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Trp1707Ser突变对重组凝血因子Ⅷ轻链与血管性血友病因子结合作用的影响机制

中华血液学杂志 2014年第11期35卷 995-999页

作者：迟昆邵妍妍陆晔玲戴菁丁秋兰王学锋王鸿利上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海血液学研究所、医学基因组学国家重点实验室 200025 上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科 200025

目的探索Trp1707Ser突变对重组凝血因子Ⅷ轻链（rFⅧLC）与血管性血友病因子（VWF）结合作用的影响机制.方法以长链PCR法构建野生型和Trp1707Ser突变型rFⅧLC原核表达质粒,应用BL21原核表达系统进行蛋白表达,梯度复性法对表达蛋白进... 详细信息

目的探索Trp1707Ser突变对重组凝血因子Ⅷ轻链（rFⅧLC）与血管性血友病因子（VWF）结合作用的影响机制.方法以长链PCR法构建野生型和Trp1707Ser突变型rFⅧLC原核表达质粒,应用BL21原核表达系统进行蛋白表达,梯度复性法对表达蛋白进行结构复性,SDS-PAGE和Western blot对所得蛋白进行鉴定.复性后蛋白使用GST柱纯化并收集,表面等离子共振法（SPR）检测B区缺失重组FⅧ（BDD-rFⅧ）、野生型和突变型rFⅧLC与VWF的结合活性,结果 SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示所表达蛋白（相对分子质量110×10^3）与目的蛋白相符,蛋白纯化峰图显示野生型蛋白表达量高于突变型,SPR检测结果显示BDD-rFⅧ、野生型rFⅧLC、突变型rFVⅧLC蛋白与VWF的结合活性均呈浓度依赖性增强,BDD-rFⅧ与VWF结合KD值（12.2）明显低于野生型rFⅧLC（48.9）和突变型rFⅧLC（46.3）,结论 Trp1707Ser突变对原核表达rFⅧLC与VWF的结合作用无明显影响,重链对FⅧ与VWF结合作用的影响更为重要。

关键词：血友病A 因子Ⅷ 突变 von Willebrand因子

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miR-145靶向调控DAB2对前列腺癌PC3细胞迁移和侵袭能力的影响

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遗传 2014年第1期36卷 50-57页

作者：谢树高谢银银张元亮黄秋花上海交通大学医学院附属瑞金医院医学基因组学国家重点实验室上海血液学研究所上海200025 诺思格(北京)医药科技开发有限公司北京100048

已有研究表明,miR-145在多种肿瘤中低表达,并与细胞增殖和转移相关。文章通过生物信息学分析并结合体外实验鉴定,发现DAB2(Disabled homolog 2)为miR-145在肿瘤转移过程中累及的新靶点。DAB2一直被认为是一个重要的抑癌基因,在多种肿瘤... 详细信息

已有研究表明,miR-145在多种肿瘤中低表达,并与细胞增殖和转移相关。文章通过生物信息学分析并结合体外实验鉴定,发现DAB2(Disabled homolog 2)为miR-145在肿瘤转移过程中累及的新靶点。DAB2一直被认为是一个重要的抑癌基因,在多种肿瘤标本中表达低下。然而,研究发现,在具高侵袭能力的前列腺癌细胞株PC3中DAB2基因却呈较高水平表达。另外,外源表达miR-145能显著下调DAB2表达水平,并抑制PC3细胞的迁移和侵袭能力,且这种miR-145诱导的PC3细胞功能缺陷能被DAB2过表达修复。上述结果表明,miR-145能通过靶向调控DAB2而影响高侵袭前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力。

关键词： miR-145 DAB2基因前列腺癌细胞PC3 细胞迁移和侵袭

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Study of combined coagulation factor Ⅴ and factor Ⅷ deficiency in China

Study of combined coagulation factor Ⅴ and factor Ⅷ defici...

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中华医学会第15次全国血栓与止血学术会议

作者： shao yanyan Ding Qiulan Lu Yeling Dai Jing Wang Xuefeng Xi Xiaodong Wang Hongli 上海血液学研究所医学基因组学国家重点实验室上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科

Background: With the prevalence of 1∶ 1, 000, 000, combined deficiency of coagulation factor Ⅴ (FV) and factor Ⅷ (FⅧ) (F5F8D) is a rare autosomal recessive bleeding disorder characterized by a reduction in plasma concentrations of FⅤ and FⅧ.Most patients harboring this disease hold low activities of FⅤ and FⅧ between 5％ and 30％ and manifest mild-to-moderate bleeding tendency.

