检索结果-内蒙古大学图书馆

中国疼痛医学杂志 2019年第4期25卷 243-250页

作者：郭佳宝陈炳霖朱毅宋歌彭梦思陈佩杰王雪强上海体育学院运动科学学院上海200438 徐州医科大学医学技术学院徐州221004 郑州大学附属第五医院肌骨疼痛康复科郑州470000

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)的分子机制尚未完全阐明。近年来,有证据表明微小RNA (microRNA, miRNA)在NP的发生和发展中扮演重要角色。本文对外周神经损伤所致NP的mi RNA调控作用及机制研究进行综述。NP动物模型能诱导背根神... 详细信息

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)的分子机制尚未完全阐明。近年来,有证据表明微小RNA (microRNA, miRNA)在NP的发生和发展中扮演重要角色。本文对外周神经损伤所致NP的mi RNA调控作用及机制研究进行综述。NP动物模型能诱导背根神经节、脊髓背角、海马及前扣带皮层中的mi RNA出现差异性表达;mi RNA在NP中的作用机制可能涉及到神经炎症反应、突触可塑性、神经元兴奋性和DNA甲基化。今后mi RNA及其靶基因有望作为预防和治疗外周神经损伤所致NP的潜在生物标记和治疗新策略。

关键词： miRNA 外周神经损伤疼痛表观遗传调控

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BACH1-CXCR4通路在结肠癌中的作用及机制研究

BACH1-CXCR4通路在结肠癌中的作用及机制研究

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作者：朱国栋南方医科大学

学位级别：博士

研究背景及目的:结肠癌(colon cancer)是常见的消化道恶性肿瘤,半数以上由腺瘤癌变而来,其发生发展是一个多阶段、多步骤逐步演变的过程。目前具体病因尚未明确,传统上是以手术切除为主、联合化疗、放疗、生物靶向的综合治疗。由于存在... 详细信息

研究背景及目的:结肠癌(colon cancer)是常见的消化道恶性肿瘤,半数以上由腺瘤癌变而来,其发生发展是一个多阶段、多步骤逐步演变的过程。目前具体病因尚未明确,传统上是以手术切除为主、联合化疗、放疗、生物靶向的综合治疗。由于存在细胞异质性,50%以上的结肠癌患者在根治术后仍出现复发、转移。进一步研究结肠癌的致病机制,为预防结肠癌的发生及改善预后具有重要的意义。转录因子BACH1(BTB and CNC homology 1)是一种血红素结合蛋白,广泛存在于哺乳动物的各类组织中,它参与调节血红蛋白平衡、氧化应激反应、调节细胞周期、抑制HO-1的表达。有研究表明,BACH1的低表达可以减少肠道、胰腺和心血管疾病的氧化损伤,BACH1参与癌症特别是乳腺癌的发病。Mohammadzadeh等发现敲除BACH1基因可降低CXCR4等在乳腺癌细胞的表达水平及侵袭性,被认为是治疗乳腺癌的潜在靶点。目前为止,BACH1在人类结肠癌中的作用及机制尚未得到阐明。CXCR4:是G蛋白偶联受体,在体内参与包括造血、发育、肿瘤转移、病毒感染等多种生理过程。有研究发现,CXCR4在正常黏膜、结肠息肉、结肠癌及癌转移灶中的表达水平依次增高,且在结肠癌中表达水平的高低,与肿瘤的恶性程度成正比。本研究探讨BACH1在正常组织和结肠癌中表达的差异,分析不同临床病理特征下BACH1表达与患者预后的相关性,通过构建体内、体外实验分析BACH1的功能,研究BACH1-CXCR4通路在人体结肠癌中的作用。方法:为分析BACH1表达水平与结肠癌患者临床特征及预后的关系,利用肿瘤基因图谱TCGA数据库,纳入192例结肠癌组织和mRNA序列,检测BACH1在mRNA水平的表达,并进行生存分析。并在90例结肠癌组织及90例正常对照组中采用免疫组化法观察BACH1的表达情况。构建BACH1沉默及过表达的HCT116细胞株,进一步观察其增殖、迁移和侵袭能力等细胞功能。采用稳转的BACH1过表达的HCT116细胞株,构建裸鼠的皮下移植瘤模型,观察移植瘤的生长速度,检测CD31、Vimentin的表达情况,评价肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。采用蛋白质印迹、免疫组化法检测CXCR4,探讨BACH1和CXCR4的可能相关性,双荧光素酶报告系统确认BACH1直接调控的靶基因。1.免疫组织化学分析BACH1在临床结肠癌组织芯片中的表达情况。利用统计学方法,分析TCGA数据库中BACH1表达水平与结肠癌患者的临床特征和预后的相关性,通过生存曲线分析及Cox回归分析研究BACH1的表达与总体生存率的关系及是否可作为预后的预测因子。2.构建BACH1抑制表达和过表达的HCT116细胞株,细胞功能实验分析BACH1对结肠癌细胞功能的影响,以及靶基因CXCR4能否回复BACH1对结肠癌细胞引起的效应。***1过表达HCT116细胞株接种至裸鼠皮下组织构建皮下移植瘤模型,用于分析BACH1在体内对结肠癌成瘤的影响。4.免疫组织化学分析裸鼠皮下肿瘤组织中CD31及Vimentin的表达情况。蛋白质印迹法检测裸鼠皮下肿瘤细胞中CXCR4的表达情况。5.双荧光素酶报告系统确认BACH1转录调控的靶基因。结果:1.组织芯片免疫染色分析显示BACH 1在结肠癌组织标本中的表达水平远高于良性结肠组织,高表达的BACH 1与增强的肿瘤浸润及性别显著相关,具有统计学意义(P=0.028;P=0.014)。TCGA数据库分析发现BACH1表达水平与年龄、CEA水平、MSI状态显著相关(P=0.025;P=0.015;P=0.006)。***-Meier法和Log rank法分析结果显示高表达BACH1与结肠癌患者不良预后相关(P=0.015)。COX回归模型单因素和多因素分析显示,BACH1是结肠癌患者总生存的独立预测因子(P=0.049)。***1能显著促进HCT116细胞株的迁移和侵袭能力(P<0.01),干扰CXCR4表达能显著抑制BACH1过表达诱导的结肠癌细胞迁移和侵袭(P<0.01)。4.裸鼠皮下移植瘤实验结果显示过表达BACH1的HCT116细胞形成了明显较大的肿瘤结节,移植瘤的生长速度加快(P<0.01);同时BACH1过表达CD31血管数量及Vimentin蛋白表达量显著增加(P<0.01),表明BACH1可促进肿瘤的生长、血管生成和侵袭。5.蛋白质印迹和免疫组织化学结果显示,在结肠癌中BACH1 的表达与CXCR4呈正相关。6.双荧光素酶基因报告实验结果显示,与对照组比较,BACH1显著升高了携带PGL3-CXCR4序列的报告载体的活性(P<0.01),表明BACH11对CXCR4的调控作用是具有特异性的,检测位点确实是BACH1的结合位点。结论:***1在结肠癌中起促癌作

