检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2021年第8期37卷 2786-2793页

作者：马萌郑孟加李晓齐高丽曹红王永强郑世军中国农业大学动物医学院农业动物流行病学重点实验室北京100193

为获得鸡源CD40L(chCD40L)蛋白,以鸡脾细胞制备cDNA并以之为模板扩增chCD40L基因,构建pFastBac-chCD40L供体重组质粒,转化感受态细胞DH10Bac,通过筛选及鉴定获得Bacmid-chCD40L重组质粒,转入真核表达系统sf9昆虫细胞进行蛋白表达与纯化... 详细信息

为获得鸡源CD40L(chCD40L)蛋白,以鸡脾细胞制备cDNA并以之为模板扩增chCD40L基因,构建pFastBac-chCD40L供体重组质粒,转化感受态细胞DH10Bac,通过筛选及鉴定获得Bacmid-chCD40L重组质粒,转入真核表达系统sf9昆虫细胞进行蛋白表达与纯化,获得His-chCD40L蛋白。此外,构建pQM01-chCD40L质粒,转染HEK293T细胞进行蛋白表达与纯化,获得Strep-chCD40L蛋白。亲和层析纯化的chCD40L蛋白浓度为0.01 mg/mL。为检测chCD40L蛋白的生物活性,分离和培养3周龄SPF雏鸡的法氏囊组织原代细胞,将chCD40L加入细胞培养液刺激细胞增殖,通过Western blotting试验、间接免疫荧光试验、流式细胞术检测,发现该蛋白能够与法氏囊B淋巴细胞表面的CD40结合,说明chCD40L具有生物活性。成功获得chCD40L蛋白,为原代B淋巴细胞体外培养及IBDV野毒分离与诊断奠定了基础。

关键词：鸡 CD40L 法氏囊原代细胞培养真核表达生物活性检测杆状病毒表达系统

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鸡Foxp3结构预测及组织表达谱分析

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生物工程学报 2022年第8期38卷 2928-2938页

作者：常贺高辉王永强高丽曹红李晓齐郑世军中国农业大学动物医学院农业动物流行病学重点实验室北京100193

本研究旨在克隆鸡foxp3(chfoxp3)基因全长编码区序列(coding sequence,CDS),并对其进行生物信息学及组织表达谱分析。以50日龄无特定病原鸡为样本,从脾脏组织中克隆chfoxp3基因全长CDS序列,利用在线工具和软件对chFoxp3进行生物信息学分... 详细信息

本研究旨在克隆鸡foxp3(chfoxp3)基因全长编码区序列(coding sequence,CDS),并对其进行生物信息学及组织表达谱分析。以50日龄无特定病原鸡为样本,从脾脏组织中克隆chfoxp3基因全长CDS序列,利用在线工具和软件对chFoxp3进行生物信息学分析,以实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测chfoxp3基因在鸡各组织中的表达分布情况。研究结果表明,chfoxp3基因包含882 bp的开放阅读框,编码293个氨基酸,chFoxp3分子质量为33.44 kDa,属于亲水蛋白;chFoxp3具有Fox转录因子家族典型的forkhead结构域,含有核定位信号;其二级结构由α-螺旋(29.35%)、延伸链(10.92%)、β-转角(5.12%)和无规则卷曲(54.61%)组成;chfoxp3在不同组织中表达有差异,在鸡心脏及胰腺中表达水平较高,显著高于脾脏、法氏囊以及胸腺等免疫器官(P<0.01),这一特点明显区别于哺乳动物;通过系统进化树分析发现,鸡Foxp3与其他野禽属于相同分支,但与哺乳动物相差较远。这些研究结果为进一步深入研究chFoxp3的免疫调节功能奠定了基础。

关键词：鸡 Foxp3 克隆表达分析

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PIAS1对PRRSV N蛋白SUMO化修饰及病毒复制的影响

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微生物学通报 2017年第12期44卷 2878-2887页

作者：王聪曾南方刘飔雨苗琦周磊盖新娜杨汉春郭鑫中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学重点实验室北京100193

【目的】猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种危害全球养猪业的重要病原。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)化修饰作为一种可逆的翻译后修饰在调节病毒复制方面发挥着重要功能。PIAS1(Protein inhibitor of activated STAT1)是SUMO... 详细信息