关键词：

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沙门菌黏合素SafD基因的克隆表达及纯化

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诊断学理论与实践 2014年第6期13卷 616-619页

作者：张丽蒙国宇上海交通大学医学院附属瑞金医院上海血液学研究所医学基因组学国家重点实验室上海200025

目的:建立并分析获得足量的沙门菌黏合素SafD蛋白的方法 ,以用于相关的结构、功能及应用研究。方法:通过分子克隆技术分别构建原核表达质粒SafD(31-156)+pet15b和SafD(31-156)-DSC+pet15b,将测序正确的重组质粒转化到大肠埃希菌BL21,用... 详细信息

目的:建立并分析获得足量的沙门菌黏合素SafD蛋白的方法 ,以用于相关的结构、功能及应用研究。方法:通过分子克隆技术分别构建原核表达质粒SafD(31-156)+pet15b和SafD(31-156)-DSC+pet15b,将测序正确的重组质粒转化到大肠埃希菌BL21,用异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达,并利用蛋白纯化技术纯化蛋白。结果:SafD(31-156)+pet15b重组克隆所表达的蛋白降解,该克隆在后续的研究中不可用;而SafD(31-156)-DSC+pet15b重组克隆所表达的蛋白很稳定,经纯化得到纯度约为95%的目的蛋白,蛋白量约为1 mg/L,可用于后续的结构、功能及应用研究。结论:利用大肠埃希菌BL21细胞表达并纯化了重组沙门菌黏合素SafD蛋白,为进一步研究SafD的结构和功能奠定了基础。

关键词：沙门菌菌毛克隆纯化诊断试剂盒

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大鼠髁突软骨细胞发育中相关信号通路的初步筛查

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口腔颌面外科杂志 2014年第6期24卷 405-412页

作者：李宁江莉婷谢银银魏立高益鸣上海交通大学医学院附属瑞金医院口腔科上海200025 上海交通大学医学院附属瑞金医院上海血液学研究所医学基因组学国家重点实验室上海200025 上海市伤骨科研究所上海200025

目的:通过建立的大鼠髁突软骨细胞发育过程中蛋白表达差异谱,分析可能参与的信号通路,为进一步认识髁突软骨生理性及病理性生长改建的信号调控机制提供相关信息。方法:收获出生后1、7、14、28 d共4组SD大鼠髁突软骨细胞,甲苯胺蓝染色、... 详细信息

目的:通过建立的大鼠髁突软骨细胞发育过程中蛋白表达差异谱,分析可能参与的信号通路,为进一步认识髁突软骨生理性及病理性生长改建的信号调控机制提供相关信息。方法:收获出生后1、7、14、28 d共4组SD大鼠髁突软骨细胞,甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定软骨细胞。提取各组软骨细胞总蛋白,采用i TRAQ标记定量蛋白,2D nano-HPLC和基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF),获取出生后大鼠髁突软骨细胞发育过程中差异蛋白的表达谱,所得数据用MASCOT软件处理,筛选样本之间有意义的差异蛋白,运用GO法及David软件进行KEGG信号通路分析。结果 :共鉴定137种具有可信度表达的蛋白,有44种蛋白参与至少27条KEGG信号通路,其中ECM-受体相互作用、焦点粘连、actin骨架调节、Ca2+信号通路、血管平滑肌收缩、Gn RH信号通路、肌醇三磷酸代谢、磷脂酰肌醇信号系统以及核糖体等信号通路具有统计学意义。结论:在大鼠髁突软骨发育中,各信号通路蛋白在时间、空间上差异性表达,共同形成复杂的信号传递网络。

关键词：髁突软骨细胞蛋白质组学信号通路鼠

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黄芩苷诱导T细胞淋巴瘤凋亡的初步研究

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诊断学理论与实践 2014年第4期13卷 398-402页

作者：熊杰朱伟嵘钱樱赵维莅上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科上海血液学研究所医学基因组国家重点实验室上海200025 上海交通大学医学院附属瑞金医院中医科上海200025

目的:探讨黄芩苷对T细胞淋巴瘤细胞的诱导调亡作用及其机制。方法:采用黄芩苷处理白血病细胞株Jurkat,3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法测定细胞生长抑制率,细胞甩片瑞氏染色法观察细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋... 详细信息

