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作者：罗金刘光远谢俊仁田占成袁晓松王芳芳郭锦霞王素艳中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室兰州730046

本研究对获得的高质量微小扇头蜱卵、幼蜱以及成蜱RNA模板分别构建microRNA文库.高通量测序技术检测其序列,并利用生物信息学方法鉴定微小扇头蜱各个发育阶段microRNA的表达丰度及样品间的差异表达分子.结果显示,分别从卵、幼蜱及成蜱... 详细信息

本研究对获得的高质量微小扇头蜱卵、幼蜱以及成蜱RNA模板分别构建microRNA文库.高通量测序技术检测其序列,并利用生物信息学方法鉴定微小扇头蜱各个发育阶段microRNA的表达丰度及样品间的差异表达分子.结果显示,分别从卵、幼蜱及成蜱中获得18,162,337、8,090,736及ll,807,326条cleanreads.其中5,132条miRNA序列高度保守,并且预测得到了47条候选新miRNA.相比之下,在P-value＜0.01的条件下筛选得到成蜱中存在l,203条差异表达的miRNA序列,其中728条表达上调,475条表达下调.为了验证测序数据的可靠性,应用qRT-PCR对候选的新miRNA序列进行验证.另一方面,将预测到的40,613已注释的miRNA转录本作为候选靶标基因,GO注释和KEGG通路分析显示,差异表达的microRNA主要参与宿主的生理发育过程,包括信号转导、细胞间及细胞外的通信等.本研究为全面了解微小扇头蜱miRNAs特征及潜在靶标提供了数据平台,为了解动物寄生虫复杂的生物学特征及miRNA在微小扇头蜱发育中的功能提供了依据,对研究相关蜱种在人和动物健康方面有着重要的意义.

关键词：兽医学微小扇头蜱高通量测序分子生物学动态监测

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长角血蜱卵中miR:275荧光定量PCR标准曲线的建立

长角血蜱卵中miR:275荧光定量PCR标准曲线的建立

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第七次代表大会暨第十二次学术研讨会

作者：王芳芳刘光远罗金袁小松田占成谢俊仁王素艳郭锦霞中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫原病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

为了研究miR-275在长角血蜱卵不同发育时期的表达变化情况,采用实时相对荧光定量PCR,构建miR-275、内参基因的标准质粒和标准曲线.根据成熟体序列信息,设计特异性茎环引物及PCR扩增引物,通过qRT-PCR检测miR-275在长角血蜱卵中的表达量.... 详细信息

为了研究miR-275在长角血蜱卵不同发育时期的表达变化情况,采用实时相对荧光定量PCR,构建miR-275、内参基因的标准质粒和标准曲线.根据成熟体序列信息,设计特异性茎环引物及PCR扩增引物,通过qRT-PCR检测miR-275在长角血蜱卵中的表达量.将克隆出的约70bp左右的miR-275片段插入到pGEM-T Easy载体中,成功构建了原核表达载体,转化***,对鉴定的阳性克隆进行序列测定,并用标准化的阳性质粒进行绝对荧光定量PCR标准曲线的制备.结果显示,本实验建立的miR-275和β-actin标准曲线斜率分别为M=-2.982,M=-3.038,回归系数分别为R2=0.999,R2=0.997,说明线性关系良好、产物溶解曲线峰值单一、无引物二聚体及引物特异性高;重复性实验结果显示所构建的重组质粒Ct值具有较好的重现性,且变异率均小于5％,表明标准曲线重复性好、稳定性高.本研究建立的方法简单、准确、敏感、特异性强,成功构建的miRNA标准曲线为后续miR-275在卵中功能的研究奠定了良好基础.