【目的】猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种危害全球养猪业的重要病原。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)化修饰作为一种可逆的翻译后修饰在调节病毒复制方面发挥着重要功能。PIAS1(Protein inhibitor of activated STAT1)是SUMO E3连接酶PIAS家族的一员,可以促进靶蛋白的SUMO化修饰,进而影响靶蛋白的功能,参与基因转录调控过程。探究PIAS1与PRRSV N蛋白相互作用的机制及其对N蛋白SUMO化修饰和病毒复制的影响,为进一步阐明PRRSV复制调控和致病的分子机制提供科学依据。【方法】利用酵母回复杂交、免疫共沉淀和激光共聚焦技术验证N蛋白与PIAS1的相互作用;以递增剂量外源性转染PIAS1观察其是否介导N蛋白SUMO化修饰;采用RNA干扰和慢病毒转导技术测定PIAS1对PRRSV复制的影响。【结果】PIAS1能与N蛋白相互作用,而且两者主要共定位于胞浆中;外源转染PIAS1并未增加N蛋白SUMO化修饰水平;在MARC-145细胞中,PIAS1的表达有利于PRRSV的复制。【结论】PIAS1可促进PRRSV的复制。

关键词： PRRSV N蛋白 PIAS1 相互作用 SUMO化修饰复制

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猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30株CHsx1401感染性克隆的构建

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畜牧兽医学报 2018年第3期49卷 637-643页

作者：卞婷周磊宋江伟盖新娜郭鑫韩军杨汉春中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学重点实验室北京100193

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响全球养猪业的一种重要病原。近年来,国内新出现的类NADC30毒株导致临床PRRS疫情再次出现。本研究旨在构建PRRSV类NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆,以期为研究该类毒株遗传变异与演化以及与其他毒株... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响全球养猪业的一种重要病原。近年来,国内新出现的类NADC30毒株导致临床PRRS疫情再次出现。本研究旨在构建PRRSV类NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆,以期为研究该类毒株遗传变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制奠定基础。将类NADC30毒株CHsx1401全长基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,分别将扩增片段克隆到pJET1.2载体构建中间质粒,将4个克隆依次连接并克隆到改造后的低拷贝质粒载体pWSK29中,构建全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,并在全长cDNA克隆的C与D片段之间通过同义突变(T11582G)引入AscⅠ酶切位点,作为遗传标记,用于区分拯救病毒与亲本病毒。采用脂质体LTX将全长cDNA克隆质粒转染至MARC-145细胞拯救病毒。结果表明,成功构建出全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,转染MARC-145细胞后传至第二代可观察到明显的细胞病变(CPE)。经间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定鉴定结果表明,从全长cDNA克隆可拯救出病毒。拯救病毒(RvCHsx1401)在MARC-145细胞上可稳定传代,增殖动态与亲本病毒相似,在MARC-145细胞上各时相的病毒滴度略低于亲本病毒。本研究构建的类NADC30毒株CHsx1401的全长cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;拯救病毒与亲本病毒的体外增殖特性相似,为研究该毒株的变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制提供了技术平台。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30 全长cDNA克隆感染性拯救

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与PRRSV nsp11互作的宿主细胞蛋白鉴定及生物信息学分析

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微生物学通报 2017年第12期44卷 2856-2870页

作者：靳换李逸姜楠周磊盖新娜杨汉春郭鑫中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学重点实验室北京100193

【目的】研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp11与宿主细胞蛋白之间的相互作用,对于揭示nsp11在病毒复制过程中发挥的功能至关重要。【方法】在病毒感染细胞的基础上,利用nsp11... 详细信息

【目的】研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp11与宿主细胞蛋白之间的相互作用,对于揭示nsp11在病毒复制过程中发挥的功能至关重要。【方法】在病毒感染细胞的基础上,利用nsp11的单克隆抗体,采用免疫沉淀结合串联质谱的方法,筛选与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,并对所筛选出的宿主细胞蛋白进行了GO注释、COG注释和KEGG代谢通路注释;选取筛选出的宿主细胞蛋白IRAK1,利用免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术鉴定其与nsp11之间的相互作用。【结果】与空白对照组相比,病毒感染组中出现3条差异带;经质谱分析共筛选得到了201个与nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,分别与蛋白质代谢、细胞信号通路转导以及病原致病性等密切相关;在生物信息学分析的基础上,实验验证了nsp11确与宿主细胞蛋白IRAK1进行相互作用。【结论】鉴定出与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,生物信息学分析显示它们在病毒的复制和致病过程中发挥重要作用。研究结果为探究nsp11的生物学功能指明了方向,也为研究宿主细胞蛋白与病毒蛋白间的相互作用及其调控病毒复制和致病性的分子机制奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白11 宿主细胞蛋白相互作用生物信息学分析

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巨型住肉孢子虫烯醇酶基因克隆与表达

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畜牧兽医学报 2019年第3期50卷 670-676页

作者：王先梅吴甲佳李祎刘群刘晶中国农业大学动物医学院国家动物寄生原虫实验室北京100193 中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学重点实验室北京100193

