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- 1 篇 哲学

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5 篇 白血病
5 篇 前列腺癌
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7 篇 上海医科大学
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4 篇 上海体育学院
3 篇 广州医科大学
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作者

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Pin1、β-catenin与CyclinD1在肝癌中的表达及意义

Pin1、β-catenin与CyclinD1在肝癌中的表达及意义

引用

作者：敖然中国医科大学

学位级别：博士

目的:\n Pin1是一独特的肽基脯氨酰顺反异构酶，可特异性催化已磷酸化的丝（苏）脯氨酰基序发生顺反异构，从而导致蛋白活性、蛋白间相互作用、蛋白的亚细胞定位及稳定性发生变化。研究显示Pin1在人类多种肿瘤中过表达，是多个致癌... 详细信息

目的:\n Pin1是一独特的肽基脯氨酰顺反异构酶，可特异性催化已磷酸化的丝（苏）脯氨酰基序发生顺反异构，从而导致蛋白活性、蛋白间相互作用、蛋白的亚细胞定位及稳定性发生变化。研究显示Pin1在人类多种肿瘤中过表达，是多个致癌信号通路的关键效应分子。Pin1的过表达和肿瘤的关系越来越引起人们的关注。\n β-连环素(β-catenin)是上皮钙黏素-连环素复合体(E-cadherin/catenin)和Wnt信号传导通路的关键分子，当β-连环素在细胞核内蓄积时，能激活Wnt信号传导通路，启动c-myc、cyclin D1等靶基因转录，导致细胞增殖、侵袭和转移。CyclinD1是细胞增殖周期从G1期到S期的关键蛋白，CyclinD1在G1期到S期的转变中起关键的正向调节作用，因而又被称为原癌基因。细胞周期失控是细胞增殖癌变的重要原因。\n WULF等研究证明，在乳腺癌中，可以检测到Pin1、β-catenin与CyclinD1的过度表达;也有文献指出，在直肠癌和甲状腺癌中可分别检测到Pin1与β-catenin、Pin1与CyclinD1过度表达，并且两者的过表达有相关性。\n 本实验通过免疫组化、Western-blot、RT-PCR、免疫荧光及免疫共沉淀的方法来检测Pin1、β-catenin与CyclinD1在肝癌中的表达及意义。\n 材料与方法:\n 一、.材料\n 24例肝癌及其癌旁正常组织标本均来自中国医科大学附属第一临床医院普外科2005年5月至2007年9月手术切除标本及存档蜡块。其中12例肝癌及其正常癌旁组织新鲜标本冷冻于-80℃冰箱用于Western-blot。人肝癌Be17402细胞株来源于中国医科大学遗传教研室。\n 二、主要试剂和来源\n 实验药品:浓缩型免抗人Pin1多克隆抗体、即用型CyclinD1单克隆抗体、梯度蛋白标准均购自美国Santa Cruze公司;即用型S-P超敏免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、β-action一抗和浓缩型辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。\n 三、质粒及引物\n Pin1的质粒由大连宝生物公司合成并鉴定，β-catenin及CyclinD1的引物由上海生工技术有限公司合成。\n 四、方法\n （一）免疫组织化学染色:检测Pin1、β-catenin与CyclinD1的表达采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化（S-P法）。\n （二）Western-blot检测\n 取新鲜样品（1-2克）加5倍裂解缓冲液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳，转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。结果判定为转印膜上出现清晰的棕色条带。\n （三） RT-PCR\n PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并以EB染色后，采用Gel Doc1000成像系统(Bio2Rad，USA)进行图像扫描和分析。mRNA含量的计算:用图像分析仪对电泳结果进行扫描，测定各条带的A值，将样本条带的积分A值与相应的β-actin mRNA条带的A值相比较，即为样本mRNA的相对含量。\n （四）细胞培养和转染:将bel细胞传代后置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中常规培养，根据细胞生长情况天换液1次，细胞长满后用0.25％胰蛋白酶消化传代，当细胞生长稳定、呈对数生长时进行实验\n （五）免疫荧光:将对数生长期的细胞转染48小时后，用蛋白酶消化，接种于置有消毒盖玻片的孔培养板内，进行免疫共荧光检测。\n （六）免疫共沉淀:用琼脂糖珠法收集裂解细胞蛋白，取上清跑电泳。在19kD和34kD处出现清晰条带，即为有免疫复合物沉淀。\n 统计学方法\n 用SPSS11统计软件包进行统计分析。采用X2检验，确切概率法和相关分析，以P＜0.05为有统计学意义。\n 结果:\n 一、免疫组化结果:\n Pin1在癌旁正常组织中不表达或呈微弱的核表达。在肝癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。CyclinD1在癌旁正常组织中不表达。在肝癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。\n β-catenin在癌旁正常组织中阳性表达定位于细胞膜，胞浆中极少。在肝癌细胞的胞浆和/或胞核内呈异位表达。\n 二、Western-blot结果\n Pin1、 CyclinD1和β-catenin在肝癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织。\n 三、RT-PCR结果\n Pin1、 CyclinD1和β-catenin mRNA在肝癌细胞株中的表达明显高于癌旁正常组织。\n 四、

关键词：肝癌免疫组化 β-连环素相关性

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Eya2在人神经胶质瘤中过表达并通过调控ERK促进细胞的侵袭转移

Eya2在人神经胶质瘤中过表达并通过调控ERK促进细胞的侵袭转移

引用

作者：温志锋中国医科大学

学位级别：博士

目的:神经胶质瘤在全世界范围内都称得上是常见的恶性肿瘤，并且其每年的发生率仍然在不断攀升。在过去的数十年里，医学诊断技术和治疗手段在不断第提高，然后神经胶质瘤总体不良的预后情况仍然未得到根本性的改变。在各类型恶性肿瘤... 详细信息

