检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2008年第9期24卷 1550-1555页

作者：周岩林矫矫姚利晓王欣之石耀军陆珂刘金明傅志强陶丽红中国农业科学院上海兽医研究所国家防治动物血吸虫病专业实验室农业部动物寄生虫学重点开放实验室

磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyceratemutas)是糖酵解过程中的一种重要酶,主要催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸。利用PCR技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个PGAM家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含753bp,编码250个氨基... 详细信息

磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyceratemutas)是糖酵解过程中的一种重要酶,主要催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸。利用PCR技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个PGAM家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含753bp,编码250个氨基酸,理论分子量28.26kD,理论等电点7.01。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型PGAM家族特征,推测为血吸虫的PGAM基因,命名为SjPGAM(GenBank Accession ***374631)。实时定量PCR分析显示该基因在14d和19d童虫中的表达量明显高于其他发育阶段,42d雄虫中的表达量高于雌虫。构建了该基因的原核重组表达质粒pET-28a(+)-PGAM,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以包涵体形式存在,Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。SjPGAM基因及其表达产物的获得,为探索PGAM基因家族在血吸虫能量代谢过程中碳水化合物转运、新陈代谢调节和生长发育提供了重要基础。

关键词：日本血吸虫糖酵解磷酸甘油酸变位酶克隆

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日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆、表达及功能分析

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生物工程学报 2007年第3期23卷 392-397页

作者：陶丽红姚利晓傅志强冯新港刘金明石耀军苑纯秀蔡幼民林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所国家防治动物血吸虫病专业实验室农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200232

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。... 详细信息

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43%、37%,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4(GenBank登陆号DQ643829)。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX-4T-2-Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。

关键词：日本血吸虫信号转导 Wnt4 发育差异表达

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日本血吸虫重组多表位核酸疫苗的构建与免疫保护效果评估

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中国兽医科学 2013年第1期43卷 47-52页

作者：章登吉傅志强石耀军李浩孙安国彭运潮林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫病重点开放实验室国家动物血吸虫病专业实验室上海200241

为构建重组日本血吸虫多表位核酸疫苗,并通过小鼠免疫保护试验比较不同重组多表位疫苗诱导的免疫保护效果,筛选并以PCR方法扩增日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)、谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28GST)的抗原表位和23ku膜抗原大亲水区(LHD-Sj23)的编... 详细信息

为构建重组日本血吸虫多表位核酸疫苗,并通过小鼠免疫保护试验比较不同重组多表位疫苗诱导的免疫保护效果,筛选并以PCR方法扩增日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)、谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28GST)的抗原表位和23ku膜抗原大亲水区(LHD-Sj23)的编码DNA片段,构建了pCMV-LHD-Sj23-BSj28,pCMV-BGCP-LHD-Sj23,pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28三种日本血吸虫多表位核酸疫苗;采用肌肉注射法接种昆明系小鼠;用日本血吸虫尾蚴攻击感染后,剖杀小鼠,计算减虫率。结果显示,3种重组的真核表达质粒在免疫小鼠中分别获得了6.30%,14.76%和64.95%的减虫率。表明该重组多表位核酸疫苗可诱导较高的免疫保护效果,获得的三价核酸疫苗pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28具有潜在的应用价值。

关键词：日本血吸虫表位核酸疫苗

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日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2007年第5期25卷 406-410页

作者：孙毅贾人初刘金明苑纯秀石耀军陆珂傅志强孙焕蔡幼民林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所国家防治动物血吸虫病专业实验室农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200232

目的构建日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。方法用Trizol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA,分离纯化mRNA,经随机引物反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,再用EcoRⅠ和HindⅢ消化,使其成为两端分别带有EcoRⅠ... 详细信息

目的构建日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。方法用Trizol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA,分离纯化mRNA,经随机引物反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,再用EcoRⅠ和HindⅢ消化,使其成为两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。收集300bp以上的双链cDNA片段,与T7Select 10-3b载体连接,经体外包装后,以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。通过滴度测定及PCR技术鉴定文库质量,用7种特异性引物以PCR法从文库中钓取目的基因以检测文库的代表性。结果原始文库的库容量为4.98×106pfu,扩增后文库滴度为3.85×1011pfu/ml。对随机挑取的96个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为93.8%,其中95.6%的插入片段大于300bp。7种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。结论构建了日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。

关键词：日本血吸虫噬菌体展示cDNA文库成虫

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牛日本血吸虫重组二价表位抗原间接ELISA检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2012年第12期42卷 1273-1277页