关键词：兽医学长角血蜱荧光定量PCR 标准曲线基因序列

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Hlo:miR:275在长角血蜱卵中的表达动态变化

Hlo:miR:275在长角血蜱卵中的表达动态变化

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第七次代表大会暨第十二次学术研讨会

基于microRNA的重要性及其在寄生虫和寄生虫病防控方面的潜在应用价值,本研究就hlo-miR-275在长角血蜱卵不同发育时期的表达变化情况进行了分析.根据数据库中hlo-miR-275的成熟体序列信息,设计特异性茎环引物及PCR扩增引物,同时根据Gene... 详细信息

基于microRNA的重要性及其在寄生虫和寄生虫病防控方面的潜在应用价值,本研究就hlo-miR-275在长角血蜱卵不同发育时期的表达变化情况进行了分析.根据数据库中hlo-miR-275的成熟体序列信息,设计特异性茎环引物及PCR扩增引物,同时根据GeneBank中长角血蜱β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物进行扩增.将克隆出的约70bp左右的hlo-miR-275、β-actin片段插入到pGEM-T Easy载体中,成功构建了原核表达载体,转化***,对鉴定的阳性克隆进行序列测定,并用标准化的阳性质粒进行绝对荧光定量PCR标准曲线的建立;计算hlo-miR-275标准拷贝数,通过SPSS软件分析其在长角血蜱卵不同发育时期的表达显著性差异.本实验建立的miR-275和β-actin标准曲线斜率分别为M=-2.982,M=-3.038,回归系数分别为R2=0.999,R2=0.997,说明线性关系良好;产物溶解曲线峰值单一,说明无引物二聚体及引物特异性高;重复性实验结果显示所构建的重组质粒Ct值具有较好的重现性,且变异率均小于5％,说明标准曲线重复性好,稳定性高.本研究建立了hlo-miR-275、β-actin的标准曲线,为研究hlo-miR-275在长角血蜱中的生物学意义奠定了基础,也为研究miR-275在其它近源物种中的作用提供了有价值的参考.

关键词：兽医学长角血蜱荧光定量PCR 标准曲线动态变化

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Bantam在长角血蜱不同变态发育时期表达谱及代谢通路分析

Bantam在长角血蜱不同变态发育时期表达谱及代谢通路分析

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第七次代表大会暨第十二次学术研讨会

作者：罗金刘光远谢俊仁田占成袁晓松王芳芳郭锦霞王素艳中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫原病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

本研究参考miRBase数据库中Bantam序列,设计特异性引物,RT-PCR方法获得Bantam序列并进行生物信息学分析.利用qRT-PCR分析长角血蜱不同变态发育过程中Bantam的表达谱特征.预测其靶标基因,Cytoscape_v2.8软件模拟B antam与潜在靶标基因在... 详细信息

本研究参考miRBase数据库中Bantam序列,设计特异性引物,RT-PCR方法获得Bantam序列并进行生物信息学分析.利用qRT-PCR分析长角血蜱不同变态发育过程中Bantam的表达谱特征.预测其靶标基因,Cytoscape_v2.8软件模拟B antam与潜在靶标基因在代谢通路中的相互作用.Bantam序列高度保守,长角血蜱与果蝇有较近的亲缘关系.其表达丰度在卵中最高,幼蜱阶段次之,而在成蜱阶段最低.比较而言,卵中的表达丰度和蜱发育的其他阶段表达丰度差异显著(P＜0.05),幼蜱,若蜱以及成蜱之间仅有较小差异.代谢通路结果显示,Bantam可对多个靶基因进行转录后调控.同时一个靶基因也可能受到多个miRNA分子的调控.不同物种来源的Bantam序列高度保守,并在蜱不同变态发育时期具有一定的时序性.参与多个基因的表达调控过程,亦协同其他miRNA分子对靶基因功能的发挥起着重要的作用.

