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中国兽医科学 2025年第3期55卷 389-395页

作者：贺艳艳郭慧琛孙世琪穆素雨敬晓棋榆林学院生命科学学院陕西榆林719000 中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为探讨可溶性猪CD40L(第113—261位氨基酸)对猪外周血单核细胞(PBMC)的活化作用,将构建好的含猪CD40L基因的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化的重组CD40L蛋白偶联FITC后与PBMC进行原位杂交,同时使用荧光显微镜和流式细胞仪分析研究CD... 详细信息

为探讨可溶性猪CD40L(第113—261位氨基酸)对猪外周血单核细胞(PBMC)的活化作用,将构建好的含猪CD40L基因的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化的重组CD40L蛋白偶联FITC后与PBMC进行原位杂交,同时使用荧光显微镜和流式细胞仪分析研究CD40L蛋白刺激B细胞的生物学活性。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,表达的重组CD40L蛋白大小约14 kDa,确定最佳表达条件为16℃、D_(600 nm)值为1.1、0.5 mmol/L IPTG诱导12 h;流式细胞仪分析表明,重组CD40L蛋白能与PBMC表面的CD40蛋白分子结合,重组CD40L蛋白可以明显活化B细胞(P<0.001)。结论:CD40L具有促进B细胞活化的生物学活性,CD40L能促进免疫细胞反应,具有免疫调节作用。本研究为CD40L在重要家畜物种和人类疾病动物模型中的作用奠定了基础。

关键词：猪CD40L 原核表达生物学活性

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一株牛口咽液分离口蹄疫病毒的特性分析

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微生物学报 2025年

作者：蔡梦婷袁红王利豪杨竞纯王涛包慧芳杨宇轩孙普李坤黄书伦郭海洋李平花卢曾军何继军白兴文中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室 WOAH/国家口蹄疫参考实验室华中农业大学动物医学院甘肃省病原生物学基础学科研究中心

【目的】旨在分离、鉴定一株牛源口咽液中的口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus， FMDV)，分析其抗原蛋白氨基酸变异及增殖特性。【方法】采用RT-PCR及基因测序技术鉴定FMDV阳性牛口咽液样本，通过细胞接种从阳性样本中分离病毒... 详细信息

【目的】旨在分离、鉴定一株牛源口咽液中的口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus， FMDV)，分析其抗原蛋白氨基酸变异及增殖特性。【方法】采用RT-PCR及基因测序技术鉴定FMDV阳性牛口咽液样本，通过细胞接种从阳性样本中分离病毒，并利用间接免疫荧光法对分离病毒进行鉴定。通过PCR分段扩增及序列测定获得分离FMDV的全基因组，进一步通过序列比对分析分离FMDV的抗原蛋白氨基酸变异，通过蚀斑形成试验和一步生长曲线评价分离FMDV的增殖特性。【结果】成功从牛口咽液中分离、鉴定出一株FMDV，命名为O/FMDV/OP/2022/B。该病毒属于O型Ind2001谱系，其抗原蛋白VP1、VP2和VP3的氨基酸残基发生变异。在BHK-21细胞上，O/FMDV/OP/2022/B毒株形成的蚀斑显著小于疫苗毒株O/FMDV/HN/93的蚀斑，且其一步生长曲线明显低于O/FMDV/HN/93。【结论】本研究从牛口咽液中分离出一株FMDV，发现其抗原蛋白氨基酸发生变异，且增殖能力显著低于疫苗毒株O/FMDV/HN/93。该研究有助于从病毒学角度深入理解FMDV持续感染牛口咽组织的机制，并为口蹄疫的防控提供参考依据。

关键词：口蹄疫病毒持续性感染氨基酸突变病毒增殖

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西藏地区藏羊隐孢子虫的分子流行病学调查

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中国兽医科学 2025年第4期55卷 507-511页

作者：孔皓月张月玥马平平牟文杰邹扬郭亚琼王帅张少华华南农业大学兽医学院广东广州510640 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