作者：陆珂李浩石耀军周伟芳陈实朱传刚傅志强杨健美洪炀苑纯秀林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所国家防治动物血吸虫病专业实验室农业部动物寄生虫病重点开放实验室上海200241

为了建立一种更为敏感、特异的牛血吸虫病诊断方法,表达和纯化了日本血吸虫二价表位抗原(pGEX-BSjGCP-BSj23),将重组蛋白以10mg/L浓度包被酶标板,以1∶40 000稀释酶标兔抗牛IgG,建立了检测牛血吸虫病的间接ELISA方法。以SEA抗原作为对照... 详细信息

为了建立一种更为敏感、特异的牛血吸虫病诊断方法,表达和纯化了日本血吸虫二价表位抗原(pGEX-BSjGCP-BSj23),将重组蛋白以10mg/L浓度包被酶标板,以1∶40 000稀释酶标兔抗牛IgG,建立了检测牛血吸虫病的间接ELISA方法。以SEA抗原作为对照,进行敏感性试验和特异性试验。结果显示,以重组抗原pGEX-BSjGCP-BSj23作为诊断抗原,建立的间接ELISA的特异性明显高于SEA,敏感性与SEA相当。检测现场水牛血清样品,结果阴性符合率为100%,阳性符合率为90.97%。结果表明,建立的ELISA检测方法对牛血吸虫病的诊断具有良好的特异性和敏感性。

关键词：日本血吸虫二价表位抗原间接酶联免疫吸附试验

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日本血吸虫新基因Sjnanos的克隆、表达及免疫保护效果评估

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中国人兽共患病学报 2010年第7期26卷 631-637页

作者：王艳郭凡吉彭金彪李晔洪炀陈实傅志强石耀军林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室国家防治动物血吸虫病专业实验室上海200241

目的扩增、表达日本血吸虫Sjnanos编码基因并评估其重组蛋白诱导的免疫保护效果。方法从42d龄的日本血吸虫成虫中扩增了一个日本血吸虫性别差异表达的基因,GenBank登录号为AY814948,并对其进行生物信息学分析。将该基因亚克隆入原核表... 详细信息

目的扩增、表达日本血吸虫Sjnanos编码基因并评估其重组蛋白诱导的免疫保护效果。方法从42d龄的日本血吸虫成虫中扩增了一个日本血吸虫性别差异表达的基因,GenBank登录号为AY814948,并对其进行生物信息学分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(***)BL21,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测其血清特异性抗体效价,蛋白印迹分析检测其抗原性,以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析该基因在血吸虫各个阶段的表达状况。结果同源性分析表明,该基因为日本血吸虫的一个新基因,其编码序列的开放阅读框(ORF)为525bp,编码174个氨基酸,理论相对分子量为19.9,PI为8.2。荧光定量PCR技术分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d、42d虫体均有表达,但在18d和13d虫体的表达量明显高于其他天数的虫体,在雄虫的表达量高于雌虫。成功构建了该基因的重组表达质粒pET28a(+)-Sjnanos,并在大肠埃希菌中获得表达,Western-blot分析表明重组蛋白具有较好的免疫原性,动物免疫保护试验获得了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率。结论获得日本血吸虫新的抗原基因Sjnanos,该基因的重组蛋白在小鼠中诱导了部分免疫保护作用。

关键词：日本血吸虫 nanos基因抗原性免疫保护

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东方田鼠肝脏裂解物筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库

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中国预防兽医学报 2008年第8期30卷 592-596,617页

作者：孙焕刘金明孙帅宋震宇石耀军陆珂李浩金亚美林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所国家防治动物血吸虫病专业实验室/农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200232

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为寻找东方田鼠抗血吸虫抗性相关靶基因,探索其分子机理,我们将日本血吸虫童虫与东方田鼠不同组织/器官裂解物共培养,比较它们对血吸虫童虫的杀伤效果,之后,以杀伤效果较好的肝脏裂解物为探针,以亲和淘... 详细信息

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为寻找东方田鼠抗血吸虫抗性相关靶基因,探索其分子机理,我们将日本血吸虫童虫与东方田鼠不同组织/器官裂解物共培养,比较它们对血吸虫童虫的杀伤效果,之后,以杀伤效果较好的肝脏裂解物为探针,以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫(44d)噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选后,随机挑取92个噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析,获得了19个有效EST序列,其中15条EST序列与已知基因或表达序列标签同源,4个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性,为新的表达序列标签。对19个有效EST编码蛋白的功能预测结果显示,其中6个为卵壳蛋白(Eggshell protein)相关基因,10个EST及其编码蛋白的功能与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。研究结果提示,东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达,进而影响血吸虫的发育,可能是东方田鼠具有抗血吸虫特性的一个重要分子机理。