关键词：兽医学长角血蜱变态发育基因表达谱

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多房棘球蚴感染与宿主相互作用的免疫学机制研究进展

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2012年第5期30卷 401-405页

作者：娄忠子李宏民闫鸿斌倪兴维贾万忠中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室兰州730046

通过感染过程中宿主的固有免疫和获得性免疫的作用,多房棘球蚴可调节一系列虫体与宿主的相互作用效应,这些效应有助于虫体在宿主肝脏内的增殖和成熟,从而完成其生活史;对中间宿主来说,则可限制寄生所导致的病理变化的发展。本文主要针... 详细信息

通过感染过程中宿主的固有免疫和获得性免疫的作用,多房棘球蚴可调节一系列虫体与宿主的相互作用效应,这些效应有助于虫体在宿主肝脏内的增殖和成熟,从而完成其生活史;对中间宿主来说,则可限制寄生所导致的病理变化的发展。本文主要针对多房棘球蚴免疫相关分子在提高寄生虫生存能力等方面与宿主间的免疫应答研究进行综述。

关键词：多房棘球蚴免疫相关分子宿主-虫体相互作用

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基于环形泰勒虫Tams1基因多态性的二温式-PCR检测方法的建立

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中国农业科学 2012年第20期45卷 4300-4309页

作者：罗金刘光远田占成谢俊仁中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室/农业部草食动物疫病重点开放实验室

【目的】环形泰勒虫作为牛科动物重要的血液原虫对养牛业产生了重大危害。近年来针对该病原Tams1基因的诊断方法及候选疫苗筛选进行了大量工作。但研究证明该基因多态性对诊断及免疫效果存在影响。基于此,本研究对Tams1基因多态性特征... 详细信息

【目的】环形泰勒虫作为牛科动物重要的血液原虫对养牛业产生了重大危害。近年来针对该病原Tams1基因的诊断方法及候选疫苗筛选进行了大量工作。但研究证明该基因多态性对诊断及免疫效果存在影响。基于此,本研究对Tams1基因多态性特征进行了分析,并为该病的诊断建立一种实施有效的检测方法。【方法】参考GenBank中公布的环形泰勒虫Tams1基因的核苷酸序列,设计特异性引物。PCR扩增,获得了846 bp的核苷酸片段。将该基因片段与GenBank中主要的12种已知不同区域虫株的相应氨基酸序列进行比较分析。在保守区设计引物,以Tams1基因标准阳性质粒为模板建立环形泰勒虫病的二温式-PCR检测方法。经优化的方法用于田间样品的检测。【结果】该基因编码281个氨基酸,碱性氨基酸48个,酸性氨基酸42个,疏水性氨基酸100个。系统发生树结果显示,环形泰勒虫甘肃株与安哥拉、土耳其、巴林地方株亲缘关系较近。新疆株与意大利、西班牙地方株关系较近,而与甘肃株亲缘关系相对较远。这一结果通过环形泰勒虫不同国家地方株的氨基酸序列对齐结果可以得到进一步的说明。建立的二温式-PCR检测方法,可检测到0.31 fg.μL-1血液中感染虫体的量。特异性结果表明,仅有环形泰勒虫基因组DNA检测为阳性,其它对照虫种基因组模板均表现为阴性,且与感染牛的其它梨形虫无交叉反应。本实验建立的环形泰勒虫二温式-PCR方法对收集的335份野外样品进行检测,阳性检出率为16.33%,显微镜检测阳性率为2.25%,两者符合率100%。与普通PCR比较,二温式-PCR在敏感性方面没有显著差异,但其特异性更高,且该方法反复升温降温时间消耗短。【结论】环形泰勒虫Tams1基因不同地方株存在明显的差异。其氨基酸序列的多态性特征差异显著。因此该基因作为潜在候选抗原应注重多肽疫苗的设计。二温式-PCR方法具有的良好敏感性和特异性,对环形泰勒虫病的流行可以起到提前检测的效果,提高了疾病的诊断效率。

关键词：环形泰勒虫 Tams1 多态性二温式-PCR 检测方法

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长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

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中国兽医科学 2012年第6期42卷 551-556页

作者：罗金刘光远田占成谢俊仁沈辉田美媛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达... 详细信息