目的:神经胶质瘤在全世界范围内都称得上是常见的恶性肿瘤，并且其每年的发生率仍然在不断攀升。在过去的数十年里，医学诊断技术和治疗手段在不断第提高，然后神经胶质瘤总体不良的预后情况仍然未得到根本性的改变。在各类型恶性肿瘤发生和发展的过程中，肿瘤抑制基因和致癌基因保持相对平衡的状态非常重要。寻找新的致癌基因对于更深入地了解神经胶质瘤以及针对神经胶质瘤的治疗手段的发展都具有十分重要的意义。\n 磷酸酶以及transactivator eyes absent(Eya)家族能够编码一系列转录辅酶因子，这些转录产物在眼睛的形成过程中发挥重要作用，同时发现该蛋白家族依赖EGFR，TGF, Hedghog，Notch等多条分子信号通路在人体器官的形成过程中占据重要地位。最新研究表明在人类恶性肿瘤细胞的增殖以及转移过程中该家族蛋白质可能扮演重要角色。已经有报道指出在人类卵巢癌细胞中，Eya2表达上调，并且与患者不良预后情况和较低的生存率有关联。在感染人乳头状瘤病毒的宫颈角质细胞中，敲除Eya2基因后细胞的活力，细胞的增殖能力以及转移能力都受到不同程度的抑制。已有的这些研究成果提示我们在人类恶性肿瘤细胞中Eya2可能是一种致癌基因。但是截至目前，Eya2在人胶质瘤细胞中的生物学作用以及表达模式还未见深入研究。在本次课题研究过程中，我们通过免疫组织化学方法分析人胶质瘤组织中Eya2的临床意义并探究胶质瘤细胞系中Eya2的生物学特性。\n 研究方法:本研究方法经过中国医科大学第一附属医院相关机构批准通过。90例样本取自于2012-2014年间在中国医科大学附属第一医院诊断为胶质瘤，并接受外科手术切除的患者。根据WHO分类原则对胶质瘤组织样本进行组织学分级。\n 采用免疫组织化学方法对胶质瘤组织病理切片进行分析，所用试剂盒为Maixin Elivision plus kit。病理切片在柠檬酸盐缓冲液中进行脱蜡以及抗原修复，时间为2min。然后在室温条件下用过氧化氢对内生性的过氧化物酶进行阻断。接着进行一抗孵育，孵育条件为4℃过夜，使用抗体为Eya2兔多克隆抗体。一抗孵育后用PBS缓冲液对病理切片进行漂洗，接着孵育第二抗体。染色所用试剂盒为DAB plus kit。病理切片经苏木精进行复染，然后经过浓度梯度乙醇脱水，最后封片。\n 细胞核染色则被认定为阳性。样本核染色小于15％时可判定为Eya2低表达，肿瘤样本核染色大于15％时可判定为Eya2高表达。\n 本实验所用细胞系为胶质瘤细胞系U251，U87，A172，购买单位为美国模式培养物保藏中心(ATCC)。细胞所用培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基，并用无菌培养瓶对胶质瘤细胞系进行培养。转染用Eya2质粒购买于Origene公司，配套使用的转染试剂为Lipofectamine3000。Eya2干扰所用siRNA以及相对应的阴性对照购买于美国Dharmacon公司，配套使用的转染试剂为DharmaFECT。\n 使用PCR仪为7900 Real-Time PCR System，反应程序为95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，循环数为40。反应体系为20μl，所用试剂为TAKARA公司所售SYBR Green PCR master mix。PCR实验所用内参为β-actin，基因表达的相对水平测算方法是参照2-△△Ct法。本实验过程中所用的引物为Eya2以及β-actin，其引物序列如下:Eya2 forward，5\'CACTCCCTGAAGGCACTAAACCTCATC3\'，Eya2 reverse,5\'CTGCATTATC CTCTCGAAGCAGCTCTC3\';Actin forward,5\'ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC3\'，Actinreverse,5\'CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG3\'.\n 基质胶侵袭实验所用材料为Transwell小室，首先要对小室进行包膜处理，每孔用18μl Matrigel，稀释比例为1∶4。siRNA转染后48小时，用胰蛋白酶对细胞进行消化制备细胞悬液，制备细胞悬液所用培养基为无血清DMEM培养基，并将该细胞悬液100μl加入上室。下室加入含有15％胎牛血清的DMEM培养基。穿过基底膜的细胞经过固定，苏木精染色后在显微镜下进行细胞计数。\n 集落形成实验:经过处理的细胞接种于直径为6厘米的培养皿中，连续培养两个星期。用吉姆萨染色液对细胞集落进行染色并于显微镜下进行观察，细胞数目超过50个即可记为一个集落。\n CCK8实验:将细胞接种于96孔板中，每孔加入20μl CCK8溶液。加入CCK8溶液后要将细胞继续孵育4个小时，然后倒掉孔板中的培养基，加入二

关键词：神经胶质瘤 Eya2蛋白致癌基因细胞侵袭细胞增殖 ERK信号通路

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IL-7/IL-7R调控非小细胞肺癌细胞迁移侵袭和凋亡的机制研究

IL-7/IL-7R调控非小细胞肺癌细胞迁移侵袭和凋亡的机制研究

引用

作者：刘子慧中国医科大学

学位级别：博士

前言：　　肺癌已经成为全世界癌症导致死亡的主要原因之一，约有85％的肺癌被确诊为非小细胞肺癌，肺癌转移是导致患者死亡的主要原因。因此，研究肺癌转移的分子机制，挖掘有效的生物标记物，探索新的治疗靶点是非常必要的。IL-7是个... 详细信息