巨型住肉孢子虫(Sarcocystis gigantea)是羊体内一种常见寄生虫,多寄生于羊横纹肌内形成包囊,导致羊肉大量废弃,给畜牧业带来巨大经济损失。本研究尝试筛选能有效诊断住肉孢子虫感染的抗原。通过免疫印迹及质谱分析筛选到巨型住肉孢子... 详细信息

巨型住肉孢子虫(Sarcocystis gigantea)是羊体内一种常见寄生虫,多寄生于羊横纹肌内形成包囊,导致羊肉大量废弃,给畜牧业带来巨大经济损失。本研究尝试筛选能有效诊断住肉孢子虫感染的抗原。通过免疫印迹及质谱分析筛选到巨型住肉孢子虫候选诊断抗原烯醇酶,利用染色体步移技术扩增两侧翼未知序列并表达重组蛋白。应用生物信息学分析和免疫印迹对该蛋白诊断价值进行评价。结果筛选到的候选蛋白为巨型住肉孢子虫烯醇酶(SgENO),克隆得到1 181 bp的基因并获得重组蛋白rSgENO。对rSgENO应用进行初步评价,发现其与其他顶复亚门原虫的烯醇酶氨基酸相似性均较高(71%～92.1%),且能被弓形虫和新孢子虫阳性血清所识别,具有交叉反应性。本研究克隆并表达了巨型住肉孢子虫烯醇酶,后期评价发现该重组蛋白与新孢子虫和弓形虫有较强的交叉反应性,不能用于羊住肉孢子虫的血清学诊断,但有成为疫苗候选分子的潜力。

关键词：住肉孢子虫烯醇酶重组蛋白交叉反应

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SLA-Ⅰα链和β链的原核表达与抗血清制备

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畜牧兽医学报 2015年第7期46卷 1224-1231页

作者：刘莹杜吉革盖新娜周磊郭鑫杨汉春中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学与人兽共患病重点实验室北京100193

猪主要组织相容性复合体Ⅰ类分子又称猪白细胞抗原Ⅰ类分子(SLA-Ⅰ),参与内源性抗原在体内的递呈过程,其结构包括重链(α链)和轻链(β链)两部分。本研究首先采用RT-PCR从原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增出SLA-Ⅰα链胞外区基因和β链基因... 详细信息

猪主要组织相容性复合体Ⅰ类分子又称猪白细胞抗原Ⅰ类分子(SLA-Ⅰ),参与内源性抗原在体内的递呈过程,其结构包括重链(α链)和轻链(β链)两部分。本研究首先采用RT-PCR从原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增出SLA-Ⅰα链胞外区基因和β链基因;继而利用原核表达系统获得包涵体形式表达的SLA-Ⅰα链胞外区和β链重组蛋白质;将目的重组蛋白质洗涤、复性、纯化后,经Western blot及质谱技术进行验证。以纯化的重组蛋白质免疫兔制备抗血清,经间接ELISA检测其效价达1∶256 000。以制备的抗血清进行Western blot和间接免疫荧光试验,结果显示,所制备的抗血清能够特异性地识别原代及传代PAM表达的SLA-Ⅰα链及β链蛋白。研究结果不仅为SLA-Ⅰ类分子的功能研究提供了有用的分析试剂,也为病毒感染的免疫机制研究奠定了必要的基础。

关键词： SLA-Ⅰα链 SLA-Ⅰβ链原核表达抗血清

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一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株的基因组特征

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畜牧兽医学报 2012年第2期43卷 263-269页

作者：杨小蓉荫硕焱潘梦周磊盖新娜陈艳红郭鑫杨汉春中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学与人兽共患病重点实验室北京100193

为了监测我国近年来流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR分段扩增,对2009年从山东发病猪场分离到的1株PRRSV SD0901的全基因组进行了序列测定和分析。结果表明,不包括Poly(A)尾,该毒株的基因组全长为15 3... 详细信息

为了监测我国近年来流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR分段扩增,对2009年从山东发病猪场分离到的1株PRRSV SD0901的全基因组进行了序列测定和分析。结果表明,不包括Poly(A)尾,该毒株的基因组全长为15 320nt;与高致病性PRRSV毒株间的全基因组核苷酸相似性为98.6%～98.7%;该毒株基因组的Nsp2编码区除存在与高致病性毒株相同的30个氨基酸的不连续缺失外,还存在468位的氨基酸缺失和在585—586位间插入1个氨基酸,同时,该毒株的结构蛋白GP2、GP3、GP4和M编码区分别存在1个氨基酸的突变。演化分析表明,该毒株尽管与高致病性毒株属于同一亚群,但形成一个独立的小分支。由此表明,该毒株为高致病性PRRSV的变异毒株,说明我国的高致病性PRRSV在流行过程中已出现变异。笔者的研究结果为监测和分析我国的高致病性PRRSV的变异与演化提供了有价值的基因组信息数据。