目的:探讨黄芩苷对T细胞淋巴瘤细胞的诱导调亡作用及其机制。方法:采用黄芩苷处理白血病细胞株Jurkat,3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法测定细胞生长抑制率,细胞甩片瑞氏染色法观察细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶caspase-3、caspase-8、caspase-9及AKT/ERK-MYC信号通路的表达,并用Calcusyn软件分析其与阿霉素、环磷酰胺联合使用的药效。结果:黄芩苷作用于Jurkat细胞48 h后的半数抑制浓度(IC50)为(24.32±1.01)μg/mL,且其生长抑制作用呈药物浓度-时间依赖性。黄芩苷组细胞呈现细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测凋亡细胞百分比亦明显高于对照组,且呈药物浓度依赖性,而这种作用可被pan-caspase抑制剂ZVAD-FMK逆转。黄芩苷作用于Jurkat细胞48 h后,活化剪切型caspase-3、caspase-8、caspase-9表达均上调,AKT/ERK-MYC通路被抑制。此外,黄芩苷与阿霉素联合使用具有显著的协同效应。结论:黄芩苷可有效抑制T细胞淋巴瘤细胞增殖,诱导内源性和外源性凋亡,抑制AKT/ERK-MYC信号通路,并与阿霉素有显著的协同效应,具有良好的临床应用前景。

关键词：黄芩苷 T细胞淋巴瘤细胞凋亡信号通路协同效应

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F8基因新的异常内含子1倒位的分子机制研究

F8基因新的异常内含子1倒位的分子机制研究

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中华医学会第八次全国中青年检验医学学术会议

作者：游国岭迟昆陆晔玲戴菁王学锋丁秋兰奚晓东王鸿利上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科上海交通大学医学院附属瑞金医院血液学研究所医学基因组学国家重点实验室上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科

＜正＞目的:本研究对1例新发现的异常内含子1倒位的家系进行临床诊断,基因诊断及致病机制的研究,并阐释新的异常内含子1倒位的重组机制。方法:应用长距离PCR及序列特异PCR进行内含子22和内含子1倒位的检测。多重荧光PCR法对6个STR位点（...

＜正＞目的:本研究对1例新发现的异常内含子1倒位的家系进行临床诊断,基因诊断及致病机制的研究,并阐释新的异常内含子1倒位的重组机制。方法:应用长距离PCR及序列特异PCR进行内含子22和内含子1倒位的检测。多重荧光PCR法对6个STR位点（F8Int13,DXS15,DXS9901,IKBKG,DXS1073和DXS1108）多态性检测进行遗传连锁分析验证。AccuCopy多重基因拷贝数检测技术对患者F8基因所有外显子进行拷贝数变异（CNVs）分析。应

关键词：

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丙戊酸联合替西罗莫司抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞生长的机制研究

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中国实验血液学杂志 2013年第6期21卷 1441-1447页

作者：郑重赵艳董丽华王黎程澍赵维莅上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科上海血液学研究所医学基因组学国家重点实验室上海200025

本研究探讨联合应用短链脂肪酸类去乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸(VPA)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂替西罗莫司(TEM)抑制弥漫大B淋巴瘤细胞生长的机制。应用MTT法检测细胞增殖抑制率,瑞氏染色检测细胞形态学改变,流式细胞术检测... 详细信息

本研究探讨联合应用短链脂肪酸类去乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸(VPA)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂替西罗莫司(TEM)抑制弥漫大B淋巴瘤细胞生长的机制。应用MTT法检测细胞增殖抑制率,瑞氏染色检测细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡、周期及自噬相关蛋白,透射电子显微镜检测细胞超微结构变化,蛋白质印迹法检测相关蛋白水平。结果表明,单用VPA和TEM均可抑制淋巴瘤细胞增殖,两药合用抑制作用更为显著;流式细胞术检测结果显示,两药联合后可阻断细胞周期,引起自噬相关蛋白LC3表达增高;电子显微镜检测进一步证实,经VPA及TEM处理后的细胞出现自噬体和自噬溶酶体,两药合用时自噬现象更为显著;蛋白质免疫印迹证实,自噬通路相关蛋白的表达发生改变;经VPA处理后HDAC1和HDAC3表达下调,组蛋白乙酰化水平升高,表明VPA可通过表观遗传学调控影响淋巴瘤细胞增殖、促进其自噬。结论:VPA和TEM在阻断淋巴瘤细胞增殖、促进细胞自噬方面具有协同效应,为药物联合治疗提供了新的理论基础,具有良好的临床应用前景。

关键词：去乙酰化酶抑制剂 mTOR抑制剂自噬弥漫大B细胞淋巴瘤丙戊酸替西罗莫司

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造血干细胞移植建立血小板整合素β3胞内段截短体转基因小鼠模型

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中国实验血液学杂志 2013年第3期21卷 667-673页