关键词：结肠癌 BACH1 CXCR4 增殖转移

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HOXD--AS1在体内通过ERK/Ras信号通路促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭

HOXD--AS1在体内通过ERK/Ras信号通路促进宫颈癌细胞增殖、迁移和...

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作者：胡玉崇南方医科大学

学位级别：博士

目的：　　宫颈癌发病率居女性癌症人数的第二位，仅次于乳腺癌，具有较高的发病率和死亡率。寻找新的治疗靶点和预后标志物是提高宫颈癌患者生存率的迫切需要。许多长非编码RNAs(lncRNAs)是各种生物过程中的关键调节器，它们的异常表... 详细信息

目的：　　宫颈癌发病率居女性癌症人数的第二位，仅次于乳腺癌，具有较高的发病率和死亡率。寻找新的治疗靶点和预后标志物是提高宫颈癌患者生存率的迫切需要。许多长非编码RNAs(lncRNAs)是各种生物过程中的关键调节器，它们的异常表达与宫颈癌进展的密切相关。　　近年来，随着小非编码RNA研究的深入以及人类基因组学的不断发展、完善，大量长片段的非编码RNA通过深度测序及高通量芯片技术被人们所发现，他们在生命活动中的重要意义也逐渐得到揭示。长链非编码RNA(LncRNAs)，是一类可以像mRNA一样具有多聚腺苷酸化、转录本长度从200nt一直到100kb的细胞内源性RNA分子，不具备编码蛋白的能力，却参与了例如染色体沉默、基因组印迹、染色质修饰、转录激活、转录后调控、蛋白功能调控等多种十分重要的生命活动调控过程。研究发现，LncRNAs在多种类型肿瘤细胞（包括现宫颈癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等）的增殖、克隆、调亡、侵袭、转移及耐药等方面均发挥着重要的作用。更全面、更深刻地阐明LncRNAs在人类疾病尤其是肿瘤中的功能和机制，将会对肿瘤的早期诊断、预后判断、以及临床个性化治疗上提供更大的帮助。　　HOXD是同源异型盒(Hox)基因家族的成员，在胚胎和器官的发育过程中起着至关重要的作用。HOXD簇反义RNA1(HOXD-AS1)是一种新的LncRNA，以反义方式从人染色体2q31.2上的HOXD基因簇中转录。越来越多的证据表明，HOXD-AS1的异位表达参与多种类型的人类肿瘤的发生和进展，包括肝细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、神经母细胞瘤和胃癌等。但HOXD-AS1与宫颈癌的关系目前还不明确。　　通过检索非编码RNA基因的综合数据平台NONCODE科学数据库(http：//)，发现HOXD-AS1是一种与宫颈组织相关的异常表达的LncRNAs。鉴于此，把HOXD-AS1作为研究对象，通过检测宫织及细胞中的HOXD-AS1表达水平判断HOXD-AS1与宫颈癌的关系，并且通过后续的体外实验探讨HOXD-AS1在宫颈癌中的具体作用及其作用机制。　　方法：　　1.组织标本的收集　　从2013-2015年之间海军总医院及内蒙古自治区人民医院医院采集的宫颈癌手术标本共122个患者，样本切除后置于冻存管中，标注样本信息后置于液氮中保存，整个保存及转运过程中按照无酶的原则进行操作。这些病例术前未实施过化疗、放疗及向治疗等。详细的病理特征和临床数据通过回顾性分析完整存档病史获得，包括年龄，组织类型，分化程度，临床分期，是否淋巴脉管间隙浸润，有无淋巴结转移等，病历信息完整。通过随访确定患者是否能复发。标本的获取和操作符合临床实验的伦理规范及操作规程。　　2.细胞系及培养方法　　五种宫颈癌细胞系(HeLa,CaSki,ME-100，C33A and SiHa)和正常人宫颈细胞系HOSE均从美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA，USA)获得，由本实验室培养及传代保存。细胞在含有10％胎牛血清和100UI/mL青霉素和100ug/mL链球菌酶的RPMI-1640培养基中培养。接种50mL的细胞培养瓶在37℃下用5％CO2在培养箱中培养。　　3.实时荧光定量PCR　　将组织样本和细胞样本采用Trizol法提取RNA。采用RT-PCR试剂盒（Takara公司），按说明书要求将RNA反转录为cDNA。从TaKaRa获得了hoxdas1和U6引物序列，U6作为内参，按20ul体系配制成混合液后，置于ABI7500仪器运行，检测宫颈组织及五种宫颈癌细胞和正常人宫颈细胞系的hoxd-as1表达。取3次独立实验所得数据均数为结果。　　***及minics脂质体法转染宫颈癌细胞　　针对HOXD-AS1的siRNA（hoxd-assiRNA1和HOXD-AS1siRNA2）和HOXD-AS1minics和阴性对照组（对照组）都从吉玛制药有限公司获得（上海，中国）。细胞粘附在六孔板后，使用脂质体(Lipofectamine2000)分别对HeLa和CaSki细胞进行转染。按照预先设定分组，RT-PCR检测HOXD-AS1表达情况，进行后续实验。　　5.细胞增殖能力检测　　将细胞接种于96孔板上，对细胞进行特定的干预，转染后6hrs、12hrs、24hrs、48hrs和72hrs，用CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒检测细胞增殖能力。在酶联免疫仪上选择450nm波长测定各组样品吸光值，绘制生长曲线。　　6.平板克隆实验　　取对数生长期细胞，接种于6孔板，接种14天后观察，当肉眼可见细胞克隆时终止实验，用0.1％结晶紫染色，计算克隆形成率。　　7.细胞划痕实验　　细胞转

