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银染mRNA差异显示法克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)抗药性相关基因

中国兽医学报 2006年第4期26卷 369-372页

作者：韩红玉姜连连赵其平董辉陈兆国林矫矫黄兵中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200232

以柔嫩艾美耳球虫(E im eria tenella)敏感株、地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊为材料,用银染mRNA差异显示方法筛选和克隆与球虫抗药性相关的基因。首先提取这3个虫株孢子化卵囊的总RNA为模板,用O ligo(dT)12GG为锚定引物和... 详细信息

以柔嫩艾美耳球虫(E im eria tenella)敏感株、地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊为材料,用银染mRNA差异显示方法筛选和克隆与球虫抗药性相关的基因。首先提取这3个虫株孢子化卵囊的总RNA为模板,用O ligo(dT)12GG为锚定引物和2个10碱基随机引物组合进行RT-PCR,产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。分别切取5条差异条带,进行2次PCR扩增,产物回收后与PGEM-T-easy V ector连接转化。经PCR鉴定正确后,再进行斑点杂交试验、序列分析和同源性比较。结果发现,地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株分离的差异片段中都有2个cDNA片段(可能为新的基因片段),这为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生的分子机理奠定了一定的基础。

关键词：柔嫩艾美耳球虫抗药性银染mRNA差异显示基因克隆

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柔嫩艾美耳球虫抗马杜拉霉素、地克珠利虫株特异消减文库的构建

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中国农业科学 2005年第8期38卷 1712-1716页

作者：韩红玉赵其平姜连连董辉陈兆国黄兵中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所/农业部动物寄生虫学重点开放实验室中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所/农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200232

以遗传背景一致的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)敏感株孢子化卵囊为驱动组,马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊为试验组,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次PCR分别构建了富含两个抗药株孢子化卵囊与敏感株孢子... 详细信息

以遗传背景一致的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)敏感株孢子化卵囊为驱动组,马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊为试验组,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次PCR分别构建了富含两个抗药株孢子化卵囊与敏感株孢子化卵囊之间差异表达基因的消减cDNA文库。随机从两个消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊的消减文库重组率分别为96%和98%,差异基因片段大小分布在250bp～1.0kb之间。从每个文库中随机挑取65个阳性克隆经斑点杂交试验,分别选择表达量上调的6个克隆进行序列分析和同源性比较。结果发现,有4个cDNA片段可能是新基因片段,与地克珠利抗药株的产生有关;有3个新的cDNA片段可能与马杜拉霉素抗药株的产生有关。这些结果将为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生及发展的分子机理奠定了一定的基础。

关键词：柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素地克珠利抗药性相关基因抑制消减杂交基因克隆

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12株中国伊氏锥虫对小鼠的毒力试验

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中国预防兽医学报 2007年第6期29卷 432-434页

作者：周勇志沈杰何国声周金林中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫学重点开放实验室上海200232

为了确定中国伊氏锥虫各株的毒力强弱,对中国伊氏锥虫:安徽水牛株(AHB)、广东阳江水牛株(GDB_1)、广东水牛株(GDB_2)、广东马株(GDH)、广西骡株(GXM)、湖北骡株(HBM)、湖南水牛株(HNB)、江苏高邮水牛株(JSB_1)、江苏盱眙水牛株(JSB_2)... 详细信息

为了确定中国伊氏锥虫各株的毒力强弱,对中国伊氏锥虫:安徽水牛株(AHB)、广东阳江水牛株(GDB_1)、广东水牛株(GDB_2)、广东马株(GDH)、广西骡株(GXM)、湖北骡株(HBM)、湖南水牛株(HNB)、江苏高邮水牛株(JSB_1)、江苏盱眙水牛株(JSB_2)、新疆骆驼株(XJCA)、云南水牛株(YNB)、浙江水牛株(ZJB)进行小鼠的毒力试验。以各组鼠死亡率和平均存活天数作为毒力强弱的主要依据。结果表明最强致死率为100%,最弱30%;致死所需时间平均为7.5 d～25 d。对小鼠的致病力强弱依次是:AHB>YNB>GDB_2>XJCA>HBM>HNC>JSB_1>GXM>GDB_1>GDH>JSB_2>ZJB。提示不同株的毒力差异显著,测定结果可为伊氏锥虫相关科学研究选株提供依据。

关键词：伊氏锥虫感染毒力

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柔嫩艾美球虫地克珠利和马杜拉霉素抗药株与敏感株孢子化卵囊18 S rDNA基因的差异

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中国兽医科学 2006年第6期36卷 472-477页

作者：蔡兰黄兵肖明韩红玉姜连连赵其平董辉上海师范大学生命与环境科学学院中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200232 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室