关键词：日本血吸虫东方田鼠筛选噬菌体展示cDNA文库

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东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建

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中国预防兽医学报 2008年第1期30卷 5-9页

作者：贾人初孙毅刘金明傅志强苑纯秀石耀军陆珂孙焕李浩林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所国家防治动物血吸虫病专业实验室/农业部动物寄生虫学重点开放实验室

本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础。用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ... 详细信息

本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础。用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ和HindⅢ酶切,使其两端分别带EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端。用Mini Column纯化、收集300bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。经测定,库容量为1.3×107PFU/mL,扩增后文库滴度为1.8×1011PFU/mL。对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91.7%,阳性克隆片段大小分布在200bp～1000bp,其中有95.5%的插入片段大于300bp。用日本血吸虫童虫可溶性抗原对文库进行了初筛,得到了21个ESTs,将这些阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养,其中大部分克隆诱导的童虫死亡率比阴性噬菌体对照高出2%～13%。

关键词：东方田鼠肝脏 T7噬菌体展示 cDNA文库

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利用RNAi和表达谱芯片分析日本血吸虫Sj34.9基因的功能

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中国血吸虫病防治杂志 2012年第2期24卷 127-131,145页

作者：刘萍萍石艳丽杨云霞刘金明林矫矫金亚美中国农业科学院上海兽医研究所、国家防治动物血吸虫病专业实验室、农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241

目的分析日本血吸虫新基因Sj34.9的功能,为进一步研究该基因提供依据。方法采用RNA干扰(RNAi)技术对Sj34.9基因在血吸虫体内的表达进行干扰,利用血吸虫寡聚核苷酸表达谱芯片分析Sj34.9基因表达沉默后血吸虫基因的表达情况。结果 Sj34.9... 详细信息

目的分析日本血吸虫新基因Sj34.9的功能,为进一步研究该基因提供依据。方法采用RNA干扰(RNAi)技术对Sj34.9基因在血吸虫体内的表达进行干扰,利用血吸虫寡聚核苷酸表达谱芯片分析Sj34.9基因表达沉默后血吸虫基因的表达情况。结果 Sj34.9基因RNAi组与对照组相比,显著差异表达的基因共378个,其中上调基因202个,下调基因176个;通路分析显示,表达差异基因主要与信号转导、信号分子间相互作用及各类物质代谢有关;基因本体论分类结果显示,多数基因与分子间结合、膜构成、细胞过程和机体生长发育及代谢相关。结论 Sj34.9基因可能对日本血吸虫的形成、生长、发育、调节、代谢等具有重要作用。

关键词：日本血吸虫 RNA干扰(RNAi) 表达谱芯片基因表达

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用日本血吸虫重组抗原诊断牛血吸虫病的研究

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中国兽医科学 2008年第6期38卷 489-493页

作者：周伟芳林矫矫朱传刚石耀军刘金明中国农业科学院上海兽医研究所国家防治血吸虫病专业实验室农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200232

为寻找可替代虫卵抗原(SEA)用于家畜血吸虫病血清学诊断的重组抗原,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)比较了日本血吸虫23ku膜蛋白大亲水区多肽重组蛋白LHD-Sj23和日本血吸虫SEA检测牛血吸虫病的敏感性和特异性。结果显示,SEA和LHD-Sj23作为... 详细信息

为寻找可替代虫卵抗原(SEA)用于家畜血吸虫病血清学诊断的重组抗原,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)比较了日本血吸虫23ku膜蛋白大亲水区多肽重组蛋白LHD-Sj23和日本血吸虫SEA检测牛血吸虫病的敏感性和特异性。结果显示,SEA和LHD-Sj23作为诊断抗原对189例血吸虫病牛和92例健康牛的阳性检出率分别为87.8%和90.5%,阳性符合率分别为93.5%和92.4%。两种抗原之间敏感性和特异性均无显著性差异(P>0.05)。提示,LHD-Sj23重组抗原可替代SEA用于家畜血吸虫病的血清学诊断。

关键词：牛血吸虫病重组抗原血清学诊断

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