到重要作用，我们拟通过低氧的化学模拟物CoCl2刺激神经母细胞瘤SK-N-SH建立预适应模型，进而研究nNOS在低氧预适应中的作用，并对其预适应的机制进行初步研究。材料与方法:1.实验材料：RNA提取试剂TRIzolReagent购自GIBCOBRL，逆转录试剂盒购自Promega，Real-timePCR试剂盒购自Takara，一氧化氮荧光染料DAF-Ⅱa购自Anxora，Real-timePCR相关引物和探针购自上海博亚生物技术有限公司，人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH购自中国科学院上海细胞生物研究所，PCR产物纯化试剂盒及柱离心胶回收纯化试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自MERCK公司产品，琼脂糖购自Promega公司，载体连接系统pMD18-TVector购自Takara公司，PGL3-basic报告基因载体购自Promega公司，γ-32pATP购自北京福瑞德公司，双重荧光素酶报告基因检测试剂盒购自promega公司，抗体购自Santacruz公司。 2.实验方法：以CoCl2为低氧的模拟刺激刺激人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH，提取RNA，进行Real-timePCR定量分析nNOSmRNA的表达情况。以荧光染料DAF-ⅡA检测在刺激后NO产生情况;Western-blot方法分析在刺激后nNOS蛋白的表达情况。设计探针，以同位素标记，以EMSA的方法检测nNOSExon1f启动子区域的低氧反应元件(HRE)和C/EBPα反应元件的活性，并以ChIP的方法验证。构建PGL3-basic荧光素酶报告基因表达载体，在CoCl2的刺激下检测其报告基因的表达，鉴定反应元件的活性。以CoCl2为低氧的模拟刺激对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH进行预适应刺激，以无血清模拟低氧刺激，MTT法检测细胞增殖，流式细胞方法检测细胞凋亡。提取RNA，进行RT-PCR分析nNOSmRNA和BCL-2，Apaf-1的表达情况。结果:***2刺激对SK-N-SH细胞nNOS基因表达的影响：Real-timePCR检测结果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中nNOS的表达升高，并且呈时间和剂量依赖性。DAF-ⅡA荧光染料分析表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中NO的含量升高，在应用了nNOS特异性拮抗剂7-NI后可以使NO的含量下降，表明了在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中NO的含量升高至少有一部分来源于***-blot结果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中nNOS的蛋白表达增高，而7-NI可以拮抗这种作用。 ***1f启动子区域低氧反应元件HRE的鉴定：EMSA的结果显示nNOSExon1f启动子区域的HRE可以和转录因子HIF-1α结合。ChIP结果表明在CoCl2的刺激下HIF-1α和该HRE的结合增强。pGL3荧光素酶报告基因的检测结果表明在CoCl2的刺激下含HRE的启动子活性增加60％。 ***1f启动子区域C/EBPα反应元件的鉴定：EMSA的结果显示nNOSExon1f启动子区域的C/EBPα结合位点可以和转录因子C/EBPα结合。ChIP结果表明在CoCl2的刺激下HIF-1和该C/EBPα反应元件的结合增强。pGL3荧光素酶报告基因的检测结果表明在CoCl2

关键词：神经型一氧化氮合酶低氧诱导因子 CCAAT增强子结合蛋白低氧预适应

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低氧诱导因子1α（HIF-1α）在喉鳞癌中的表达及其临床意义的研究

低氧诱导因子1α（HIF-1α）在喉鳞癌中的表达及其临床意义的研究

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作者：宋冬梅河北医科大学

学位级别：博士

缺氧是人类和动物实体肿瘤的一个共同特征。低氧诱导因子1a(hypoxiainduciblefactor1α，HIF-1α)是机体在低氧条件下产生的一转录活化因子，它能指导多种低氧反应基因的转录，为机体适应低氧，维持内环境稳态的一个重要因素。当周围环... 详细信息