为了探究西藏高海拔地区藏羊隐孢子虫感染的流行情况,本研究从西藏自治区日喀则市岗巴县的集约化养殖场收集了藏羊粪便样品共420份,使用巢式PCR方法对隐孢子虫SSU rRNA基因进行扩增;利用gp60基因对隐孢子虫阳性样本进行亚型鉴定。结果显... 详细信息

为了探究西藏高海拔地区藏羊隐孢子虫感染的流行情况,本研究从西藏自治区日喀则市岗巴县的集约化养殖场收集了藏羊粪便样品共420份,使用巢式PCR方法对隐孢子虫SSU rRNA基因进行扩增;利用gp60基因对隐孢子虫阳性样本进行亚型鉴定。结果显示,所检地区藏羊隐孢子虫的总感染率为9.0%(38/420)。SSU rRNA基因分析显示,藏羊感染的隐孢子虫虫种为肖氏隐孢子虫和泛在隐孢子虫。差异分析表明,隐孢子虫感染率在不同年龄和性别间表现出统计学上的显著差异(P<0.05)。gp60基因分析显示,22份肖氏隐孢子虫样品成功扩增18份,存在4个亚型家族,分别是ⅩⅩⅢh(n=8)、ⅩⅩⅢl(n=6)、ⅩⅩⅢe(n=2)和ⅩⅩⅢd(n=2);而所有泛在隐孢子虫样本均被鉴定为Ⅻa型(n=16)。由于Ⅻa亚型能够感染人类及多种动物,这表明该地区藏羊携带的隐孢子虫可能存在人兽共患的潜在风险,该地区应采取有效的防控措施。

关键词：藏羊隐孢子虫基因亚型人兽共患

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稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

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畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1159-1169页

作者：荆扬王玉淼李洋常辉马志倩李志伟肖书奇中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 塔里木大学动物科学与技术学院阿拉尔843300

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该... 详细信息

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒过表达细胞系 ORF6基因 M蛋白 MARC-145细胞

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猪流行性腹泻疫苗研究进展

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中国畜牧兽医 2024年第11期51卷 5004-5013页

作者：张洋欧云文马春霞任绍科潘琴邓书明翟佳佳杨山山开江县动物疫病预防控制中心达州636250 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 达州中医药职业学院达州635000

近年来,随着中国养猪事业的高速发展,猪流行性腹泻(PED)已成为猪群的重要传染病,PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的,以腹泻、呕吐、脱水为特征的急性病毒性传染病。PED主要通过呼吸道和消化道传播,哺乳仔猪最易感,死亡率可高达100%,... 详细信息

近年来,随着中国养猪事业的高速发展,猪流行性腹泻(PED)已成为猪群的重要传染病,PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的,以腹泻、呕吐、脱水为特征的急性病毒性传染病。PED主要通过呼吸道和消化道传播,哺乳仔猪最易感,死亡率可高达100%,给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV是单股正链RNA病毒,具有4个主要结构蛋白、16个非结构蛋白和1个辅助蛋白ORF3。自2010年以来,该病毒变异株传播范围不断扩大,流行趋势日益复杂,经典毒株(CV777)相关疫苗已无法提供有效保护。因此,开发更加安全、有效的疫苗已迫在眉睫。灭活疫苗安全性高,但需多次接种且保护效果不佳;弱毒疫苗免疫原性良好,但存在毒力返祖风险;亚单位疫苗不携带病毒其他蛋白结构,使用安全、价格便宜,但其免疫原性差;重组病毒活载体疫苗可诱导产生特异性免疫反应,但安全性不足;重组细菌活载体疫苗能口服刺激机体黏膜免疫,并且载体具有佐剂作用,但其免疫效率不高;转基因植物疫苗安全稳定,但表达量低且研发周期长;核酸疫苗研发周期短、灵活性高,但安全性不高、外源基因易与宿主基因重组。随着相关研究的深入,各类疫苗研究已取得重要研究成果。笔者就PED灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、重组病毒活载体疫苗、重组细菌活载体疫苗、转基因植物疫苗、核酸疫苗进行综述,以期为PED的防治和新型疫苗研发提供参考。