作者：崔雄鹰施小凤黄建松刘萍陶岚岚周玉兰阮铮奚晓东上海交通大学医学院附属瑞金医院上海血液学研究所医学基因组学国家重点实验室上海200025

本研究通过逆转录病毒感染整合素β3缺陷小鼠(β3-/-)骨髓造血干细胞再进行骨髓移植建立β3及其胞内段不同截短体的转基因小鼠模型,为进一步研究整合素β3胞内段在血小板双向信号转导途径中的作用提供基础。将整合素β3野生型、β3-Δ7... 详细信息

本研究通过逆转录病毒感染整合素β3缺陷小鼠(β3-/-)骨髓造血干细胞再进行骨髓移植建立β3及其胞内段不同截短体的转基因小鼠模型,为进一步研究整合素β3胞内段在血小板双向信号转导途径中的作用提供基础。将整合素β3野生型、β3-Δ759(缺失R760GT762氨基酸片段)和β3-Δ754(缺失T755NITYRGT762氨基酸片段)的cDNA分别克隆至带有GFP编码基因的MSCV MigR1逆转录病毒载体质粒中,用质粒转染BOSC23包装细胞株包装出带有β3全长及不同突变体的逆转录病毒,再感染β3-/-供体小鼠骨髓细胞,尾静脉注射移植入经致死剂量辐照的野生型C57BL/6小鼠体内,移植后6-8周流式细胞术检测GFP和β3的表达率以评估转基因效率。结果表明,成功建立了空载(Vector)、β3野生型和截短突变β3-Δ759、β3-Δ754等4种小鼠模型,血小板转基因成功的比率(即GFP阳性率)为18%-66%,转基因血小板β3表达可达到β3+/-水平。结论:利用逆转录病毒感染的造血干细胞移植建立血小板转基因小鼠模型是一种高通量快速有效的建立转基因小鼠模型的方法,这为进一步研究整合素β3胞内不同区段对血小板整合素信号转导途径的影响及体内对血小板进行基因操作和基因治疗奠定了基础。

关键词：血小板整合素β3 截短突变逆转录病毒转基因小鼠模型造血干细胞移植

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纤维蛋白原γ链Arg275His突变所致异常纤维蛋白原的功能研究

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中华血液学杂志 2013年第3期34卷 190-194页

作者：周景艺王学锋丁秋兰许冠群张利伟戴菁陆晔玲奚晓东王鸿利上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海血液学研究所医学基因组学国家重点实验室 200025

目的对两个遗传性异常纤维蛋白原血症家系的突变纤维蛋白原（Fg）进行功能研究。方法常规筛查凝血功能；Fg抗原和活性分别用免疫比浊法和Clauss法测定；抽提DNA，对Fg3个基因（FGA、FGB和FGG）以及抗凝血酶基因（AT3）所有外显子及侧翼... 详细信息

目的对两个遗传性异常纤维蛋白原血症家系的突变纤维蛋白原（Fg）进行功能研究。方法常规筛查凝血功能；Fg抗原和活性分别用免疫比浊法和Clauss法测定；抽提DNA，对Fg3个基因（FGA、FGB和FGG）以及抗凝血酶基因（AT3）所有外显子及侧翼序列进行PCR扩增、测序及分析；采用常规血栓弹力图（TEG）和功能性FgTEG检查对家系B先证者及其父亲进行凝血功能的综合评价及血浆功能性Fg评估；应用Westernblot检测血浆赡肽链分子量；采用赡动态聚集曲线和纤维蛋白溶解曲线实验检测血浆Fg的功能。结果2例先证者凝血酶原时间（。rT）和爬虫酶凝固时间（RT）明显延长，Fg活性仅为0．5∥L和0．6g／L，但其抗原均正常，分别为2．32g／L和2．66g／L。两个家系先证者均存在1链Arg275His杂合突变，家系B先证者的祖父和姑母同时检出AT3g．5876T〉C（Serll6Pro）杂合突变。家系B先证者及其父亲TEG检测结果中α值分别接近和低于正常参考值范围下限，但最大波幅（MA值）均为正常；在功能性FgTEG检测中，MA值明显偏低。Fg动态聚集曲线中先证者和家系患者的起跳时间明显延长、峰值明显降低。纤维蛋白溶解曲线中多数患者的纤维蛋白在特定时间内不能被纤溶酶原完全溶解。结论首次发现遗传性异常纤维蛋白原血症合并AT缺陷的患者。1链Arg275His突变使Fg在纤维蛋白单体聚合以及纤维蛋白溶解方面出现异常。联合应用常规TEG和功能性TEG检测，可以更好地评估异常纤维蛋白原血症患者Fg的功能。

关键词：异常纤维蛋白原血症,遗传性纤维蛋白原血栓弹力图 γArg275His突变凝血酶缺陷症,遗传性

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