为分离自交不亲和性(self-incompatibility, SI)关键基因M位点蛋白激酶(M-locus protein kinase, MLPK)的两种关键转录本MLPKf1和MLPKf2,并纯化其激酶域蛋白,本研究以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)自交不亲和系(...
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为分离自交不亲和性(self-incompatibility, SI)关键基因M位点蛋白激酶(M-locus protein kinase, MLPK)的两种关键转录本MLPKf1和MLPKf2,并纯化其激酶域蛋白,本研究以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)自交不亲和系(S;S;)为实验材料,提取羽衣甘蓝柱头总RNA,通过RT-PCR和RACE获得BoMLPKf1和BoMLPKf2全长基因,然后将其激酶域的编码区克隆到载体pET-14b和pCold-SUMO上并转化到大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。BoMLPKf1和BoMLPKf2开放阅读框全长分别为1 215 bp和1 233 bp,分别编码404和410个氨基酸的蛋白,二者C端386个氨基酸长度的激酶域序列一致。构建MLPK激酶域pET-14b-MLPK-KD融合表达载体,进行原核表达纯化,发现重组蛋白表达时形成包涵体。构建pCold-SUMO-MLPK-KD表达载体,转化到有分子伴侣的表达菌株BL21(DE3)Chaprone中,纯化出可溶的BoMLPK-KD蛋白,该融合蛋白分子量约58 kDa。进一步又对纯化蛋白进行质谱分析,结果显示纯化蛋白即为羽衣甘蓝MLPK的激酶结构域蛋白。该研究为探讨MLPK蛋白的生物学功能奠定基础。
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