关键词：猪流行性腹泻猪流行性腹泻病毒(PEDV) 流行特点疫苗

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HIF-1α在病原体感染中的作用研究进展

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畜牧兽医学报 2024年第6期55卷 2357-2367页

作者：张正洋宋银娟储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046 农业农村部动物病原生物学重点实验室农业农村部反刍动物重大疫病防控重点实验室(西部) 兰州730046

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞应对缺氧反应的中枢调节因子,稳定的HIF-1α具有多种功能,参与血管生成、代谢调节、细胞自噬及细胞凋亡等多种生物学过程。HIF-1α的稳定性受到多种信号的调节,包括氧气水平、病原体感染以及代谢中间体... 详细信息

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞应对缺氧反应的中枢调节因子,稳定的HIF-1α具有多种功能,参与血管生成、代谢调节、细胞自噬及细胞凋亡等多种生物学过程。HIF-1α的稳定性受到多种信号的调节,包括氧气水平、病原体感染以及代谢中间体等。近年来,越来越多的研究表明,HIF-1α在感染性疾病中起着重要作用。因此,本文就HIF-1α稳定性的调节机制及其在病毒、细菌等病原体感染和相关疾病发生发展中的作用进行讨论和总结,旨在为进一步解析HIF-1α在防御多种病原体感染中的作用和其作为靶向治疗的潜在靶点等相关研究提供参考。

关键词： HIF-1α 稳定性病原体感染作用机制

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EphA2基因敲除和过表达BHK-21细胞系的构建及其对口蹄疫病毒复制的影响

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中国兽医科学 2025年

作者：李熙忠范许许朱兆宇裴丹诗王一卓何路任青峰郑海学李伟伟郜原甘肃农业大学生命科学与技术学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室河南农业大学动物医学院

构建促红细胞生成素肝细胞受体A2（Erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2）基因敲除和过表达的BHK-21细胞系，探究其对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建EphA2基因敲除的BHK-21细胞系，利用慢病毒感染构建EphA2基因过表达的BHK-21细胞系。经嘌呤霉素筛选及单克隆挑取，成功获得稳定细胞系。随后，以野生型BHK-21细胞为对照，将FMDV分别感染上述细胞系，采用实时荧光定量 PCR、蛋白质免疫印迹等方法检测病毒核酸和蛋白水平。结果表明，EphA2基因敲除后，FMDV在BHK-21细胞中的复制显著受到抑制，病毒核酸和蛋白表达量明显降低；而EphA2基因过表达时，FMDV复制增强。本研究揭示了EphA2基因在FMDV复制过程中具有重要作用，为深入理解FMDV的感染机制及防控策略提供了理论依据。

关键词： CRISPR/Cas9 EphA2 口蹄疫病毒

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O型口蹄疫病毒3D突变毒株的构建及其生物学特性分析

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中国兽医科学 2025年第06期 719-724页

作者：朱兆宇范许许裴丹诗王一卓何路李熙忠任青峰郑海学李伟伟郜原甘肃农业大学生命科学技术学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室河南农业大学动物医学院

本研究利用反向遗传技术构建O型口蹄疫病毒（FMDV）3D蛋白突变毒株rFMDV-M403A，并分析了其生物学特征。结果表明，重组病毒在传代过程中氨基酸能稳定突变；病毒滴度显示，突变毒株生长速度较野生毒株有所降低，重组病毒毒力显著低于野... 详细信息

