检索结果-内蒙古大学图书馆

世界华人消化杂志 2004年第4期12卷 836-839页

作者：刘敏成军张树林王琳邵清张健梁耀东西安交通大学第一医院传染科陕西省西安市710061 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187... 详细信息

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X- α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin (MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15; 1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因. 结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.

关键词：酵母双杂交技术白细胞 cDNA NS5ATPl 结合蛋白基因菌落 HCV 基因表达

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乙型肝炎病毒全S蛋白反式激活蛋白1基因的克隆化

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世界华人消化杂志 2004年第11期12卷 2581-2584页

作者：白桂芹成军刘妍吴顺华蔺淑梅黄燕萍张树林中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039 西安交通大学第一医院传染科陕西省西安市710061

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin formatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)全S反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制. 方法:以HBV全S蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-全S转染HepG2细胞,以空载体pcDN... 详细信息

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin formatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)全S反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制. 方法:以HBV全S蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-全S转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,与对照组cDNA进行二次杂交和二次PCR.并结合生物信息学技术,克隆HBV 全S反式激活作用的新型靶基因. 结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.成功克隆出他的全长序列并测序证实,其可以被全S蛋白反式激活,故命名为全S反式激活蛋白1 (CSTP1),已在GenBank中注册,注册号:***1 基因的编码序列全长为945个核苷酸(nt),编码产物由315 个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HBV全S蛋白具有反式激活蛋白1基因克隆成功. HBV全S反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV全S的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

关键词：乙型肝炎病毒全S蛋白反式激活蛋N1基因克隆

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应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因

引用

世界华人消化杂志 2004年第4期12卷 790-793页

作者：刘敏王琳成军张树林邵清张健杨倩董菁中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039 西安交通大学第一医院传染科陕西省西安市710061

目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白结合蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV基因组中的前-X 基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了... 详细信息

目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白结合蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV基因组中的前-X 基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5 α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出HBV的前-X基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,配合后选出在四重缺陷(SD/-Trp-Leu- Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落19个,其中5 个是人铁蛋白;1个是人的胰岛素样生长因子结合蛋白3 (IGFBP3);1个是人醛缩酶B;1个是人糖基化磷脂酰肌醇锚定结合因子1(GPAA1);1个是人血红素结合蛋白;1个是人Cl酯酶抑制子(Cl-INH);1个是人玻连蛋白;1个是人电压依赖性阴离子通道1(VDAC1);1个是丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin);1个是人梭素;1个是人纤溶酶原(PLG);3个是人假想蛋白;1个是RP11-542M13克隆,位于染色体16. 结论:成功克隆出前-X的结合蛋白,为进一步研究HBV 的前-X蛋白的作用提供了新线索.

关键词：酵母双杂交技术肝细胞 cDNA 乙型肝炎病毒 HBV X蛋白结合蛋白基因 PCR 编码基因

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噬菌体展示技术筛选HBV前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因

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世界华人消化杂志 2004年第12期12卷 2801-2804页

作者：黄燕萍成军张树林杨艳杰高学松钟彦伟杨瑗白桂芹蔺淑梅中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039 西安交通大学第一医院传染科陕西省西安市710061

目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白. 方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的... 详细信息

目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白. 方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,并对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析. 结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的43个克隆中得到20 个与HBV前-前-S抗原基因启动子特异结合的阳性克隆, 包括人类SMG-1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶、28 S核糖体、单倍型As2A线粒体、组氨酰-tRNA合成酶、脂肪醛脱氢酶、桥粒相关蛋白、MAX相互作用蛋白1等17个已知功能基因及3个未知功能基因. 结论:用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到HBV前-前- S抗原基因启动子的结合蛋白基因,为进一步研究HBV发病机制创造了新的途径.

关键词：噬菌体展示技术筛选 HBV 前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因乙型肝炎病毒

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应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因

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世界华人消化杂志 2004年第4期12卷 828-831页

作者：李强梁耀东成军王琳张建邵清刘敏程明亮中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039 贵阳医学院第一附属医院感染科贵州省贵阳市550004

目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术, 筛选并克隆人白细胞中与NS5A... 详细信息

目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术, 筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有C-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1 个,RNA多聚酶Ⅲ3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1 个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个. 结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.

关键词：酵母双杂交技术白细胞 NS5ATP9蛋白抑制性消减杂交技术 SSH 编码基因酵母细胞

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应用抑制性消减杂交技术克隆HCV NS3蛋白反式激活基因2的上调基因

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世界华人消化杂志 2004年第4期12卷 847-850页

作者：党晓燕成军邓红王建军杨倩刘妍纪冬王春花陕西西安交通大学第二医院感染科陕西省西安市710004 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消文库,克隆HCV NS3蛋白反式激活相关基因. 方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染... 详细信息

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消文库,克隆HCV NS3蛋白反式激活相关基因. 方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人HCV NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到61个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取30 个插入片段测序分析,得到30个已知功能基因序列. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS3TP2可能存在的调控机制的线索.

