我们前期研究发现新型双重5α-还原酶抑制剂度他雄胺可以干扰大鼠血-附睾屏障和精子成熟,引起大鼠不育。本研究(1)首先通过度他雄胺诱导雄性大鼠不育药效学研究,建立了药物诱导大鼠附睾不育模型及其评价体系。包括CASA分析附睾精子活力和形态;合并使用透射电镜技术对各组附睾尾部精子进行透射电镜分析,评价度他雄胺对大鼠精子成熟的影响;采用SYBR-14和PI双重荧光染色计算精子存活率;采用Elisa法测定大鼠睾酮(T)和双氢睾酮(DHT)血清浓度,评价度他雄胺对雄鼠雄激素水平的影响;采用HE染色法对各组睾丸、附睾进行组织学分析,同时采用透射电镜技术对附睾上皮细胞超微结构进行分析。这为今后不育治疗和男性避孕药物研究提供了动物模型及参考。(2)通过透射电镜分析附睾细胞紧密连接变化,RT-PCR分析度他雄胺组和对照组附睾上皮连接蛋白Claudin1和β-catenin基因表达变化;免疫组化和免疫印迹分析其蛋白表达变化,结果度他雄胺显著抑制雄性大鼠生育,与其降低大鼠血清DHT水平,进而抑制附睾上皮连接关键基因Claudin1和β-catenin表达和破坏附睾上皮紧密连接有关。(3)通过双向电泳结合二维反向色谱和同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术,经过样品制备、SDS-PAGE电泳检测、FASP酶解、LC-MS质谱分析,结合BLAST2GO、David和KEGG蛋白功能分类软件对差异蛋白进行了分子功能、生物过程和细胞组分功能分类和信号通路分析,分析鉴定了度他雄胺作用大鼠和正常大鼠附睾管腔液的差异蛋白。结果从附睾腔液4239个unique peptide中鉴定出蛋白组1040个,根据蛋白显著差异标准(>1.5或<0.66,同时P<0.05),度他雄胺显著影响的附睾腔液蛋白共23个,其中上调16个,下调7个,其中7个显著下调的蛋白中有3个是β防御素家族成员,有可能是度他雄胺影响附睾腔精子成熟和雄性生育力的关键所在。该研究将有助于揭示精子在附睾中成熟的分子机理,为男性不育诊断和治疗提供新的药靶位点,也为研发新型阻断精子成熟的男性避孕药物提供设计思路。
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