本研究利用反向遗传技术构建O型口蹄疫病毒（FMDV）3D蛋白突变毒株rFMDV-M403A，并分析了其生物学特征。结果表明，重组病毒在传代过程中氨基酸能稳定突变；病毒滴度显示，突变毒株生长速度较野生毒株有所降低，重组病毒毒力显著低于野生毒株；乳鼠感染试验结果显示，突变毒株会使乳鼠存活率提高，肝中病毒载量和组织病变显著降低。该研究对口蹄疫病毒致病机理的认识及制定防控措施具有重要意义，同时，也为后续开发口蹄疫基因工程疫苗奠定了坚实的理论基础。

关键词： O型口蹄疫病毒反向遗传操作 3D蛋白突变生物学特性

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类NADC30-like株和HP-PRRSV鉴别诊断RT-PCR方法的建立及应用

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中国兽医科学 2025年

作者：乔璐柳海云杨健黄国梁郭慧琛孙世琪牛家强西藏农牧学院动物科学学院农业农村部西藏包虫病防治重点实验室西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

本研究旨在建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）类NADC30株（NADC30-like）和高致病PRRSV（HP-PRRSV）鉴别诊断的RT-PCR方法，为该病的检测和防控提供依据。根据PRRSV Nsp2基因核苷酸序列特征，设计一种可同时鉴定HP-PRRSV和NADC30... 详细信息

本研究旨在建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）类NADC30株（NADC30-like）和高致病PRRSV（HP-PRRSV）鉴别诊断的RT-PCR方法，为该病的检测和防控提供依据。根据PRRSV Nsp2基因核苷酸序列特征，设计一种可同时鉴定HP-PRRSV和NADC30-like株的RT-PCR方法。结果显示，该方法扩增HP-PRRSV和NADC30-like株Nsp2基因片段大小分别为931 bp和628 bp，最低检测下限分别为472 copies/μL和132 copies/μL，对其他基因亚型PRRSV和病毒均未扩增出特异性条带，针对此方法，分离优势毒株并纯化。对来自甘肃省部分地区猪场的196份临床样品进行检测，发现28份样品为HP-PRRSV核酸阳性，15份样品为NADC30-like核酸阳性，3份样品为HP-PRRSV+NADC30-like核酸阳性；RT-PCR检测ORF5基因，发现HP-PRRSV和NADC30-like核酸阳性样品数量分别为37份和9份，但未发现混合感染样品；分离优势毒株，得到了传代稳定的病毒；纯化后获得了纯度较高且结构完整的病毒粒子。本研究建立的RT-PCR方法可用于HP-PRRSV和NADC30-like株快速鉴别诊断和分子流行病学调查研究，但其灵敏度稍差；且其无法检测其他PRRSV亚型毒株。

关键词： HP-PRRSV NADC30-like 鉴别诊断 RT-PCR 分离纯化

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口蹄疫病毒Asia1型猪源中和抗体的筛选与抗原表位鉴定

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畜牧兽医学报 2024年第11期55卷 5211-5221页

作者：董开恒黄书伦李凤娟李坤刘果张强包慧芳李洪炫卢曾军张小丽甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州大学动物医学与生物安全学院国家口蹄疫参考实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流... 详细信息

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流式细胞术分选免疫猪PBMCs中的抗原特异性B细胞,通过巢式PCR扩增单个B细胞IgG抗体重链与轻链可变区基因序列,分别构建IgG抗体重链与轻链表达质粒,将其共转染CHO-S细胞进行抗体表达;通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验(VNT)验证抗体反应性和中和活性,利用免疫印迹、中和抗体逃逸突变株筛选鉴定中和抗体所识别的抗原表位类型和抗原表位关键氨基酸。结果显示:获得了5株反应性良好的Asia1型FMDV特异性抗体,其中PD3和PD7为中和抗体,两株中和抗体识别相同表位,关键氨基酸为VP2蛋白72位残基(D)。本研究首次获得Asia1型FMDV特异性猪源中和抗体,鉴定VP272D是中和表位的关键氨基酸,进一步丰富了Asia1型FMDV抗原位点信息,为FMDV Asia1型分子疫苗和新诊断检测技术研究的奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 Asia1型猪源单克隆抗体抗原表位

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