为探讨抗球虫药物地克珠利和马杜拉霉素对柔嫩艾美球虫18 S rDNA的影响,分别对人工诱导的柔嫩艾美球虫地克珠利抗药株(ETAD)、马杜拉霉素抗药株(ETAM)和药物敏感株 (ETDS)孢子化卵囊的18 S rDNA基因进行了克隆测序,并通过生物信息软件... 详细信息

为探讨抗球虫药物地克珠利和马杜拉霉素对柔嫩艾美球虫18 S rDNA的影响,分别对人工诱导的柔嫩艾美球虫地克珠利抗药株(ETAD)、马杜拉霉素抗药株(ETAM)和药物敏感株 (ETDS)孢子化卵囊的18 S rDNA基因进行了克隆测序,并通过生物信息软件进行对比差异分析。结果显示,ETAM株有3个碱基发生突变(T170突变为C,T646突变为C,G694突变为C); ETAD株有1个碱基发生突变(T646突变为C)。经进一步分析比较,发现ETAM株18 S rRNA 的二级结构与ETDS株的差异很大,而ETAD株18 S rRNA的二级结构则与ETDS株的完全相同。这些碱基的突变有可能是导致***产生抗药性的原因之一。

关键词：艾美球虫马杜拉霉素地克珠利抗药性 18 S rDNA

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抗猪流感病毒的单链抗体在真核细胞中的表达

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中国兽医科学 2014年第12期44卷 1268-1272页

作者：蒋蔚陈永军刘迎春杨康王权中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫学重点开放实验室上海200241

为了研究抗猪流感病毒的单链抗体(scFv)在真核细胞内的表达情况及其生物学特性,通过PCR从前期试验获得的重组噬粒中扩增出scFv基因,将其克隆到真核表达载体p3×FLAG-CMV-7.1中,测序验证后转染A549细胞进行表达,对表达蛋白进行特性... 详细信息

为了研究抗猪流感病毒的单链抗体(scFv)在真核细胞内的表达情况及其生物学特性,通过PCR从前期试验获得的重组噬粒中扩增出scFv基因,将其克隆到真核表达载体p3×FLAG-CMV-7.1中,测序验证后转染A549细胞进行表达,对表达蛋白进行特性分析。结果显示,scFv基因的核苷酸序列的长度为732bp,序列排列方式为VH-Linker-VL,与数据库比对结果表明,符合小鼠抗体的重链和轻链可变区基因的结构特征。间接免疫荧光试验的结果表明,细胞内表达的绿色荧光蛋白主要分布在细胞质中。Westernblot分析显示,转染细胞的培养液上清和细胞裂解液上清中均可检测到一约32.8ku的融合蛋白,与预测结果一致。ELISA结果表明,表达的scFv具有结合猪流感病毒的活性。结果证实,抗猪流感病毒的scFv能够在细胞内正确表达,为进一步对抗猪流感的免疫治疗及免疫检测的研究提供了依据。

关键词：猪流感病毒单链抗体真核表达

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日本血吸虫蛋白酶体α2亚基基因的克隆、表达及功能分析

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生物工程学报 2010年第4期26卷 509-516页

作者：洪炀韩宏晓彭金彪李晔石耀军傅志强刘金明李祥瑞林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241 南京农业大学动物医学院南京210095

26S蛋白酶体是一种能够降解大多数内源性蛋白的多亚基复合物,它的蛋白降解作用能够影响细胞周期、转录控制和其他一些重要的细胞进程。本实验利用PCR技术从日本血吸虫18d童虫中首次扩增到蛋白酶体α2亚基基因(GenBank Accession ***8137... 详细信息

26S蛋白酶体是一种能够降解大多数内源性蛋白的多亚基复合物,它的蛋白降解作用能够影响细胞周期、转录控制和其他一些重要的细胞进程。本实验利用PCR技术从日本血吸虫18d童虫中首次扩增到蛋白酶体α2亚基基因(GenBank Accession ***813725),序列分析表明该基因的开放阅读框(ORF)含708bp,编码235个氨基酸,理论分子量25.84kDa。同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫蛋白酶体α2亚基,命名为SjPSMA2。实时定量PCR分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d和42d虫体中都有表达,7d和23d虫体表达量低于其他几个时期。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjPSMA2,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以包涵体形式存在,Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别,并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,诱导产生了较高的特异性抗体水平及12.33%的减虫率和35.23%的肝脏减卵率。SjPSMA2基因及其表达产物的获得,为探索蛋白酶体在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。

关键词：日本血吸虫蛋白酶体α2亚基克隆表达免疫保护

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日本血吸虫4个基因启动子相关序列的克隆和初步研究

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中国血吸虫病防治杂志 2013年第3期25卷 246-249页

作者：罗荣郭素霞石耀军程国锋中国农业科学院上海兽医研究所、农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241

目的比较4个日本血吸虫基因启动子相关序列对荧光素报告基因的表达情况。方法利用PCR技术扩增4个日本血吸虫基因启动子的相关序列,并利用常规分子生物学技术将PCR产物克隆到荧光素酶报告基因的上游。利用脂质体转染和电穿孔技术将纯化... 详细信息