缺氧是人类和动物实体肿瘤的一个共同特征。低氧诱导因子1a(hypoxiainduciblefactor1α，HIF-1α)是机体在低氧条件下产生的一转录活化因子，它能指导多种低氧反应基因的转录，为机体适应低氧，维持内环境稳态的一个重要因素。当周围环境的氧浓度下降时，HIF-1α表达增加，并且其表达增加表现在多个水平上，包括转录和蛋白等水平，但主要是蛋白水平明显增多。HIF-1α是HIF-1的一个亚基，是唯一的氧调节亚单位，HIF-1α的活性是HIF-1的决定性成分，其活性对维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管形成以及促进肿瘤的增殖生长、侵袭和转移起着重要作用，并受多种因子的调控和影响。在多种恶性肿瘤中都存在HIF-Ⅰα蛋白的过表达，并与预后不良密切相关。HIF-1α与肿瘤的关系已成为近年来肿瘤学研究中的一个新的热点。有关HIF-1α与喉鳞癌发生发展关系的研究，目前国内尚未见报道。本实验首先从人喉鳞癌实体瘤入手，应用免疫组织化学技术了解缺氧诱导因子1α(HIF-1α)极其相关调控因子与喉鳞癌生物学行为的关系;进而通过体外细胞培养，从分子水平探讨低氧条件下，缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及其相关调控因子在头颈肿瘤中的表达及相互作用机制，进一步明确HIF-1α与化疗抵抗的关系;在此基础上进行靶向HIF-1α活性及表达的实验，深入探讨以缺氧为靶点对治疗头颈肿瘤及化疗增敏的潜在临床价值。方法： 1HIF-1α在喉鳞癌中的表达及其与喉鳞癌生物学行为的关系。标本选自河北医科大学病理教研室2001年1月1日-2004年12月31日术前未经治疗的喉声门上型癌、喉咽癌病人63例标本，其中男59例，女4例;中位年龄56岁(43～72岁)。根据国际抗癌协会(UICC)标准(1997)确定TNM分期。喉癌分型：喉声门上型癌42例，喉咽癌21例;临床分期：Ⅰ期8例Ⅱ期11例、Ⅲ期14例、Ⅳ期30例;病理学分级：鳞癌Ⅰ级15例，鳞癌Ⅱ级29例、鳞癌Ⅲ级19例;病理证实颈部淋巴结转移组41例，无转移组22例。取癌旁正常粘膜组织20例作为对照。所有标本均一部分迅速置于液氮罐中保存，一部分标本离体后2小时内放入10％中性福尔马林中固定24小时，石蜡包埋，常规病理HE染色，所有标本均经两位副高以上职称的病理科医生确定病理性质和病理学分级。肿瘤组织均病理证实为鳞状细胞癌，喉癌旁正常粘膜病理为正常喉组织。 1.1免疫组织化学染色方法对喉鳞癌63例标本进行检测，其中病理证实颈部淋巴结转移组41例，无转移组22例。取癌旁正常粘膜组织20例作为对照。指标为HIF-1α、VEGF、P53。结果判定：每例标本以400倍光镜下随意选取10个视野，计数每个视野中100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均数求其阳性百分率作为结果。平均阳性细胞所占比例≤5％判定为阴性，阳性染色细胞＞5％判定为阳性。 1.2流式细胞仪对转移组患者的原发灶、淋巴结转移灶以及非转移组标本检测HIF-1α、VEGF、P53蛋白表达进行定量分析，取石蜡标本切片(40μm厚)，网搓法制备单细胞样品。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底对照和阴性对照。采用美国BeckmanCoulter公司生产地Epics-XLⅡ型流式细胞仪进行检测。以荧光指数(FI)表示蛋白表达产物的相对含量，FI=(瘤细胞表达的平均荧光强度/正常对照样品平均荧光强度)。荧光指数(FI)可相对客观的反映蛋白的表达程度。 1.3用TrizolReagant进行组织总RNA提取，采用RT-PCR试剂盒对提取的总RNA进行RT-PCR反应，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在紫外凝胶投射分析系统中照相分析，分别比较HIF-1αmRNA在喉鳞癌组织和癌旁正常粘膜组织中的表达水平，分析其基因表达调控水平。 2低氧对喉鳞癌细胞系Hep-2HIF-1α及其相关基因表达的影响：人喉鳞癌细胞Hep-2分成3组：缺氧12h组、缺氧24h组及对照组。缺氧组分别在缺氧条件下(37℃，5％CO2，2％O2饱和度)培养12h和24h，对照组置于正常氧浓度条件下(37℃，5％CO2、21％O2饱和度)培养24h。流式细胞仪分别测定3组细胞周期及HIF-1α、突变型P53、VEGF表达，免疫组织化学SP法分别测定3组细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、P53、VEGF表达。RT-PCR检测各组细胞HIF-1αmRNA的表达水平。结果： 1HIF-1α在喉鳞癌中的表达及其与喉鳞癌生物学行为的关系。 1.1免疫组化染色结果显示(1)HIF-1α蛋白在癌旁正常喉黏膜中几乎无表达，在喉鳞癌组织中主要于细胞胞浆中可见致密浓染的棕色颗粒，部分切片显示其在胞浆及胞核中均有表达。(2)有

关键词：低氧诱导因子-1α 喉鳞癌免疫组织化学化疗抵抗化疗增敏体外低氧实验

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