关键词：宫颈癌发病机制 HOXD簇反义RNA1 细胞增值侵袭能力

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H7N9禽流感病毒在神经氨酸酶抑制剂选择压力下的准种演变及其意义研究

H7N9禽流感病毒在神经氨酸酶抑制剂选择压力下的准种演变及其意义...

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作者：迟莹南京医科大学

学位级别：博士

人感染禽流感是由禽流感病毒某些亚型中的一些毒株跨越种属屏障感染人体所致的一种急性呼吸道传染病。自20世纪90年代中后期以来,多个国家和地区相继发生了多次人感染禽流感疫情。2013年3月,我国上海和安徽两省相继报道人感染H7N9亚型... 详细信息

人感染禽流感是由禽流感病毒某些亚型中的一些毒株跨越种属屏障感染人体所致的一种急性呼吸道传染病。自20世纪90年代中后期以来,多个国家和地区相继发生了多次人感染禽流感疫情。2013年3月,我国上海和安徽两省相继报道人感染H7N9亚型禽流感病例,这也是全球首次发现人类感染H7N9禽流感病毒。自2013年以来,我国已发生五波H7N9禽流感疫情,实验室报告确诊病例超过1500人,感染造成多人死亡。研究发现,一些H7N9禽流感病毒已出现基因改变,不仅发生了适应性变化,比其它禽流感病毒更容易感染人类,而且已从低致病性禽流感病毒向高致病性禽流感病毒进化。此外,多起人群聚集性感染事件表明,H7N9禽流感的人传人风险不容忽视,因此,H7N9禽流感已成为人类面临的又一挑战,严重威胁着人类健康。H7N9禽流感病毒属于RNA病毒,由于RNA依赖的RNA聚合酶纠错功能较差,因此极易发生突变,所以在病毒感染宿主体内存在着大量基因序列有差别但在遗传学上又高度相似的流感病毒混合体,这些病毒混合体被称为准种。病毒准种是一个变异谱系,在选择压力（如药物、免疫和跨物种压力等）下,准种时刻处于动态变化中,可以发生有害、中性或有益突变,而且随着外界压力的选择作用,优势的流感病毒突变株会逐渐被筛选出来,成为该宿主体内流感病毒的优势毒株,准种的存在与进化直接影响到病毒的耐药性、抗原性和致病性等多种生物学特性。本课题重点研究药物选择压力对H7N9禽流感病毒准种演变的影响,为临床抗病毒治疗提供理论基础。目前临床上主要以神经氨酸酶（NA）抑制剂类抗流感药如奥司他韦和帕拉米韦来治疗H7N9禽流感患者,NA抑制剂的药物压力是H7N9病毒的主要选择压力。然而随着NA抑制剂的使用,H7N9病毒已发生耐药变异,直接影响了临床抗病毒治疗的效果。目前所报道的H7N9病毒耐药变异多为从散发的病例中发现,尚未见系统地研究药物选择压力下H7N9病毒准种演变及其意义的相关报道。因此,本研究应用二代测序技术,系统地研究了H7N9禽流感病毒在NA抑制剂帕拉米韦选择压力下的准种演变,并分析了这些演变特别是NA的变异对病毒的耐药性、适应性和致病性等多种生物学特性的影响。本研究获得如下主要结果:***抑制剂帕拉米韦选择压力的存在使得H7N9禽流感病毒准种发生了演变,产生了新的优势基因群以A/Nanjing/2/2013（H7N9）毒株作为原始毒株,在MDCK细胞中传代3次使其适应细胞培养,而后将H7N9病毒在MDCK细胞上进行帕拉米韦药物压力下的连续传代。二代测序结果显示,帕拉米韦选择压力的存在使得H7N9病毒在传代过程中基因组范围内更多位点的单核苷酸变异（SNV）增加至高频并趋于稳定,这些位点主要发生于病毒的HA和NA两个基因节段,提示这些变异的基因群在药物选择压力下迅速繁殖演变为病毒准种中的优势基因群。2.在帕拉米韦选择压力下H7N9病毒NA发生了两个关键氨基酸位点的变异,即I222T和H274Y,药物压力撤除对二者的变异频率无显著影响在观察到NA抑制剂选择压力下H7N9病毒的准种演变之后,我们进一步对病毒NA的变异情况进行了分析。结果发现,到了传代的第12代次,H7N9病毒的NA在帕拉米韦选择压力下发生了两个关键氨基酸位点的变异,即I222T和H274Y,两个位点的变异均始于第10代次,而后频率迅速增加,提示在药物压力环境下二者作为对病毒的有利突变逐渐被筛选出来。进一步研究发现,药物压力的撤除对病毒的I222T和H274Y变异频率无显著影响,说明二者在非药物压力环境下对病毒可能为中性突变。***的I222T变异降低了H7N9病毒对奥司他韦的敏感性,而H274Y变异使得病毒对奥司他韦和帕拉米韦耐药通过噬斑纯化,我们获得了变异株病毒NA-I222T和NA-H274Y。NA抑制试验结果显示,H7N9病毒NA-I222T毒株对奥司他韦的敏感性显著下降,IC50值与对照组相比增加至8.63倍,而NA-H274Y毒株对奥司他韦和帕拉米韦均表现为耐药,IC50值与对照组相比分别增加至130.15倍和10.18倍。与酶促反应结果一致,在细胞水平,奥司他韦和帕拉米韦对NA-H274Y毒株的生长抑制能力显著下降,对NA-I222T毒株的生长抑制能力轻度减弱,但二者对非NA抑制剂利巴韦林和T-705均表现为敏感。***的H274Y变异使得H7N9病毒在感染早期复制能力减弱,但并不影响病毒的峰值滴度,这可能与病毒NA活性下降有关为了评估NA的I222T和H274Y变异对H7N9病毒增殖特性的影响,我们观察了两株病毒在MDCK细胞中的复制动力学。结果显示,虽然NA-H274Y毒株在MDCK细胞中表现为生长迟缓,但在感染达48 h之后,其峰值滴度与对照组病毒达相当水平。酶促反应动力学结果显示,与对照组相比,NA-H274Y毒