前言：　　肺癌已经成为全世界癌症导致死亡的主要原因之一，约有85％的肺癌被确诊为非小细胞肺癌，肺癌转移是导致患者死亡的主要原因。因此，研究肺癌转移的分子机制，挖掘有效的生物标记物，探索新的治疗靶点是非常必要的。IL-7是个分子量约为25KD的单链糖蛋白，人类的IL-7R基因位于染色体5q13。IL-7/IL-7R信号通路不仅在正常免疫系统发育和维持正常的免疫功能中发挥重要作用，在一些自身免疫疾病中也发挥重要作用。近年的研究表明，IL-7/IL-7R信号通路参与许多恶性肿瘤包括淋巴瘤和多种类型白血病的发病及其进展过程。一些人类的肿瘤细胞能够产生IL-7，IL-7R在乳腺癌、结肠癌、肾癌和中枢神经系统肿瘤细胞表面高表达，提示IL-7/IL-7R在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。然而IL-7及IL-7R是否能调节肺癌细胞转移和凋亡，又是通过何种机制影响肺癌细胞转移和凋亡，这些研究未见报道。为了明确这些问题，我们检测了非小细胞肺癌细胞中IL-7及IL-7R对肺癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响，研究了IL-7及IL-7R调节肺癌细胞迁移、侵袭和凋亡的作用机制，并检测了迁移、侵袭和凋亡相关蛋白的表达情况和下游信号通路相关的信号分子。　　材料与方法：　　1、细胞培养　　冻存于液氮的A549、H1299、H460和HBE等细胞经复苏后细胞使用RPMI1640和高糖DMEM培养基含10％的灭活小牛血清，以及100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。37℃、5％CO2的条件下培养，每两天换一次液，并用0.25％的胰酶进行传代。　　2、干扰siRNA转染　　转染前24小时将细胞按50％密度接种于6孔板，分别转染siRNA对照，IL-7RsiRNA和p53siRNA，8-12hFCM监测转染效率，48h后终止细胞培养，用于后续实验。Real-time PCR和Western blot检测干扰效率。IL-7R和p53干扰序列和阴性对照均购自上海吉玛公司。　　3、Real-time PCR和Western blot　　转染IL-7R的siRNA和对照siRNA的细胞收集后Real time PCR和Western blot分别检测了干扰效率，达到干扰效率的同时Real-time PCR和Western blot检测了下游信号相关蛋白的表达。　　4、流式表面分子检测　　将接种在6孔板不同处理组的每孔细胞收集后分别加入PBS、FITC-IL-7R抗体和FITC-IgG1冰上避光孵育30min。PBS清洗2次后，4℃，1500rpm离心5min。最终加入300uLPBS上机流式细胞仪检测。结果用FlowJo7.6.1软件分析。　　5、Transwell细胞侵袭和迁移实验　　在具有8μm小孔聚碳酸酯滤膜的培养小室上铺用预冷无血清培养基1∶3稀释的Matrigel基质胶，放入培养箱凝固4小时。接种100μl含4×104个/mL细胞，下室加入600μl1640培养液，每组设6复孔。培养22-24h后，用棉棒轻轻拭去小室上表面的基质胶。清洗，甲醛固定，苏木精中染核，清洗晾干。光学显微镜下观察、照相，并计数每高倍视野滤膜底面的平均细胞数。迁移实验不需铺胶，直接接种细胞。其余步骤同上。　　6、划痕实验　　在每孔中接种细胞，待细胞长满无空隙时，用丝裂霉素处理2h。用PBS清洗细胞3次，用黄枪头比照已画好的横线划痕，划好后，用PBS清洗细胞3次，以便去除划下的细胞。按照事先分组，加入不同处理因素，37℃、5％CO2的条件下培养。按0，6，12，24小时取出拍照。每组实验重复孔至少3个，取划痕宽度平均值。　　7、MMP9活性检测　　细胞在无血清的培养基中培养24h。次日收集上清，配置含1％明胶的SDS-PAGE凝胶。上样，电泳，电泳结束后，将凝胶取出先洗脱后孵育，孵育结束后染色。染色结束，放入脱色液中进行震荡脱色。将凝胶放在成像分析仪中采集图像，以备分析。　　8、细胞凋亡实验　　将大约50％密度的A549、H1299和HBE细胞铺到六孔板中，转染IL-7R和p53干扰序列和对照序列，48小时后收集细胞，按Annexin V-FITC Apoptosis Kit(BD Pharmingen，USA)步骤进行，然后用BD仪器进行检测。　　9、统计学分析　　采用SPSS16.0统计分析软件，用单因素方差分析评价各种处理组间的不同，随后的亚组分析用LSD检验或Dunnett T3检验;数据以三次独立实验的均数±标准差表示，*P＜0.05和**P＜0.01为差异有统计学意义。　　结果：　　1、IL-7/IL-7R通过JAK1-PI3K/AKT信号途径上调RhoAmRNA和蛋白表达激活RhoA/ROCK/MLC通路促进肺癌细胞迁移，通过JAK1-PI3K/AKT信号途径下调TIMP1mR

关键词：非小细胞肺癌 IL-7R基因白细胞介素-7 细胞凋亡侵袭转移

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卡培他滨与放射线照射联合治疗子宫颈腺癌的效果与机制探讨

卡培他滨与放射线照射联合治疗子宫颈腺癌的效果与机制探讨

引用

作者：杨滨中国医科大学

学位级别：博士

前言卡培他滨(capecitabine,CAP)是一种口服型5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)前体类抗肿瘤新药。CAP的药物设计,使其本身无毒无活性,在胃肠道可以原药形式快速吸收,在肝脏和肿瘤组织中三种酶的作用下转化形成5-FU而发挥抗肿瘤活性。... 详细信息

前言卡培他滨(capecitabine,CAP)是一种口服型5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)前体类抗肿瘤新药。CAP的药物设计,使其本身无毒无活性,在胃肠道可以原药形式快速吸收,在肝脏和肿瘤组织中三种酶的作用下转化形成5-FU而发挥抗肿瘤活性。最终5-FU由二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase,DPD)代谢失活。在其转化过程中,胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)是其活化最后一环的一个限制酶,TP的特点在多数实体肿瘤组织中浓度较高,明显高于正常组织。这使得CAP在正常组织中生成5-FU量较少,而在肿瘤组织局部可有高浓度5-FU生成,大大增强了抗肿瘤活性,降低了5-FU对正常组织的毒副作用。因此,CAP全身毒性反应轻且选择性抗肿瘤,是目前口服制剂中唯一能超过静脉给药的氟尿嘧啶类药物,弥补了5FU毒性大用量受限的缺撼。临床上已被用于紫杉醇、阿霉素等耐药的复发转移性乳腺癌及晚期结肠癌等患者的治疗,取得了很好的效果。关于CAP疗效方面的研究,由于TP是CAP选择性作用于肿瘤的关键酶,而成为研究的焦点。人们致力于增加TP的表达来提高CAP的疗效。研究显示,放射可使多种肿瘤组织TP表达明显增高,CAP和放射联合应用无论用于辅助治疗、术前放化疗、还是姑息治疗,均能得到较好的效果,是一种有前途的肿瘤治疗方法。另外研究还发现,DPD在CAP治疗中也发挥着重要作用,TP/DPD的比值更直接的关系到CAP的疗效。提示在化疗之前测定肿瘤相关酶的水平,能选择到更适合接受CAP治疗的人群。子宫颈癌有着较高的发病率,其治疗主要还是以手术和放疗为主,可使部分患者得到根治或缓解,但有部分患者单纯放疗仍然预后不佳。尤其是宫颈腺癌,不如宫颈鳞癌对放射线敏感,临床期别较晚、淋巴结有转移的患者,初始治疗后很快又复发、转移。且其发病还有逐渐增加趋势。因此为改善预后,临床迫切需要探讨对宫颈腺癌更为有效的疗法。近年来新辅助化疗即术前或放疗前进行化疗,确实一定程度上提高了手术或/和放疗的效果。故而寻找对宫颈腺癌更有效的新辅助化疗方案的有关研究出现许多。CAP也已被用于多种人宫颈癌细胞株动物移植模型中进行研究,显示出了一定的抑癌效果,在人宫颈腺癌HeLa细胞株动物移植模型中CAP的抑瘤率可达34.6%。但CAP与放射联合在宫颈腺癌中的作用如何尚未见报道。介于CAP高效低毒的药物特点和5-FU所具有的放射增敏作用,将CAP与放射联合用于宫颈腺癌,效果值得期待。因此本研究采用人子宫颈腺癌细胞株异种移植于裸鼠建立动物模型,观察了CAP和放射线联合治疗在宫颈腺癌中的抗肿瘤效果。并通过放射线照射对宫颈腺癌细胞TP、DPD酶影响的研究,及观察联合治疗后宫颈腺癌细胞周期的变化,对其联合治疗效果的机制进行了探讨。实验材料和方法一、实验材料 1、实验动物:雌性BALB/c nu/nu裸鼠(5或6周龄,体重约20克)约220只。 2、细胞株:人宫颈腺癌CAC-1细胞株从日本札幌医科大学获得,人宫颈腺癌HeLa细胞株由中国医科大学盛京医院感染科实验室提供。 3、主要试剂及药品:CAP由F-Hofmann-Roche(Besle Switzerland)提供。5-FU购买于Kyowa Hakko Co(Tokyo Japan)和上海旭东海普药业公司。培养基(海克隆生物化学制品北京有限公司);0.1mg/ml考马斯亮蓝溶液(进口分装,上海化学试剂采购供应站);牛血清白蛋白(Sigma公司);ELISA法测定TP酶的试剂盒(德国罗氏公司);总RNA提取液Trizol(东胜创新实验技术有限公司);cDNA第一链合成逆转录试剂盒、PCR试剂盒、Taq DNA、聚合酶DNA Marker(大连宝生物工程有限公司);TP、DPD引物(上海Invitrogen英俊生物技术有限公司合成);四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma公司),DMSO试剂二甲基亚砜(北京夏斯生物技术有限公司),碘化丙啶(PI)(sigma公司)。 4、主要实验仪器和设备: 超净工作台(苏州净化设备厂);瓦里安直线加速器2300C/D-SN293(美国);超声粉碎机UP200H(德国);DV600分光光度计(美国);振荡机RS-232(美国);酶标仪GIS-1000 Tanon(上海天能科技有限公司);紫外分光光度仪Wellscan MK3(德国);电泳仪BIO-RADpower/PAC 300(美国);PCR仪PTC-100(美国);凝胶成像分析系统(基因有限公司);流式细胞仪(FACS-440型);Mitsubishi电子射线装置(机型EXL-15DP,4MeV,剂量率5Gy/分)。二、实验方法 1、人宫颈腺癌CAC-1细胞株动物