关键词：高致病性繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列测定变异分析

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三株弓形虫对昆明鼠致病性的比较研究

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畜牧兽医学报 2017年第10期48卷 1976-1982页

作者：李祎李星周冰洁李木子马磊刘群刘晶中国农业大学动物医学院北京100193 国家动物寄生原虫实验室农业部动物流行病学重点实验室北京100193

刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,弓形虫属仅有刚地弓形虫一种,但世界各地的分离株有着丰富的遗传多样性。作者以Ⅱ型(Pru、BJ)和Ⅲ型(VEG)虫株为研究对象,通过腹腔接种昆明小鼠,观察小鼠的临床表现,检测血清抗体水平、弓形虫在组... 详细信息

刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,弓形虫属仅有刚地弓形虫一种,但世界各地的分离株有着丰富的遗传多样性。作者以Ⅱ型(Pru、BJ)和Ⅲ型(VEG)虫株为研究对象,通过腹腔接种昆明小鼠,观察小鼠的临床表现,检测血清抗体水平、弓形虫在组织器官的动态分布及脑荷虫量等指标,比较不同虫株对小鼠致病性的差异。结果显示:Ⅱ型虫株接种小鼠表现出更明显的临床症状。监测小鼠血清抗体变化发现,Ⅱ型虫株感染小鼠在第4天即检测到弓形虫特异性抗体,随后抗体水平至第64天持续上升,感染Ⅲ型虫株小鼠血清在感染后第32天达到峰值并维持在较高水平。并且,三种虫株在小鼠组织器官的动态分布趋势大体相同,感染早期(第1天)侵染肺、肾、肌肉,中期(第8天)多分布在心、肺、肌肉、脑中,后期(第32天)存在于脑中,脾、肾、肝中不易检测到虫体。成功建立了三种弓形虫虫株感染昆明小鼠模型,证明Ⅱ型和Ⅲ型虫株对昆明鼠致病力的具体差异,并发现不同基因型弓形虫速殖子感染小鼠后在小鼠体内的分布随时间呈现一定的规律性,为弓形虫致病力的研究和动物模型的建立提供参考。

关键词：弓形虫致病力组织分布脑荷虫量

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弓形虫和新孢子虫交叉反应抗原MIC7A对小鼠的免疫保护效力分析

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畜牧兽医学报 2022年第7期53卷 2300-2306页

作者：陈慧娴陈雅婕王先梅王丽芳刘群刘晶中国农业大学动物医学院国家动物寄生原虫实验室北京100193 中国农业大学动物医学院农业农村部动物流行病学重点实验室北京100193

弓形虫和新孢子虫是两种亲缘关系接近的顶复亚门原虫,二者之间存在一定程度的交叉免疫保护作用,这种作用可能是基于交叉反应抗原产生的。本研究旨在表达并鉴定弓形虫和新孢子虫的交叉反应抗原TgMIC17A,通过将其应用于小鼠的免疫保护试验... 详细信息

弓形虫和新孢子虫是两种亲缘关系接近的顶复亚门原虫,二者之间存在一定程度的交叉免疫保护作用,这种作用可能是基于交叉反应抗原产生的。本研究旨在表达并鉴定弓形虫和新孢子虫的交叉反应抗原TgMIC17A,通过将其应用于小鼠的免疫保护试验,评估该抗原对弓形虫和新孢子虫感染产生的交叉免疫保护作用。对TgMIC17A进行基因克隆和原核表达,通过免疫印迹试验鉴定其反应原性和交叉反应性。重组蛋白免疫小鼠后测定血清特异性IgG抗体水平,评价其免疫原性。二免后,分别用1×10^(3)个弓形虫Pru速殖子、1.5×10^(7)个新孢子虫Nc1速殖子攻虫,对小鼠的体重变化、存活率进行监测,并在攻虫30 d后检测各组存活小鼠的脑荷虫量,评价TgMIC17A重组蛋白免疫小鼠后对弓形虫和新孢子虫的交叉免疫保护效果。结果显示,rTgMIC17A可以被弓形虫和新孢子虫的阳性血清识别,相较于未免疫组小鼠,免疫组小鼠体内可产生高水平特异性IgG抗体(P<0.01),且感染弓形虫或新孢子虫的脑荷虫量均显著降低(P<0.01)。本研究克隆并表达了TgMIC17A,鉴定其为新孢子虫和弓形虫的交叉反应抗原。该抗原可以刺激小鼠产生较好的体液免疫反应,并对弓形虫和新孢子虫的感染产生一定的交叉免疫保护作用,可以为弓形虫和新孢子虫共感染的防治,以及筛选具有交叉免疫保护力的重组疫苗提供可借鉴的研究资料。

关键词： MIC17A 弓形虫新孢子虫交叉反应抗原交叉免疫保护

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