关键词： H7N9病毒禽流感神经氨酸酶抑制剂准种变异

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基因编辑技术最新研究进展

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生物技术通报 2017年第6期33卷 39-44页

作者：刘玉彪许馨曹山虎孙绍光河北医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室石家庄050017

基因编辑是一种对基因组及其转录产物进行定点修饰、定向敲除或插入目的基因的基因编辑技术。近年来,基因编辑技术发展日新月异,不仅极大的推动了基因功能研究进程,同时为人类遗传疾病的治疗带来了曙光。综述了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1... 详细信息

基因编辑是一种对基因组及其转录产物进行定点修饰、定向敲除或插入目的基因的基因编辑技术。近年来,基因编辑技术发展日新月异,不仅极大的推动了基因功能研究进程,同时为人类遗传疾病的治疗带来了曙光。综述了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、Ago/g DNA和SGN等技术的作用原理、优缺点、应用等,以期为相关领域的研究提供参考。

关键词：基因编辑 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cpf1 Ago/gDNA Structure-guided Nuclease

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人类外显子组遗传变异在精子生成中的作用及其机制研究

人类外显子组遗传变异在精子生成中的作用及其机制研究

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作者：张岩南京医科大学

学位级别：硕士

一直以来不育不孕都是一个重大的全球性健康问题。全球范围内的育龄夫妇约有10%-15%存在不同程度的生育问题,我国不孕不育的发病率也超过了10%,男方因素在其中约占30%。研究显示,半个多世纪以来人类精液质量显著下降,其中精子生成障碍... 详细信息