关键词：卡培他滨放射线子宫颈腺癌氟尿嘧啶胸苷磷酸化酶二氢嘧啶脱氢酶细胞周期裸鼠

来源：评论

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低氧诱导因子1α（HIF-1α）在喉鳞癌中的表达及其临床意义的研究

低氧诱导因子1α（HIF-1α）在喉鳞癌中的表达及其临床意义的研究

引用

作者：宋冬梅河北医科大学

学位级别：博士

缺氧是人类和动物实体肿瘤的一个共同特征。低氧诱导因子1a(hypoxiainduciblefactor1α，HIF-1α)是机体在低氧条件下产生的一转录活化因子，它能指导多种低氧反应基因的转录，为机体适应低氧，维持内环境稳态的一个重要因素。当周围环... 详细信息

缺氧是人类和动物实体肿瘤的一个共同特征。低氧诱导因子1a(hypoxiainduciblefactor1α，HIF-1α)是机体在低氧条件下产生的一转录活化因子，它能指导多种低氧反应基因的转录，为机体适应低氧，维持内环境稳态的一个重要因素。当周围环境的氧浓度下降时，HIF-1α表达增加，并且其表达增加表现在多个水平上，包括转录和蛋白等水平，但主要是蛋白水平明显增多。HIF-1α是HIF-1的一个亚基，是唯一的氧调节亚单位，HIF-1α的活性是HIF-1的决定性成分，其活性对维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管形成以及促进肿瘤的增殖生长、侵袭和转移起着重要作用，并受多种因子的调控和影响。在多种恶性肿瘤中都存在HIF-Ⅰα蛋白的过表达，并与预后不良密切相关。HIF-1α与肿瘤的关系已成为近年来肿瘤学研究中的一个新的热点。有关HIF-1α与喉鳞癌发生发展关系的研究，目前国内尚未见报道。本实验首先从人喉鳞癌实体瘤入手，应用免疫组织化学技术了解缺氧诱导因子1α(HIF-1α)极其相关调控因子与喉鳞癌生物学行为的关系;进而通过体外细胞培养，从分子水平探讨低氧条件下，缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及其相关调控因子在头颈肿瘤中的表达及相互作用机制，进一步明确HIF-1α与化疗抵抗的关系;在此基础上进行靶向HIF-1α活性及表达的实验，深入探讨以缺氧为靶点对治疗头颈肿瘤及化疗增敏的潜在临床价值。方法： 1HIF-1α在喉鳞癌中的表达及其与喉鳞癌生物学行为的关系。标本选自河北医科大学病理教研室2001年1月1日-2004年12月31日术前未经治疗的喉声门上型癌、喉咽癌病人63例标本，其中男59例，女4例;中位年龄56岁(43～72岁)。根据国际抗癌协会(UICC)标准(1997)确定TNM分期。喉癌分型：喉声门上型癌42例，喉咽癌21例;临床分期：Ⅰ期8例Ⅱ期11例、Ⅲ期14例、Ⅳ期30例;病理学分级：鳞癌Ⅰ级15例，鳞癌Ⅱ级29例、鳞癌Ⅲ级19例;病理证实颈部淋巴结转移组41例，无转移组22例。取癌旁正常粘膜组织20例作为对照。所有标本均一部分迅速置于液氮罐中保存，一部分标本离体后2小时内放入10％中性福尔马林中固定24小时，石蜡包埋，常规病理HE染色，所有标本均经两位副高以上职称的病理科医生确定病理性质和病理学分级。肿瘤组织均病理证实为鳞状细胞癌，喉癌旁正常粘膜病理为正常喉组织。 1.1免疫组织化学染色方法对喉鳞癌63例标本进行检测，其中病理证实颈部淋巴结转移组41例，无转移组22例。取癌旁正常粘膜组织20例作为对照。指标为HIF-1α、VEGF、P53。结果判定：每例标本以400倍光镜下随意选取10个视野，计数每个视野中100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均数求其阳性百分率作为结果。平均阳性细胞所占比例≤5％判定为阴性，阳性染色细胞＞5％判定为阳性。 1.2流式细胞仪对转移组患者的原发灶、淋巴结转移灶以及非转移组标本检测HIF-1α、VEGF、P53蛋白表达进行定量分析，取石蜡标本切片(40μm厚)，网搓法制备单细胞样品。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底对照和阴性对照。采用美国BeckmanCoulter公司生产地Epics-XLⅡ型流式细胞仪进行检测。以荧光指数(FI)表示蛋白表达产物的相对含量，FI=(瘤细胞表达的平均荧光强度/正常对照样品平均荧光强度)。荧光指数(FI)可相对客观的反映蛋白的表达程度。 1.3用TrizolReagant进行组织总RNA提取，采用RT-PCR试剂盒对提取的总RNA进行RT-PCR反应，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在紫外凝胶投射分析系统中照相分析，分别比较HIF-1αmRNA在喉鳞癌组织和癌旁正常粘膜组织中的表达水平，分析其基因表达调控水平。 2低氧对喉鳞癌细胞系Hep-2HIF-1α及其相关基因表达的影响：人喉鳞癌细胞Hep-2分成3组：缺氧12h组、缺氧24h组及对照组。缺氧组分别在缺氧条件下(37℃，5％CO2，2％O2饱和度)培养12h和24h，对照组置于正常氧浓度条件下(37℃，5％CO2、21％O2饱和度)培养24h。流式细胞仪分别测定3组细胞周期及HIF-1α、突变型P53、VEGF表达，免疫组织化学SP法分别测定3组细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、P53、VEGF表达。RT-PCR检测各组细胞HIF-1αmRNA的表达水平。结果： 1HIF-1α在喉鳞癌中的表达及其与喉鳞癌生物学行为的关系。 1.1免疫组化染色结果显示(1)HIF-1α蛋白在癌旁正常喉黏膜中几乎无表达，在喉鳞癌组织中主要于细胞胞浆中可见致密浓染的棕色颗粒，部分切片显示其在胞浆及胞核中均有表达。(2)有