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。

关键词：长角血蜱 4D8基因克隆原核表达

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马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

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中国兽医科学 2012年第4期42卷 352-356页

作者：罗金刘光远田占成谢俊仁沈辉田美媛中国农业科学院、兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室、甘肃省动物寄生虫病重点实验室、农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达... 详细信息

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。

关键词：马泰勒虫 EMA1基因克隆系统发育

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18S rRNA序列差异在马梨形虫分类学中的应用

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中国兽医杂志 2012年第10期48卷 6-9页

为揭示18SrRNA V4高变区在物种分类学的本质意义,及进一步阐述马泰勒虫(之前称马巴贝斯虫)的分类学地位,本试验参考马泰勒虫(DQ287951)和驽巴贝斯虫(FJ209026)18SrRNA基因序列,在其V4高变区设计引物。将获得的片段克隆至pMD19-T进行测序... 详细信息

为揭示18SrRNA V4高变区在物种分类学的本质意义,及进一步阐述马泰勒虫(之前称马巴贝斯虫)的分类学地位,本试验参考马泰勒虫(DQ287951)和驽巴贝斯虫(FJ209026)18SrRNA基因序列,在其V4高变区设计引物。将获得的片段克隆至pMD19-T进行测序,正确的结果与其他种梨形虫的相应序列进行分析。系统发生树结果显示,泰勒虫和巴贝斯虫处于明显的两个分支,而称之为马巴贝斯虫的物种和泰勒虫有着较为密切的关系,他们处于同一分支,其亲缘关系较巴贝斯虫更远。序列对齐分析表明,巴贝斯虫核苷酸序列相对于泰勒虫种序列存在多个位点的缺失和突变。而马巴贝斯虫和泰勒虫18SrRNA V4高变区核苷酸序列的相似程度较高,与巴贝斯虫在该序列上的差异较大。以上结果表明,泰勒虫种和巴贝斯虫种18SrRNA V4高变区核苷酸序列间的这种缺失和突变可作为泰勒虫和巴贝斯虫分类依据的本质因素之一。马巴贝斯虫应隶属于泰勒虫科,泰勒虫属。

关键词：泰勒虫巴贝斯虫分类学 18S rRNA

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马泰勒虫病PCR检测方法的建立和应用

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中国畜牧兽医 2012年第2期39卷 28-31页

作者：罗金刘光远谢俊仁田占成党根生中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫原病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046 西安市长安区动物疾病预防控制中心陕西西安710100

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫(Theileria equi,***)PCR检测方法。基于马泰勒虫18SrRNA基因序列,在其V4高变区设计特异性引物Te-18F、Te-18R,通过PCR技术获得了531bp的核酸片段。用该引物对马泰勒虫、马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合样本、... 详细信息

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫(Theileria equi,***)PCR检测方法。基于马泰勒虫18SrRNA基因序列,在其V4高变区设计特异性引物Te-18F、Te-18R,通过PCR技术获得了531bp的核酸片段。用该引物对马泰勒虫、马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合样本、驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫基因组模板进行特异性试验。同时对马泰勒虫基因组模板进行不同浓度稀释后扩增,以便于确定试验的敏感性。用本试验建立的方法与常规显微镜镜检方法对45份马属动物血样进行检测。特异性试验显示,在被检测的9个样本中,只有马泰勒虫及马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合模板中扩增出了符合大小的特异核酸片段。驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫的扩增结果均为阴性。灵敏度试验结果表明,PCR对马泰勒虫的扩增效率可达到10-13。对本试验建立的PCR检测马泰勒虫方法评估结果显示,PCR对马泰勒虫的检出率为17.78%(8/45),显微镜镜检结果只有8.89%(4/45)两者的符合率为100%。本试验建立的马泰勒虫PCR检测方法不失,为一种好的检测方法。

关键词：马泰勒虫 PCR诊断方法建立应用

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