一直以来不育不孕都是一个重大的全球性健康问题。全球范围内的育龄夫妇约有10%-15%存在不同程度的生育问题,我国不孕不育的发病率也超过了10%,男方因素在其中约占30%。研究显示,半个多世纪以来人类精液质量显著下降,其中精子生成障碍是男性不育最常见的病因,也是我国成年男性面临的最主要生殖健康问题,而非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是精子生成障碍中最为严重的表现形式。常见的引起非梗阻性无精子症的遗传因素包括:Y染色体微缺失、常染色体结构异常、X染色体连锁异常、基因突变等。其中,Y染色体微缺失是引起精子生成障碍常见的遗传因素,占遗传因素所致精子生成障碍的6%-18%;性染色体数目异常,如Klinefelter’s综合征也是引起精子生成障碍的常见原因。近年来,越来越多的单核苷酸变异(Single Nucleotide Variant,SNV)被发现与精子生成障碍相关,课题组前期通过全基因组关联研究(Genome-wide association studies,GWAS)也发现了一些与NOA显著相关的易感基因/位点。尽管如此,上述原因也只能解释大约20%的由遗传因素导致的非梗阻性无精子症病例,仍然有接近80%的非梗阻性无精子症病例是不能通过以上遗传因素所解释的,而这部分病例我们称之为“原发性(idiopathic)”非梗阻性无精子症。虽然,GWAS在探索复杂疾病遗传易感性方面具有独特优势,但是在探索低频变异和罕见变异时GWAS就显得检验能力不足。而高通量测序在检测低频变异和罕见变异方面具有独特优势,因此本研究通过高通量测序技术对NOA患者DNA样本进行外显子组测序探索SNV在精子发生过程中的作用。同时,借助CRISPR/Cas9技术构建基因编辑小鼠模型对致病性SNV进行功能验证和机制探讨。新发现的致病基因,将帮助我们更加深入了解精子生成的遗传学机制,同时也为不育症的分子诊断和治疗提供新的途径。第一部分基于非梗阻性无精子症(NOA)核心家系全外显子组遗传变异筛选及机制研究非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是精子生成障碍中最为严重的一种表现形式,约占成年男性的1%。引起精子生成障碍的因素有很多,常见的因素包括环境化学污染物、遗传因子改变、表观遗传修饰异常等因素,而其中大约有30%的患者是由于遗传学的异常所引起的。既往我们对于遗传相关疾病致病基因的筛选主要依赖于家系的连锁分析,但其无法对致病位点进行精确定位,从而导致一些可能的致病位点被忽略,而核心家系结合高通量测序可以很好的弥补连锁分析的不足。因此,我们基于NOA核心家系,通过对其进行全外显子组测序,结合遗传模式,筛选与NOA相关的罕见遗传变异及de novo突变,进而通过CRISPR/Cas9系统,构建基因点突变小鼠模型,揭示其在NOA发生过程中的作用及机制。首先,通过对16个NOA核心家系进行全外显子组测序,参考SIFT,Mutation Taster,Polyphen-2以及Ex AC,1000 Genomes,HGMD等正常人群/疾病数据库对突变位点进行致病性预测。结合遗传模式,共有2个罕见遗传变异位点COG5chr7:106924058 G>A和NLRP14 chr11:7091668 T>G可能与NOA相关。进而,我们通过小鼠生殖细胞功能实验,发现Cog5敲低之后可以影响生殖细胞的周期和增殖。NLRP14已有文献报道其与NOA相关且在睾丸中较高表达。因此,我们未对其进行体外功能验证。随后,我们通过CRISPR/Cas9技术构建了2个位点的点突变小鼠模型,进一步探索其在精子生成过程中的可能作用机制。第二部分非梗阻性无精子症(NOA)X染色体遗传变异筛选与机制研究精子发生是一个连续的细胞分裂及分化过程。传统观念认为,在此复杂过程中,Y染色体起到举足轻重的作用。近年研究发现,许多X染色体基因在女性中并不发挥作用,但对维持正常男性生殖功能中具有重要意义,并在某种程度上可影响男性的性别形成。同时,由于X染色体在男性中以半合子(hemizygous)状态存在,所以X染色体连锁基因通常承受着特别的进化压力,X染色体连锁基因一旦发生突变不会像位于常染色体上的基因那样可通过一个正常的等位基因代偿,而降低疾病的发生。因此,X连锁遗传病(X-linked inheritance disease)在男性中具有较高的发病率。实验室前期已完成96例NOA病例和96例对照的X染色体外显子组测序工作,并对候选位点进行了两阶段独立人群验证,结合生物信息学分析和SSC功能实验验证,共有2条基因纳入后续整体动物水平研究。借助CRISPR/Cas9技术构建基因敲除小鼠模型对候选基因进行动物水平功能验证和机制探讨。结果显

关键词：非梗阻性无精子症遗传变异全外显子组测序精子发生非梗阻性无精子症 X染色体 CRISPR/Cas9 精子线粒体

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寨卡病毒ddPCR和RT-qPCR检测方法的建立及B细胞线性表位分析

寨卡病毒ddPCR和RT-qPCR检测方法的建立及B细胞线性表位分析

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作者：惠媛南方医科大学

学位级别：硕士

背景寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)。最初是1947年在乌干达森林里分离的,通过蚊虫叮咬传播,特别是埃及伊蚊和白纹伊蚊。ZIKV感染者的临床表现包括轻度发烧(37.8-38.5℃)... 详细信息

背景寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)。最初是1947年在乌干达森林里分离的,通过蚊虫叮咬传播,特别是埃及伊蚊和白纹伊蚊。ZIKV感染者的临床表现包括轻度发烧(37.8-38.5℃)、关节疼痛(尤其是手和脚疼痛)、肌痛、头痛、眼眶疼痛、结膜炎、皮疹,还可引起小头畸形和Guillain-Barre综合症。ZIKV编码3个结构蛋白(衣壳蛋白C、前体蛋白prM、包膜蛋白E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5)。对于ZIKV检测,主要有血清学检测和核酸分子检测两种方法。由于寨卡病毒和其他黄病毒存在交叉反应抗原,在同时存在其它黄病毒的流行区,血清学检测可能产生假阳性结果。现有的量化核酸检测方法在检测极低病毒浓度的血清样本时,敏感性和准确性受到一定限制。微滴式数字聚合酶链式反应(Micro-droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)是一种新的分子检测方法,它和RT-qPCR使用相同的引物和探针,但不需要外部标准曲线或参考就能精确地检测和量化核酸。近年来,ddPCR在医学检验、环境监测和食品安全控制中的应用越来越多,但尚未有在ZIKV检测中应用的报道。本论文第一部分拟建立基于寨卡病毒NS5基因的ddPCR和RT-qPCR方法,对比它们的灵敏度和特异性,旨在为检测低滴度和/或寨卡病毒早期感染提供更准确性的方法。接种疫苗预防寨卡病毒感染最有效的方法。但是目前尚没有批准上市的寨卡疫苗,寨卡疫苗的研发迫在眉睫。B细胞抗原表位是指抗原分子表面可被B细胞表面受体(B cell receptor,BCR)或抗体Fab部分特异性识别并结合的化学基团,是引起体液免疫的物质基础。B细胞抗原表位作为抗原的核心部分,是研究免疫诊断和免疫治疗的重点,对它的生物信息学预测可以节约实验室工作量,在一定程度上避免传统表位研究的盲目性。各种研究表明,表位驱动疫苗能够有效地刺激多种病原体的保护性免疫反应,如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。B细胞抗原表位的鉴定对于表位疫苗的发展很重要,免疫信息学在疫苗开发领域正变得越来越重要,该领域利用基因组和蛋白质组的信息,为预测潜在的候选疫苗提供了高质量的信息。本文第二部分拟通过对寨卡病毒Z16006株蛋白序列抗原性预测、基本理化性质和二级结构分析预测B细胞抗原表位,最终得出寨卡病毒蛋白B细胞优势表位区段。应用多参数方法预测寨卡病毒蛋白B细胞表位,为进一步实验鉴定其表位进而制备单克隆抗体奠定基础。目的建立寨卡病毒微滴式数字 PCR(micro-droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)和实时荧光定量 PCR(real-time quantification PCR,RT-qPCR)检测技术,并评估两种方法的检测范围、灵敏度和重复性。运用生物信息学的方法,发现寨卡病毒Z16006株全长蛋白潜在的B细胞线性抗原表位。方法对于ddPCR方法的建立,首先使用软件设计寨卡病毒NS5基因的引物和探针,制备质粒标准品,建立RT-qPCR以及ddPCR方法,并比较两种检测方法的灵敏性和准确性。以本科室现有的寨卡病毒株Z16006(Accession:AMR39830.1)为研究对象,从NCBI上获得Z16006蛋白序列,用在线软件VaxiJen v2.0对其抗原性进行评分,在ProParam软件中分析Z16006蛋白序列的基本理化性质,利用SOPMA软件进行二级结构预测,随后通过IEDB软件和ABCpred在线服务器对寨卡病毒Z16006株蛋白各蛋白序列B抗原表位进行预测分析。结果1.基于寨卡病毒NS5基因设计PCR引物和探针,使用RT-q PCR对质粒标准品进行检测,其标准曲线R2为0.999,扩增效率为92.203%,在101-108 copy/μL范围内循环阈值(the cycle threshold value,Ct)和拷贝数有比较好的线性关系,但是浓度为1 copy/μL的样品不能被检测到。DdPCR线性范围从101-104 copy/μL,并且可以检测浓度低至1 copy/μL的样品。对于临床阳性血液样品,RT-qPCR适合高浓度样品(101 copy/μL),ddPCR对于低拷贝数样品具有良好的准确性和敏感性。2.应用VaxiJen v2.0、ProtParam服务器、SOPMA、IEDB生物信息学服务器、ABCpred在线服务器,对寨卡病毒Z16006株蛋白各蛋白表位参数综合分析来预测了 B细胞表位。共预测分析得出52个B细胞潜在优势抗原表位。结论:1.本研究建