关键词：抑制性消减杂交技术克隆 HCV NS3蛋白反式激活基因2 上调基因细胞凋亡

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应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP2(615)反式激活基因

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世界华人消化杂志 2005年第1期13卷 82-85页

作者：杨倩成军刘妍洪源王琳董菁张树林中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039 西安交通大学第一医院传染科陕西省西安市710061

目的:应用抑制性消减杂交技术构建人类新基因NS5ATP2 (615)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5KTP2反式激活相关基因,了解该基因的可能生物学功能. 方法:构建NS5ATP2表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ATP2-TP2 转染HepG2细胞,以空载体pcD... 详细信息

目的:应用抑制性消减杂交技术构建人类新基因NS5ATP2 (615)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5KTP2反式激活相关基因,了解该基因的可能生物学功能. 方法:构建NS5ATP2表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ATP2-TP2 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2 细胞为对照:提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA. 半定量RT-PCR显示实验组NS5ATP2的转录水平明显高于对照组.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pEGM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人类新基因NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到76个白色克隆,进行茵落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的32个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知功能基因序列,和2个未知功能基因. 结论:应用SSH技术成功构建了NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明NS5ATP2 生物学功能提供理论依据.

关键词： NS5A 反式激活基因 ATP cDNA消减文库抑制性消减杂交技术转染对照组克隆新基因菌落PCR

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乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义

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世界华人消化杂志 2004年第4期12卷 757-762页

作者：董菁成军杨倩中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝部分双链DNA病毒,基因组长度只有3.2 kb,结构基因与调节基因序列之间重叠, 甚至结构基因序列之间重叠,因此HBV DNA序列的利用率之高实属罕见.1979年首次报告HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架... 详细信息

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝部分双链DNA病毒,基因组长度只有3.2 kb,结构基因与调节基因序列之间重叠, 甚至结构基因序列之间重叠,因此HBV DNA序列的利用率之高实属罕见.1979年首次报告HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架(ORF)之后,一直沿用至今. 我们在中国流行株HBV基因序列的分析中,在前-Sl和X 基因之前,分别发现了2段编码基因序列:前-前-S基因长度135 bp,编码产物为45 aa;前-X基因长度168 bp, 编码产物为56 aa.在前-前-S基因、前-X基因的上游存在启动子序列,具有指导报告基因表达的活性.对15例慢性乙型肝炎(CHB)患者基因型C型9例、B型1例、B/C混合型5例,共31个克隆测序结果,发现均存在前-前-S基因区.17例CHB患者A型1例、B型3例、C型10例、B/ C混合型3例,共测序45个克隆,C型编码前-X区的克隆数占总编码克隆数的60%,C型不能编码前-X区的原因主要是A2608→C/T替换突变或C/A2733→T替换突变单一突变;而B型、B/C型都不能编码前-X区蛋白,主要因为双突变的存在.在HBV基因组中发现前-前-S和前-X基因序列的存在改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史.

关键词：乙型肝炎病毒 HBV 读码框架 DNA病毒基因序列

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乙型肝炎病毒DNA整合的机制及后果

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世界华人消化杂志 2004年第2期12卷 420-427页

作者：成军中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039

乙型肝炎病毒(HBV)的感染,与肝细胞癌(HCC)的发生发展密切相关.关于HBVDNA与肝细胞基因组DNA之间的整合,在HCC的发病过程中具有十分重要的意义.经过30a的积累,形成了一整套研究HBVDNA整合有效的研究技术.参与整合的HBVDNA片段大小不等,... 详细信息

乙型肝炎病毒(HBV)的感染,与肝细胞癌(HCC)的发生发展密切相关.关于HBVDNA与肝细胞基因组DNA之间的整合,在HCC的发病过程中具有十分重要的意义.经过30a的积累,形成了一整套研究HBVDNA整合有效的研究技术.参与整合的HBVDNA片段大小不等,主要包括乙型肝炎病毒编码反式调节蛋白的基因区段,如X基因和羧基末端截短的表面抗原中蛋白的编码基因等.关于HBVDNA整合位点也没有明确的特异性位点.HBVDNA与肝细胞基因组DNA整合之后,引起了肝细胞染色体的不稳定性,甚至导致染色体的异常转位.整合的HBVDNA可通过调节基因序列启动指导细胞恶性转化的相关基因,同时HBVDNA整合的基因片段编码的反式激活蛋白可激活细胞生长及恶性转化的基因,导致正常肝细胞的恶性转化.与HBVDNA基因整合相关蛋白的研究还处于初级阶段,包括15AB结合蛋白、小鼠上游结合因子结合蛋白、DNA结合蛋白A、整合序列结合蛋白3以及转录因子阴和阳1蛋白有关.关于HBVDNA整合机制和后果的研究,必将进一步阐明HCC发生的分子生物学机制,为探索新型的治疗技术和治疗方法奠定基础.

关键词：乙型肝炎病毒 DNA HBV 肝细胞癌 HCC 分子生物学

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应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

引用

中西医结合肝病杂志 2003年第6期13卷 337-339页

作者：洪源成军中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039

目的:寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白,进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用,阐明其分子作用机制。方法:应用酵母单杂交体系,以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”,对酵... 详细信息

目的:寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白,进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用,阐明其分子作用机制。方法:应用酵母单杂交体系,以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”,对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选,应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果:共获得了12个双阳性克隆,编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白,其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论:这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合,可能是作用于SPⅠ的反式作用因子,但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用,笔者正进行进一步的研究。

关键词：酵母单杂交技术乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ 结合蛋白病毒复制

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