关键词：低氧诱导因子-1α 喉鳞癌免疫组织化学化疗抵抗化疗增敏体外低氧实验

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microRNA-504通过靶基因FOXP1抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡

microRNA-504通过靶基因FOXP1抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡

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作者：崔润中国医科大学

学位级别：博士

胶质瘤是成人最常见的颅内原发性恶性肿瘤，尽管目前采用手术治疗、放疗及放疗等综合治疗手段，患者的预后仍然不佳。根据世界卫生组织(WHO，worldhealth organization)的分级，多形性胶质母细胞瘤(GBM，glioblastoma)是恶性程度最高的... 详细信息

胶质瘤是成人最常见的颅内原发性恶性肿瘤，尽管目前采用手术治疗、放疗及放疗等综合治疗手段，患者的预后仍然不佳。根据世界卫生组织(WHO，worldhealth organization)的分级，多形性胶质母细胞瘤(GBM，glioblastoma)是恶性程度最高的胶质瘤，导致GBM预后不良的主要原因在于其高度的复发性。尽管近年来采用替莫唑胺和标准放疗的联合治疗，原发性GBM患者的平均生存期仅为14.6个月，5年生存率仅为9.8％。基于个体患者的GBM基因表型的改变或许可以成为实现个体化治疗的突破口。　　MicroRNA(miRNA)是一类短小的非编码RNA分子，参与到一系列重要的生物过程当中，比如细胞的增殖、凋亡、代谢及分化等。近年的研究证实miRNA在不同人类肿瘤的生成、血管生成、侵袭和凋亡中都扮演重要的角色。已经有相当多的研究显示在恶性胶质瘤中一些特定miRNA的表达是失调的。在本课题组最近的研究中发现miR-504在高级别胶质母细胞瘤中的表达明显低于非肿瘤脑组织，但是miR-504在胶质瘤中的具体作用及机制仍不清楚。　　在本实验中，我们克隆了成熟的microRNA-504的序列，并对其在胶质瘤细胞中的生物学作用进行了功能和所涉机制的初步研究。我们研究结果显示，在胶质母细胞瘤细胞系U87及U373中过表达miR-504抑制了胶质瘤细胞的增殖、细胞周期进展及活动能力，同时促进了胶质瘤细胞的凋亡。在分子机制研究中，我们发现miR-504过表达抑制了周期相关蛋白cyclin D1，cyclin E1和pRB的表达，同时促进了凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的活化。在胶质瘤细胞中，我们发现miR-504的过表达下调了FOXP1的表达水平，并且确证了miR-504的对胶质瘤的生物学行为的影响在一定程度上是通过抑制FOXP1实现的。综上所述，我们的研究结果提供了充分的证据，证明miR-504在胶质瘤发生发展过程中的重要功能。　　目的：　　研究miR-504对胶质瘤细胞恶性行为的影响，揭示miR-504在胶质瘤进展中的功能及其分子生物学机制。　　方法：　　1、细胞培养　　人脑胶质瘤细胞U87和U373细胞系培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，两种细胞均培养在37℃、5％ CO2的孵箱中。　　2、LV-miR-504-GFP慢病毒感染细胞　　通过包含有成熟miR-504序列的并标记有绿色荧光蛋白的慢病毒载体（上海吉凯生物公司）分别感染细胞系U87及U373，并于荧光显微镜下观察绿色荧光强度用于评估感染效率，构建能稳定过表达miR-504的细胞株，并用包含有miR-NC的病毒载体感染细胞作为对照组。　　3、qRT-PCR　　用Trizol(TaKaRa公司)从病毒感染的胶质瘤细胞中提取总RNA，RNA逆转录试剂盒购自Promega公司。用SYBR Green法检测miR-504的表达情况（使用Applied Biosystems7900HT Fast Real—Time PCR系统）。内参选择RUN6B，用2-ΔΔCt法进行数据分析，2-ΔΔCt反映各样品相对NC组样品目的基因的相对表达水平。miR-504及RUN6的特异性引物由广州锐博公司合成。　　4、CCK-8法测细胞增殖活性　　将构建好的miR-504过表达细胞接种在96孔板（每孔2000个细胞），共铺5板。每孔加CCK-8避光孵育2小时，用酶标仪测定450nm波长下的吸光度值，连续检测5天。绘制细胞增殖曲线。　　5、EdU法检测细胞增殖　　将待检测细胞种植于24孔板中，以浓度为50μl/ml EdU（广州锐博生物技术公司）的培养液进行孵育2小时后，孵育完成后，用4％多聚甲醛固定30分钟，去除固定液，以每孔3％ BSA的洗涤液洗涤细胞2次，加入EdU反应混合液于室温下孵育30分钟;用Hoechst33342进行细胞核染色，PBS冲洗后于荧光显微镜检测EdU阳性细胞（细胞核为红色）占总细胞数（细胞核蓝色）的比率。　　6、流式细胞仪分析细胞周期　　检测前将细胞培养液换为无血清DMEM进行同步化处理，收集细胞后，于70％冰乙醇于4℃固定细胞2小时，用含有25 mg/ml PI(propidium iodide)和10mg/mlRNA酶抑制剂的PBS进行细胞染色，避光37℃孵育30分钟;用流式细胞仪进行DNA含量检测，记录488nm处红色荧光，并用Modifit软件进行分析。　　7、流式细胞仪分析细胞凋亡　　检测前将细胞培养液换为无血清DMEM诱导凋亡，收集细胞后，用AnnexinⅤ-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒（凯基生物技术公司）检测细胞凋亡。　　8、裸鼠成瘤实验　　采用BALB/C-null裸小鼠12只（北京维通利华生物技术公司）。裸鼠饲养于中国医科大学动物实验中心在无菌室

关键词：胶质瘤发病机制 miR-504基因 FOXP1基因细胞增殖细胞凋亡

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中药通心络通过诱导微血管内皮细胞KLF5的表达上调紧密连接蛋白水平

中药通心络通过诱导微血管内皮细胞KLF5的表达上调紧密连接蛋白水...