关键词：寨卡病毒 NS5基因核酸检测 ddPCR RT-qPCR B细胞线性表位

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基于UPLC-QTOF/MS非靶向代谢组学生物样品分析方法的建立与应用

基于UPLC-QTOF/MS非靶向代谢组学生物样品分析方法的建立与应用

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作者：许紫琳温州医科大学

学位级别：硕士

随着人类生活水平的提高和生活方式的改变，糖尿病（DM）的发病率逐日升高，其已成为继心脑血管疾病之后的人类健康第二大杀手，而其中超过90%的患者为2型糖尿病。糖尿病是由遗传、生活饮食习惯、环境、自身免疫等多种原因引起的代谢性... 详细信息

随着人类生活水平的提高和生活方式的改变，糖尿病（DM）的发病率逐日升高，其已成为继心脑血管疾病之后的人类健康第二大杀手，而其中超过90%的患者为2型糖尿病。糖尿病是由遗传、生活饮食习惯、环境、自身免疫等多种原因引起的代谢性疾病，其最典型特点是慢性高血糖。而糖类作为人体三大营养物质之一，其代谢过程与另外两大类脂肪和蛋白质代谢息息相关。因此，糖尿病患者不仅存在糖代谢异常，往往还伴随着蛋白质和脂肪代谢紊乱。长期以往，更会导致多器官多系统并发症。且临床尚无对策根治，治疗手段多为终生对症治疗。其不可治愈性严重影响患者的生活质量，也对国家造成沉重的财政负担。　　糖尿病发病隐匿，早期常常无明显症状，而且由于大多数患者缺乏相关知识，以致大部分病患明确诊断之时往往已有三到七年病程。迄今为止，2型糖尿病的诊断依赖糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FPG，fasting plasma glucose）、口服葡萄糖耐量试验（OGTT，oral glucose tolerance test）和随机血糖这些实验室指标，存在许多不便与不足，迫切需要广泛开展糖尿病高危人群筛查和早期诊断的研究，寻找新的生物标志物。　　代谢组学作为系统生物学的下游分支，在疾病的早期诊断、治疗效果的评价、药物药效和毒性考察等角度有其自身的优势。其与系统生物学其他分支即基因组学、转录组学和蛋白质组学相比，更具备“全局观点”。代谢组学与分析化学、生物学等多领域知识相结合，合理运用处于前沿科技的各种先进仪器，检测生物体内整个代谢产物谱，并运用统计学分析筛选潜在的生物标志物，对生命体的生理机能和状况进行探究。一定程度上，代谢产物能让我们从宏观角度窥探上游基因和蛋白质层面的变化，具有放大基因和蛋白质水平的微小变化的作用。　　本论文将采用超高效液相色谱（UPLC）分离系统和四级杆飞行时间串联质谱（Q-TOF/MS）检测系统，建立适用于血浆代谢组学的非靶向分析方法，并对其进行灵敏度、精密度和可重复性等方法学验证。考察一批2型糖尿病患者和健康志愿者血浆样本，分析两组之间血浆小分子代谢物的差异，以探究2型糖尿病潜在的生物标志物，为找到2型糖尿病的发病机制提供新的可靠的科学证据。　　首先本文介绍了代谢组学基本概念和相关内容，然后罗列了代谢组学的基本流程，结合2型糖尿病血浆代谢组学研究现状，提出了本论文的研究目的在于探究2型糖尿病潜在生物标志物，为其发病机理的研究提供科学依据。　　其次，我们进行了血浆非靶向代谢组学的UPLC-Q-TOF/MS分析方法研究，参考18个标准品的提取情况，采用有机溶剂作为蛋白沉淀剂，进行了蛋白沉淀剂的种类、比例和用量的单因素优化，最终确定当采用甲醇/乙腈（体积比1:1），且血浆和蛋白沉淀剂的比例为1:4时，清除蛋白效果最优。并对液相分离的梯度洗脱条件进行优化，找到最适宜的洗脱程序。方法学验证结果表明：本方法重现性、精密度与稳定性良好，满足代谢组学研究重复性和稳定性的要求。　　接下来是非靶向分析方法探究2型糖尿病血浆代谢组学和脂质组学研究。本研究采集了60例2型糖尿病患者和60例正常志愿者血浆样本，对其进行前处理后用UPLC Xevo G2-XS Q-TOF进行谱图采集，然后导入Progenesis QI和EZinfo软件进行数据前处理和无监督的PCA和有监督的OPLS-DA分析，通过:　　（1）方差分析P值Anova p-value ≤ 0.05;（2）最大差异倍数Max fold change ≥ 2;（3）最小变异系数Minimum CV ≤ 20;（4）变量最重要性投影VIP值≥ 1这4个筛选条件，各筛选出一批小分子代谢物，结合数据库检索分析，鉴定出14个差异代谢物，其中包括4个氨基酸、2个鞘脂类、3个甘油磷脂类，4个甘油酯类。结合代谢通路分析，提示2型糖尿病患者除了糖类代谢异常，还存在蛋白质和脂肪代谢紊乱。　　综上所述，本研究为 2 型糖尿病的诊断和分子层面发病机制提供了一定参考，在代谢性疾病诊断和治疗评估等方面具有广阔应用前景。

