心房颤动(Atrial fibrillation,AF)简称AF,是临床上最常见的房性心律失常,AF的并发症以及病死率近年来逐年增高,为临床AF治疗带来一定的挑战。AF的具体发生病理生理机制仍未明确。肺静脉的局灶激动对于AF的发生至关重要,但是在AF维持阶段,心房的结构重构以及电生理重构也起到至关重要的作用,在持续性AF的研究中发现,心肌细胞中Ca2+的释放异常被认为是最核心的一环。而大量研究证实,细胞自噬(Autophagy)在心肌损伤中扮演着重要的角色,它是一种由氧化应激、损伤、缺血等诱发的非凋亡性、程序性细胞死亡方式。目前研究认为,自噬是细胞纤维化的初始状态,而且大量动物研究亦证实AF细胞中存在着自噬性细胞死亡。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的自噬已在多种疾病和病理过程中被观察到。ERS反应主要通过IRE1/JNK通路可以促进细胞自噬的发生,已被证实可以直接影响自噬关键蛋白Beclin-1以及Bcl-2的磷酸化,促进细胞自噬的发生,而ERS亦可以通过MAPKs(mitogen-activated protein kinases)通路促发心肌细胞自噬,进一步引起心房肌纤维化,在AF发生机制中发挥重要作用。钙蛋白酶-1(Calpain-1)Calpain-1可通过调控钙离子稳态而在AF发生中起至关重要的作用。ERS与AF密切相关,ERS-自噬反应可促进心房肌细胞纤维化的发生,而心房肌纤维化是AF发生的重要病理性结构重构,进而在AF发生机制中起到重要作用。Calpain-1在ERS的发生机制中起到重要的调节作用,因此,Calpain-1与ERS的相互作用是否是引起AF发生的重要机制之一呢?这是一个值得深入研究的问题。本课题将在业已建立的快速起搏心房兔AF模型上,从整体、细胞及超微结构水平,深入探讨Calpain-1对ERS-自噬表达水平变化的影响,并重点研究其对肌浆网钙离子荧光强度事件以及延迟后除极(delayed after depolarization,DAD)等异常电触发活动的调控机制,明确Calpain-1与ERS-自噬的相互作用在AF发生机制中的作用及意义,有助于揭示AF发生及发展的可能电重构以及结构重构机制,为AF治疗靶向药物的研发,提供新的思路和理论依据。第一部分AF患者心房肌Calpain-1及ERS-自噬相关基因表达的研究一、研究目的通过临床AF患者以及窦律患者心房肌组织标本的研究明确Calpain-1、ERS-自噬相关基因在AF发生中作用以及与AF发生的相关关系。二、研究方法选取2015年1月至2016年12月在海军军医大学附属长征医院心脏外科住院的合并AF并因二尖瓣病变拟行二尖瓣置换或成形手术的手术患者,获得心房肌组织标本,采用HE、MASSON染色、蛋白免疫印迹以及QT-PCR等方法,检测Calpain-1蛋白与mRNA表达以及酶活性的变化,并对ERS以及自噬相关蛋白与mRNA进行检测,明确在AF发生中作用与关系。三、结果1、两组患者在性别、年龄以及其他实验室方面无明显差异,在主动脉阻断时间、体外循环时间等手术相关资料方面亦无明显差异;2、AF患者心房肌组织中细胞数目较SR组明显减少,排列稍紊乱,结缔组织增生明显,偶可见肌细胞溶解;3、相比于SR组心房肌细胞,AF组心房肌细胞Calpain-1的蛋白以及酶活性表达相对值明显升高;4、AF组心房肌细胞ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP的表达量与mRNA相比于SR组显著升高;5、AF组患者心房肌细胞自噬相关特异性蛋白LC3B-II与Beclin-1含量均较SR组心房肌细胞明显增高。四、结论1、AF患者心房肌细胞中Calpain-1的蛋白表达明显增高,且Calpain-1酶活性亦显著高于SR患者;2、AF的患者心房肌细胞中ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP的表达以及mRNA含量明显高于SR患者心房肌细胞;3、AF的患者心房肌细胞中自噬相关蛋白LC3B-II以及Beclin-I的表达以及mRNA含量明显高于SR患者心房肌细胞。第二部分Calpain-1对ERS-自噬相关基因表达影响的实验研究一、研究目的明确Calpain-1在AF动物模型心房组织中mRNA及蛋白表达变化的规律以及Calpain-1在AF动物模型中对ERS-自噬反应关键蛋白的影响变化。二、研究方法采用遥测心电快速起搏方法建立的新西兰大白兔AF模型,并通过Calpain-1特异性抑制剂进行干预实验,将实验动物分成Sham组,AF组以及AF+MD28170三组。在实验处理后去兔心房肌细胞进行实验室检测。采用HE、MASSON染色、蛋白免疫印迹、QT-PCR、电子透射电镜以及免疫荧光共聚焦等方法,对各
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