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第十二届国际络病学大会

作者： Li-Min Li Bing Zheng Ruo-Nan Zhang Li-Shuang Jin Cui-Ying Zheng Chang Wang Pei-Pei Zhou Zong-Wei Guo Dong Ma Jin-Kun Wen 河北医科大学生物化学与分子生物学实验室/国家教育部神经和血管生物学重点实验室

通心络是在中国传统医学经络学说理论指导下研制而成的复方中药。它可以通过改善内皮细胞功能起到心血管保护作用。本研究的目的是探讨通心络对内皮细胞的保护作用是否与紧密连接蛋白的表达有关。用107 mmol/L AngⅡ诱导人心脏为血管内... 详细信息

通心络是在中国传统医学经络学说理论指导下研制而成的复方中药。它可以通过改善内皮细胞功能起到心血管保护作用。本研究的目的是探讨通心络对内皮细胞的保护作用是否与紧密连接蛋白的表达有关。用107 mmol/L AngⅡ诱导人心脏为血管内皮细胞损伤,并用不同浓度的通心络进行干预。采用Western blotting和RT-PCR对紧密连接蛋白occludin,claudin,VE-cadherin和beta-catenin进行检测。应用KLF5腺病毒的pAd-KLF5或siRNA特异性针对KLF5将人心脏微血管内皮细胞内的KLF5进行转染。以口服0.75g·kg·day的通心络治疗血管紧张素原转基因小鼠,应用antioccludin、anticlaudin、anti-VE-cadherin、antibeta-catenin和anti-KLF5抗体进行免疫组化染色。AngⅡ诱导损伤的人心脏微血管内皮细胞显著下调了紧密连接蛋白occludin,claudin,VE-cadherin和beta-catenin的表达。通心络预处理后可明显抑制AngⅡ引起的紧密连接蛋白下调;AngⅡ损伤也减少了KLF5在mRNA和蛋白水平的表达,TXL预处理后可以显著地逆转AngⅡ对KLF5表达的抑制作用。过表达和敲低KLF5的实验组结果表明KLF5可以介导心脏微血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达,应用通心络后可以增强KLF5介导的紧密连接蛋白的表达。在血管紧张素原转基因小鼠中,通心络也可以通过诱导KLF5表达增加紧密连接蛋白水平。所以中药通心络可以通过诱导微血管内皮细胞KLF5的表达上调紧密连接蛋白水平。

关键词：通心络紧密连接蛋白 KLF5 内皮细胞血管紧张素Ⅱ

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喉癌中S100A8基因调控机制研究

喉癌中S100A8基因调控机制研究

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作者：郭艳中国医科大学

学位级别：博士

喉癌中S100A8基因调控机制研究前言喉癌是头颈部常见肿瘤之一,其发病率有逐年上升的趋势,越来越多资料支持炎症是肿瘤形成及进展的重要病因之一,我们的临床资料同样显示喉癌患者通常具有慢性炎症病史。在前期工作中,我室充... 详细信息

喉癌中S100A8基因调控机制研究前言喉癌是头颈部常见肿瘤之一,其发病率有逐年上升的趋势,越来越多资料支持炎症是肿瘤形成及进展的重要病因之一,我们的临床资料同样显示喉癌患者通常具有慢性炎症病史。在前期工作中,我室充分利用东北地区的病源优势,应用比较基因组杂交（CGH）和cDNA芯片结合RT-PCR、Western blot、免疫组织化学染色等实验技术证明炎症因子S100A8在转录和翻译水平上的表达存在显著地差异性,提示可能存在S100A8基因转录后调节的异常。microRNA是近年来发现的一类大小为18～23nt的小非编码转录后调节因子,由具有发夹结构、长约70～90个碱基的单链miRNA前体（pre-miRNA）经Dicer酶加工产生。通常,其在细胞质中与Argonaute等蛋白分子形成miRISC（miRNA induced silencing complex）。在miRNA的指引下,miRISC可以特异性地识别mRNA分子的3′端长约30个碱基的非编码区,并以完全或不完全匹配的方式与其结合,降解靶基因mRNA或抑制其翻译。由于存在这样不同类型的匹配方式,使得一种miRNA可以与多种mRNA分子结合。生物信息学等研究结果表明,人类有1/3以上的蛋白编码基因受miRNA调节。miRNA通过调节目的基因的蛋白表达,发挥着类似癌基因或肿瘤抑制基因的功能,如在生物体发育、信号转导、凋亡、细胞增殖等过程中起重要作用。另外,蛋白质相互作用在生命活动中扮演着关键角色,参与了生物学中的许多生理病理活动的调控,如复制、转录、翻译、剪切、分泌、细胞周期调控、信号转导和细胞代谢等,也是寻找下游靶基因的重要手段之一。我们前期通过RNA干扰实验等发现S100A8通过NF-Kappa B信号通路参与喉癌的发生和发展,且可能位于P65下游、BCL-2上游,但S100A8在该通路中的具体机制有待进一步研究。迄今为止,有关S100A8基因上游microRNA调控及参与NF-Kappa B信号通路的具体机制研究均未见报道。在本研究中,我们通过生物信息学资源结合荧光素酶活性分析探寻S100A8基因上游具有调控作用的microRNA分子;同时,通过喉癌中S100A8相互作用蛋白的研究,深入探讨S100A8基因在喉癌中的上下游调控机制,一方面可为阐明S100A8基因在喉癌发生和发展过程中的分子机制创造条件并提供新的线索,另一方面为开展以microRNA为靶点或通过蛋白相互作用设计竞争性抑制剂的喉癌诊断和治疗奠定基础。材料与方法利用生物信息学软件对S100A8基因3′非翻译区进行microRNA靶向预测,采用终点PCR和荧光定量PC R分别检测S100A8靶向microRNA在不同细胞系和喉癌组织中的表达情况。构建野生型及突变型S100A8基因荧光报告素酶表达载体,转染Hep2细胞,通过荧光定量PCR及Western blot检测分析靶向microRNA对S100A8基因的转录后调节作用。同时,通过倒置显微镜和Transwell小室法观察并检测共转染靶向microRNA及荧光报告素酶质粒前后喉癌细胞形态学和细胞体外侵袭能力的变化,综合分析靶向microRNA对Hep2生物学行为的影响。以喉癌Hep2细胞系为实验材料,应用免疫沉淀结合质谱技术筛查S100A8相互作用蛋白质并通过免疫共沉淀及细胞免疫荧光化学对相互作用蛋白质进行验证,通过RNA干扰技术进一步揭示相互作用蛋白质之间的调控关系。实验结果一、S100A8 mRNA靶micro RNA预测采用MiRanda和RNA22软件,我们在S100A8 mRNA第341bp碱基位置（3′非翻译区）预测到一个miR-24结合位点,其与大鼠的同源性高达95%。二、喉癌中miR-24表达采用U6-snRNA作为内对照,以GES-1细胞的表达水平作为基准,终点PCR及荧光定量PCR结果表明Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823和HEK293细胞系中miR-24表达均明显下调,ANOVA分析具有统计学意义（P＜0.05）;同样,以癌旁正常组织为对照,10例喉癌组织中有7例样本（7/10,70%）存在miR-24的表达下调,双侧t检验分析具有统计学意义（P＜0.05）。三、miR-24对S100A8基因靶向调节测序结果表明,我们成功地构建了S100A8 3′LTR野生型和突变型荧光报告素酶表达载体。在Hep2和HEK293细胞中,共转染野生型S100A8表达质粒和miR-24前体组的报告基因活性相对于其它对照组明显降低,具有统计学意义（P＜0.05）,而anti-miR-24能明显逆转这一效应。荧光