关键词： 2型糖尿病葡萄糖耐量试验糖化血红蛋白空腹血糖非靶向代谢

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JAK2/p-JAK2在ALS转基因小鼠发病过程中表达的研究

JAK2/p-JAK2在ALS转基因小鼠发病过程中表达的研究

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作者：齐银矿河北医科大学

学位级别：硕士

目的:肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）是一种慢性进行性致死性的中枢神经系统变性疾病,以选择性侵犯脑和脊髓运动神经元为特征,临床表现为进行性的肌肉萎缩,最终因呼吸肌麻痹而死亡。其起病隐袭,缓慢进展,确切的... 详细信息

目的:肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）是一种慢性进行性致死性的中枢神经系统变性疾病,以选择性侵犯脑和脊髓运动神经元为特征,临床表现为进行性的肌肉萎缩,最终因呼吸肌麻痹而死亡。其起病隐袭,缓慢进展,确切的发病机制至今不明,目前尚无有效的治疗方法。研究表明ALS发病与神经系统炎症有关,其过程主要由激活的小胶质细胞和星形胶质细胞及其释放的活性物质诸如细胞因子、趋化因子和生长因子所介导的多种细胞之间复杂的相互作用所引发,研究发现JAK2可以和多种炎症细胞因子结合并发挥不同作用,并且多种类型的细胞中已经证实JAK参与了促炎因子的调节。但目前在神经变性疾病中基于JAK2的研究很少,本实验探究了JAK2及其激活形式p-JAK2在ALS转基因模型小鼠整个发病过程中的表达变化,为JAK2在ALS疾病进程中的作用提供依据,以揭示ALS的发病机制,并为ALS治疗提供可能的靶点。方法:1 SOD1-G93A转基因小鼠的繁殖及鉴定实验用ALS模型小鼠饲养在恒湿、恒温、白天/黑夜（12h）交替照射的清洁环境中,喂以生长型鼠粮以及充足的饮水。该小鼠由购自Jackson实验室（Bar Harbor,ME,USA）的B6SJL-Tg（SOD1-G93A）1 Gur/J雄鼠和B6SJL/F1雌鼠杂交而来,在小鼠生后21d左右提取DNA,通过凝胶电泳、GBOX-HR全自动凝胶成像系统鉴定出带有人类SOD1突变基因的转基因小鼠。2转基因小鼠运动功能评分小鼠运动缺陷评分采用4分评价系统:1)正常,无运动障碍及体重减轻:评4分2)悬尾出现后肢震颤:评3分3)步态出现异常:评2分4)至少一侧出现后肢瘫痪:评1分5)仰卧或侧卧,30秒内不能翻正:评0分临床发病（onset）:每周称2次体重,当体重连续两次下降并出现步态异常,评分2分。终末期:侧卧30秒不能翻身,评分为0分。3实验分组将SOD1-G93A小鼠分为六组:30d组;60d组;90d组;onset组;终末期组及非转基因对照组（130d左右）,每组6只。4组织处理与免疫组织化学染色4.1组织处理各组取3只小鼠,麻醉后行PBS、4%多聚甲醛灌流固定,取脊髓腰膨大部位固定24h后经30%蔗糖脱水、OCT包埋,使用冰冻切片机切成25μm组织切片待用。4.2免疫组织化学染色1%H2O2处理10min,TBS漂洗10min,血清封闭1h,一抗（JAK2、p-JAK2）孵育4℃过夜,TBST漂洗,生物素二抗孵育1h,漂洗,三抗孵育40min,漂洗,DAB显色,铺片,脱水5min,透明10min后封片,显微镜观察结果并拍照。5蛋白印迹新鲜取终末组SOD1-G93A和对照组小鼠腰膨大部位,经液氮冷冻后于-80℃保存,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,蛋白上样量50μg,经SDS-PAGE电泳后转膜,BSA封闭,一抗（抗JAK2、p-JAK2抗体）孵育,漂洗,荧光二抗孵育,漂洗,Odyssey成像系统扫膜后分析数据。6统计分析数据用?x±SEM表示,采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计处理。两组之间的比较应用两独立样本t检验。P<0.05为有显著差异,有统计学意义。结果:***2在非转基因小鼠和ALS转基因小鼠发病前期的腰髓中表达均较少,随疾病进展,JAK2表达逐渐增多,终末期ALS小鼠JAK2表达明显增加。2.在非转基因小鼠和发病前的ALS转基因小鼠,p-JAK2主要表达于运动神经元胞浆,发病后主要表达在增生的胶质细胞。3.与非转基因小鼠相比,终末期ALS转基因小鼠腰髓p-JAK2表达量明显增加。结论:在ALS转基因小鼠发病过程中,JAK2及其激活形式p-JAK2表达上调,并且ALS转基因小鼠发病后,p-JAK2主要表达在增生的胶质细胞,提示JAK2/p-JAK2可能在ALS发病过程中起重要作用。