目的比较4个日本血吸虫基因启动子相关序列对荧光素报告基因的表达情况。方法利用PCR技术扩增4个日本血吸虫基因启动子的相关序列,并利用常规分子生物学技术将PCR产物克隆到荧光素酶报告基因的上游。利用脂质体转染和电穿孔技术将纯化的重组质粒分别转染到HEK293细胞和日本血吸虫体内,并以荧光素酶检测系统测定了报告基因表达情况。结果PCR扩增获得了日本血吸虫卵壳蛋白(Eggshell protein,ESG-2A)、延伸因子1(Elongation factor 1 alpha 1,EF)、烯醇酶(Enolase,EN)和抱雌沟蛋白(Gynecophornal canal protein,GCP)基因的启动子相关序列,并将它们成功地克隆到pGlu-Basic载体。重组质粒转染表明4个日本血吸虫启动子相关序列均可驱动荧光素酶报告基因在HEK293细胞和日本血吸虫虫体表达。其中含有GCP和EN启动子相关序列的重组质粒可在HEK293细胞及其培养基中检测到较高的荧光素酶活性,含有GCP和ESG的重组质粒可在日本血吸虫虫体培养基中检测到较高的荧光素酶活性。结论获得的4个日本血吸虫启动子相关序列均可驱动荧光素酶报告基因在HEK293细胞和日本血吸虫虫体表达,为进一步利用这些启动子相关序列开展血吸虫基因操作研究奠定了初步基础。

关键词：日本血吸虫启动子基因操作报告基因克隆

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寄生虫潜在药物靶标—乳酸脱氢酶

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中国动物传染病学报 2015年第3期23卷 73-80页

作者：李莎董辉黄兵中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241

寄生虫是包括原虫、吸虫、绦虫、线虫、棘头虫等在内的一大类生物的总称,可引起重要的人畜寄生虫病。抗寄生虫药物的长期使用甚至是滥用使得寄生虫对现有药物产生了明显的抗药性,急需开发新型药物以有效控制寄生虫感染。乳酸脱氢酶(lact... 详细信息

寄生虫是包括原虫、吸虫、绦虫、线虫、棘头虫等在内的一大类生物的总称,可引起重要的人畜寄生虫病。抗寄生虫药物的长期使用甚至是滥用使得寄生虫对现有药物产生了明显的抗药性,急需开发新型药物以有效控制寄生虫感染。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途径的末端酶,在还原型辅酶Ⅰ(NADH)和氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)的辅助下,催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应,释放能量供寄生虫所需。本文针对抗寄生虫药物靶标的鉴定方法以及寄生虫LDH作为潜在药物靶标的研究进展进行了综述,对阐明药物的分子作用机理及研发新药具有重要的理论意义。

关键词：寄生虫抗寄生虫药物药物靶标乳酸脱氢酶

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柔嫩艾美耳球虫新基因的生物信息学分析与克隆表达

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生物技术通报 2011年第5期27卷 108-113页

作者：姜连连林矫矫韩红玉董辉赵其平朱顺海马卫娇程军曾艳波黄兵中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241

为了研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的两个主要入侵发育阶段——子孢子和裂殖子的差异基因,根据已报道的子孢子与裂殖子差异的ESTs序列,应用RACE技术克隆获得了子孢子阶段差异表达的新基因全长cDNA序列,命名为ZL583。该基因全长为... 详细信息

为了研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的两个主要入侵发育阶段——子孢子和裂殖子的差异基因,根据已报道的子孢子与裂殖子差异的ESTs序列,应用RACE技术克隆获得了子孢子阶段差异表达的新基因全长cDNA序列,命名为ZL583。该基因全长为862 bp,开放阅读框(ORF)为486 bp,编码161个氨基酸,编码蛋白的分子量约为16.9 kD,利用生物信息学分析软件,分析新基因所编码蛋白的性质、定位、结构等特征。利用荧光定量PCR对柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段该基因的表达量进行分析显示,子孢子阶段的表达高于其他发育阶段。将ZL583克隆于pET-28a中构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达,获得重组蛋白分子量约23 kD。免疫印迹分析显示该重组蛋白可与兔抗子孢子血清发生特异性反应,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。

关键词：柔嫩艾美耳球虫子孢子裂殖子克隆表达

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柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建

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西南大学学报（自然科学版） 2011年第6期33卷 19-24页

作者：平宪卿韩红玉黄兵姜连连董辉赵其平李洋郭涛朱顺海中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A0... 详细信息

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因.用EcoRI和NotI酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用SacI将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达.RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段,是一个子孢子高表达基因.重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达.Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性.

关键词： A08基因柔嫩艾美耳球虫荧光实时定量PCR 毕赤酵母表达

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