关键词：喉癌 S100A8 NF-Kappa B HLA-B 转录后调控

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Diversin通过JNK促进非小细胞肺癌的增殖和侵袭能力

Diversin通过JNK促进非小细胞肺癌的增殖和侵袭能力

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作者：栾岚中国医科大学

学位级别：博士

前言：　　Diversin也被称作锚蛋白重复序列包含蛋白6(ANKRD6)，它是果蝇属Diego蛋白在哺乳动物中的同源异构体，同时参与经典Wnt/beta-catenin通路和非经典Wnt/JNK通路（即PCP通路）。而Diego则是PCP通路的核心蛋白，它与Fz-Dsh信号相... 详细信息

前言：　　Diversin也被称作锚蛋白重复序列包含蛋白6(ANKRD6)，它是果蝇属Diego蛋白在哺乳动物中的同源异构体，同时参与经典Wnt/beta-catenin通路和非经典Wnt/JNK通路（即PCP通路）。而Diego则是PCP通路的核心蛋白，它与Fz-Dsh信号相关。研究发现在新生小鼠和成鼠脑内，Diversin表达于室下区和海马区的神经母细胞和成熟神经元，并证实Diversin可以促进其增殖活性。在胚胎发育过程中Diversin通过非经典Wnt/JNK通路调节斑马鱼胚胎的原肠胚运动以及控制心脏前体的融合。Diversin作为一个分子开关，可以抑制经典的Wnt/β-catenin通路，促进非经典的Wnt/JNK通路。另外，Diversin含有一些核定位信号，转移入核后可以和转录因子AF9相互作用，而AF9能够显著增加Diversin引起的JNK活性增加。Wnt和PCP信号成员可以调控Diversin的亚细胞定位从而影响其在通路中的作用。Diversin蛋白位于细胞的中心小体，这种独特的细胞器以及衍生的纤毛在许多信号通路，包括Hedgehog, Wnt，PDGF和FGF中扮演了重要的角色。　　目前Diversin在人类肿瘤中的表达情况及意义尚不清楚，其是否具有调控肿瘤细胞增殖或侵袭的能力及分子机制等都有待于进一步探讨。在本研究中，我们用免疫组化和western blot等方法检测了Diversin蛋白在肺癌组织和细胞系中的表达，通过双向调控Diversin的表达，分别检测Diversin对经典和非经典Wnt通路中重要蛋白的影响，初步探讨了Diversin对肺癌细胞增殖侵袭的影响和可能的作用机制。　　材料与方法：　　一、组织标本与患者资料　　167例非小细胞肺癌(NSCLC)组织和38例癌旁正常肺组织均来自于中国医科大学附属第一医院病理科2004-2006年存档蜡块。在167例肺癌病例中具有完整随访资料的74例。随访是从手术之日起到随访结束日期或由于复发、转移而死亡之日止。患者（106例男性，61例女性）年龄29-81岁，中位年龄60岁。根据第七版国际抗癌联盟肺癌TNM分期标准，Ⅰ期56例，Ⅱ期32例，Ⅲ期74例，Ⅳ期5例。根据WHO2004肺癌组织学分类标准，腺癌94例，鳞癌73例。所有患者术前均未接受化疗或放射治疗。为用于蛋白质分析，另收集20例新鲜的肺癌组织及相对应的癌旁正常的肺组织，保存在-70℃冰箱内。　　二、免疫组织化学染色　　手术切除的组织均经过10％中性福尔马林固定后，石蜡包埋，制成4μm切片，采用SP免疫组化法进行染色。一抗使用鼠源性的Diversin，以1∶100(Anti-Diversin购于Santa Cruz Biotechnology， USA)4℃孵育过夜。以PBS代替一抗作为空白对照。生物素标记的二抗IgG(Fuzhou，China)37℃孵育20min，DAB显色。结果判定:每张切片随机选择5个视野，每个视野计数100个瘤细胞。根据计数细胞着色的百分比，将Diversin的表达划分为5个等级:无着色为0分，1％-25％为1分，26％-50％为2分，51％-75％为3分，76％以上为4分。再根据细胞着色的强度，将Diversin的表达划分3个等级:无着色为0分，浅黄色颗粒为1分，深黄色或者黄褐色颗粒为2分。将二者相乘，所得乘积即为该切片的最终得分。Diversin阳性表达定位于胞浆和胞膜。根据38例正常的支气管上皮染色后，其得分均为＜3分，于是实验中将得分＜3分的计为阴性表达（正常表达），而得分≥3分的计为阳性表达（高表达）。　　三、细胞培养　　A549，H1299 and H157细胞系购于美国标准细胞培养所(Manassas,VA，USA);SPC-A-1、LTEP-A-2和正常支气管上皮细胞系HBE购于上海细胞库（Shanghai，China）;PG-BE1和PG-LH7由北医郑杰教授馈赠。细胞培养基采用RPMI1640(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，其中含10％热灭活新鲜小牛血清(Invitrogen)，用25cm培养瓶在5％CO2培养箱中培养，每两天用0.25％胰酶(Invitrogen)消化传代。　　四、质粒构建与转染　　pcDNA3.1-HA-Diversin质粒由Walter Birchmeier教授(Max Delbrueck-Centerfor Molecular Medicine，Berlin，Germany)惠赠。 Diversin siRNA由上海吉玛合成，转染试剂lipo2000购于Invitrogen(Carlsbad，CA，USA).siRNA干扰序列如下:ANKRD6-HOMO-2171:5'GAGGCACUCAAACUAAG

关键词：非小细胞肺癌锚蛋白重复序列包含蛋白6 细胞增殖分子机制

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PI3K/AKT信号传导通路在血管瘤发生发展中的作用及靶向该通路治疗血管瘤的实验研究

PI3K/AKT信号传导通路在血管瘤发生发展中的作用及靶向该通路治疗...