关键词： JAK2 p-JAK2 ALS SOD1 神经变性疾病

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PTEN基因在口腔鳞癌免疫逃逸中的作用及分子机制

PTEN基因在口腔鳞癌免疫逃逸中的作用及分子机制

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作者：焦会杰河北医科大学

学位级别：硕士

目的:口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占口腔颌面部恶性肿瘤的90%,是最常见的恶性肿瘤。目前经治疗后OSCC的5年生存率也仅为50%-60%。近几年随着肿瘤免疫学研究的深入,人们认识到肿瘤的免疫逃逸导致了机体对肿瘤的免疫无... 详细信息

目的:口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占口腔颌面部恶性肿瘤的90%,是最常见的恶性肿瘤。目前经治疗后OSCC的5年生存率也仅为50%-60%。近几年随着肿瘤免疫学研究的深入,人们认识到肿瘤的免疫逃逸导致了机体对肿瘤的免疫无应答或免疫反应低下,通过对肿瘤免疫逃逸机制的了解,对临床的免疫治疗,预后判断及疗效评价具有很大的指导意义。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(Phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是迄今发现的第1种具有双特异性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,通过发挥磷酸酶作用,参与调控细胞内诸多重要的信号通路,其中包括PI3K/AKT信号通路。研究发现,在人类多种肿瘤中包括口腔鳞癌均发现有PTEN的低表达或不表达等失活现象,其表达情况与肿瘤的发生﹑发展及预后有一定的相关性。本研究使用PTEN表达不同的两种口腔鳞癌细胞株和一种正常口腔黏膜细胞株,采用分子生物学的实验方法和技术,检测免疫抑制因子(IL-6,IL-10,VEGF)和共刺激分子(B7-H1)的表达;使用PI3K/AKT信号通路抑制剂干预后,检测免疫抑制因子(IL-6,IL-10,VEGF)和共刺激分子(B7-H1)的浓度变化。探讨PTEN失活后口腔鳞癌免疫逃逸的具体作用途径和分子靶点;揭示PTEN失活在口腔鳞癌免疫逃避中作用和分子机制。材料与方法:1.实验材料口腔鳞癌细胞株SCC-4:购置于美国ATCC公司口腔鳞癌细胞株Tca8113:购置于上海九院正常口腔黏膜细胞株HGFs(正常对照,来源于正常牙龈组织):来源于本院病理研究室2研究方法2.1采用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和蛋白印迹法(WesternBlot)检测三种细胞株(SCC-4、TCa8113和HGFs)中PTEN蛋白的表达情况。2.2采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测三种细胞株(SCC-4、TCa8113和HGFs)中免疫抑制因子(IL-6,IL-10和VEGF)和共刺激分子(B7-H1)的含量。2.3使用PI3K的抑制剂(LY294002)干预三种细胞株(SCC-4、TCa8113和HGFs),采用ELISA检测干预后免疫抑制因子(IL-6,IL-10和VEGF)和共刺激分子(B7-H1)的表达变化情况。结果:1.免疫组化和Western Blot检测结果均显示正常口腔黏膜细胞株HGFs中PTEN蛋白为正常表达,口腔鳞癌细胞TCa8113中PTEN蛋白为中表达,口腔鳞癌细胞SCC-4中PTEN蛋白为低表达;***结果显示HGFs、TCa8113和SCC-4中的免疫抑制因子(IL-6、IL-10、VEGF)浓度依次升高,且每两种细胞之间均有显著性差异(P<0.05);***结果显示HGFs、TCa8113和SCC-4中的共刺激分子(B7-H1)浓度依次升高,且每两种细胞之间均有显著性差异(P<0.05);4.使用PI-3K抑制剂LY294002干预后,HGFs、TCa8113和SCC-4中的免疫抑制因子(IL-6、IL-10、VEGF)浓度均降低,SCC-4降低最为显著(P<0.05);5.使用PI-3K抑制剂LY294002干预后,HGFs、TCa8113和SCC-4中的共刺激分子(B7-H1)浓度降低,且SCC-4降低最为显著(P<0.05).6.三种细胞中PTEN与IL-6、IL-10、VEGF和B7-H1相关性分析:PTEN与IL-6、IL-10、VEGF和B7-H1浓度呈明显负相关,r值分别-0.985、-0.97、-0.945、-0.975,P<0.05。结论:***基因的低表达可以引起免疫抑制因子(IL-6、IL-10、VEGF)的表达增多,从而导致鳞癌逃避机体免疫监视。***基因的低表达可以引起共刺激分子(B7-H1)的表达增多,从而促进鳞癌的免疫逃逸。***基因对于免疫抑制因子和共刺激分子的调控为负调节作用,是通过信号通路PI3K/AKT实现的。

关键词： PTEN基因口腔鳞癌 PI-3K/Akt IL-6 IL-10 VEGF B7-H1 免疫逃逸

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