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作者：郑宁宁中国医科大学

学位级别：博士

目的　　血管瘤是一种常见的血管内皮肿瘤，在我国的发病率约为0.3％～1%，具有一系列广泛的临床表现。从良性的婴幼儿血管瘤，恶性度低的血管内皮瘤，到多发于成人的恶性血管肉瘤。血管瘤及相关的血管畸形可见于多种先天性遗传性疾病... 详细信息

目的　　血管瘤是一种常见的血管内皮肿瘤，在我国的发病率约为0.3％～1%，具有一系列广泛的临床表现。从良性的婴幼儿血管瘤，恶性度低的血管内皮瘤，到多发于成人的恶性血管肉瘤。血管瘤及相关的血管畸形可见于多种先天性遗传性疾病，通常伴有多种组织器官发育缺陷。到目前为止，血管瘤形成的分子及细胞学机制仍然不清。与正常血管内皮细胞相比，血管瘤内皮细胞增殖、侵袭能力增强。血管内皮细胞过度增殖，病理性血管生成是血管瘤形成的主要生物学行为。PI3 K/Akt信号转导通路在广泛的人类肿瘤谱中失调，该通路某些成分的突变所导致的功能获得或功能缺失能够引起细胞转化，该通路是调节内皮细胞生存、血管生成的主要信号调节途径，在血管瘤中表现出异常激活。VEGF是该信号通路主要的信号刺激因子。AKT是该信号通路的中心调控点，其完全磷酸化由Thr308和Ser473磷酸化组成。AKT Thr308磷酸化由上游激酶PDK1激活，而Ser473则由mTORC2磷酸化激活。AKT完全磷酸化是其发挥生物学功能所必需的。哺乳动物AKT有三种亚型：Akt1，Akt2 and Akt3。这三种亚型由严格区分却又高度同源的基因编码。特异性AKT亚型基因敲除鼠研究表明，不同AKT亚型表现出不同的功能。目前，AKT亚型特异性功能研究成为肿瘤研究中的热点。雷帕霉素是mTOR抑制剂，根据不同细胞类型发挥不同程度的mTORC1和mTORC2抑制作用，动物研究表明，雷帕霉素可以显著抑制实体瘤中AKT的活性及病理性血管生成。本研究探讨血管瘤中AKT信号传导通路的调节作用;通过慢病毒介导的shRNA靶向沉默AKT磷酸化的上游激酶PDK1、mTORC2-RICTOR，探讨这两种AKT上游激酶对AKT活性及血管瘤的生长、增殖及侵袭的影响及其作用机制;探讨低剂量雷帕霉素对血管瘤的治疗作用;探讨AKT三种亚型对良、恶性血管瘤生长、增殖、侵袭的影响及其作用机制。　　实验材料：　　实验用EOMA细胞，293T细胞由哈佛医学院，Laura Benjamin实验室提供，婴儿血管瘤组织、原代婴儿血管瘤内皮细胞、人皮肤微血管内皮细胞、ASM.5细胞及正常人皮肤组织、小鼠血管内皮细胞由哈佛医学院Carole Perruzzi友情赠送及技术支持。实验动物为裸鼠，4-6周，雌性(Charles River，MA)。实验所用AKT信号通路相关抗体、VEGF/VEGF受体等抗体均购于Cell SignalingTechnology。LY-294002(L9908)购于Sigma。　　实验方法：　　 1、慢病毒介导的shRNA靶向基因沉默靶向PDK1、RICTOR、AKT1、AKT2、AKT3的小鼠shRNA序列克隆到pLKO慢病毒表达载体中。该质粒由哈佛大学LeslieWardwell，RNAi Facility，Dana-Farber Cancer Institute构建。在293T细胞内包装成慢病毒颗粒，转染靶细胞。　　 2、Western Blot方法检测各种蛋白激酶激活及表达情况。　　细胞经含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂的细胞裂解液作用后，提取细胞总蛋白，调节蛋白浓度均等，在4%-20%的Tris-Glycine胶上上样，每孔蛋白量为20ug。电泳后转移至硝酸纤维素膜，加入适当比例稀释的一抗孵育过夜，第二天加入HRP标记的二抗作用后，进行膜孵育及曝光检查蛋白表达情况。　　 3、利用WST-1细胞增殖检测法检测血管瘤细胞增殖能力。　　 4、Transwell Matrigel方法检测血管瘤细胞侵袭转移能力。　　 5、体外出芽实验检测血管瘤细胞新生血管形成能力。　　 6、免疫组织化学方法检测几种人类良、恶性血管瘤中AKTSer473位点磷酸化表达情况。　　结果：　　 1、人血管瘤中AKT磷酸化活性异常增高福尔马林固定，石蜡包埋的人良、恶性血管瘤组织经AKT磷酸化Ser473位点的抗体染色，结果表明，与邻近的正常血管组织比较，在所选血管瘤组织中，都表现出AKT Ser473磷酸化表达增强。　　 2、慢病毒介导的shRNA靶向沉默PDK1、RICTOR及AKT三种亚型的表达Western Blot结果表明，shRNA成功抑制了各个靶蛋白的表达，获得了稳定沉默靶蛋白的血管瘤细胞。　　 3、PDK1、RICTOR基因表达沉默下调AKT磷酸化水平，从而抑制血管瘤生长、增殖及侵袭Western Blot结果表明：PDK1、RICTOR基因沉默分别抑制AKT在Thr308位点和Ser473位点的磷酸化。与EOMA空白对照组相比，PDK1、RICTOR基因沉默明显抑制肿瘤细胞生长、增殖及侵袭。靶向PDK1、RICTOR基因治疗将会是血管瘤治疗的一条新途径。　　 4、小鼠活体内实验表明雷帕霉素可以显著

关键词：血管瘤 AKT活性信号传导通路血管内皮生长因子慢病毒介导发病机制

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