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中国兽医学报 2009年第2期29卷 139-142页

作者：韦祖樟袁世山中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室上海200232

根据马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)Bucyrus株全基因组序列设计并合成EAV特异引物,进而应用RT-PCR技术分6段扩增了EAV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段PE124、PE631、PE1854、PE5191、PE61107、PE97Q分别克隆到载体PCR BluntⅡ-TOPO中,建立了EAV初级cDNA克隆。在扩增5′末端时,引入NotⅠ酶切位点和T3启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入XhoⅠ酶切位点,后者供cDNA模板的线性化之用。将扩增片段在PCR BluntⅡ-TOPO中依次连接,最后亚克隆到质粒pBluescriptⅡKS(+)中,获得了EAV全长基因组cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明:该毒株基因组全长为12 704个核苷酸,与EAVBucyrus分离株的同源性为99.1%;全长基因组中有104个核苷酸发生突变,相应地导致编码区内34个氨基酸的改变。

关键词：马动脉炎病毒全长cDNA克隆感染性克隆

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建

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微生物与感染 2007年第4期2卷 219-227页

作者：吕健孙志张建武刘维全袁世山中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室上海200232 中国农业大学生物学院北京100094

目的确定"猪高热综合征"的主要病原是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),为探寻高致病性病毒基因组结构和功能、高致病性蓝耳病发病机制,以及进一步研制针对后者的基因工程疫苗奠定基础。方法根据PRRSV基因组序列设计特异性... 详细信息

目的确定"猪高热综合征"的主要病原是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),为探寻高致病性病毒基因组结构和功能、高致病性蓝耳病发病机制,以及进一步研制针对后者的基因工程疫苗奠定基础。方法根据PRRSV基因组序列设计特异性引物,分5段扩增了高致病性PRRSV JX143株的全长cDNA,将各cDNA片段克隆到pBlueScriptⅡSK(+)载体中,进而利用重叠区中的单酶切位点将其连接成JX143株的全长cDNA克隆pJX143和含有遗传标记MluⅠ限制性内切酶的基因组全长cDNA克隆pJX143-M。结果全长cDNA克隆经体外合成RNA后转染MA-104细胞,均获得稳定的拯救病毒。通过比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线和利用拯救病毒vJX143进行动物回归试验,结果发现病毒学及生物学特性没有显著差异。结论PRRSV的JX143株病毒确实是引起"猪高热综合征"的主要病原;建立了首个高致病性PRRSV的感染性cDNA克隆,证明拯救病毒与亲本病毒生物学特性相同。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆高致病性动物回归试验

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0612株全长感染性克隆的构建

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猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0612株全长感染性克隆的构建

2007年中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会

作者：吕健孙志张建武刘维全袁世山中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室上海 200232 中国农业大学生物学院北京 100097 中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室上海 200232 中国农业大学生物学院北京 100097

近年来在全国范围广泛流行的“猪无名高热”的主要病原之一为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。本研究根据PRRSV基因组序列设计特异性引物，分五段扩增了高致病性猪蓝耳病病毒JX0612株的全长cDNA，将各cDNA片段克隆到pBlueScript Ⅱ SK(+... 详细信息

近年来在全国范围广泛流行的“猪无名高热”的主要病原之一为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。本研究根据PRRSV基因组序列设计特异性引物，分五段扩增了高致病性猪蓝耳病病毒JX0612株的全长cDNA，将各cDNA片段克隆到pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中，并且利用重叠区单酶切位点将其连接成JX0612株的全长cDNA克隆。运用5’RACE扩增到基因组5’最末端序列，亚克隆到pBlueScript Ⅱ SK(+)的同时在5’端上游引入17启动子序列。在3’端ORF5下游引入Mlu Ⅰ位点，最终成功构建含有PRRSV JX0612株基因组全长cDNA的重组质粒pJX0612和含有遗传标记Mlu Ⅰ的基因组全长cDNA克隆pJX0612-M。两者经体外合成RNA后转染MARC-145细胞，均获得拯救病毒。病毒传代后核酸序列分析表明Mlu Ⅰ遗传标志稳定存在。此外，比较野毒与拯救病毒的病毒滴度变化，同时绘制一步生长曲线，结果发现病毒生长特性没有显著差异;动物回归实验验证了该株病毒就是引起“猪无名高热”的主要病原。本研究中构建的基因组全长感染性cDNA克隆为探寻病毒基因组结构和功能、高致病性蓝耳病发病机理、以及进一步研制针对后者的基因工程疫苗奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆猪蓝耳病回归试验发病机理

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马动脉炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

2007年中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会

根据马动脉炎病毒(EAV)Bueyrus株全基因组序列，设计并合成EAV特异引物，进而应用RT-PCR技术分6段扩增了EAV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片断PE124、PE631、PE1854、PE5191、PE61107、PE97Q分别克隆到载体PCR BluntⅡ-TOPO中，... 详细信息

根据马动脉炎病毒(EAV)Bueyrus株全基因组序列，设计并合成EAV特异引物，进而应用RT-PCR技术分6段扩增了EAV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片断PE124、PE631、PE1854、PE5191、PE61107、PE97Q分别克隆到载体PCR BluntⅡ-TOPO中，建立了EAV初级cDNA克隆。在扩增5’末端时，引入NotⅠ酶切位点和T3启动子序列;在基因组3’末段：PolyA尾引入XhoⅠ酶切位点，后者供cDNA模板的线性化之用。将扩增片断在PCR BluntⅡ-TOPO中依次连接，最后亚克隆到质粒pBluescript Ⅱ KS(+)中，获得了EAV全长基因组cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明：该毒株基因组全长为12704个核苷酸，与EAV Bucyrus分离株的同源性为99.1％;全长基因组中有104个核苷酸发生突变，相应地导致编码区内34个氨基酸的改变。本试验构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获取具有感染性的EAV分子克隆并研究动脉炎病毒基因组结构和功能奠定了基础。

关键词：马动脉炎病毒感染性克隆基因组序列

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0612株全长感染性克隆的构建

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猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0612株全长感染性克隆的构建

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：吕健袁世山中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室

近年来,在全国范围广泛流行并且引起巨大经济损失的"猪无名高热"的主要病源之一为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。为了便于对PRRSV进行反向遗传操作,本研究根据PRRSV基因组序列设计特异性引物,分五段扩增,将得到的片段克隆到... 详细信息

近年来,在全国范围广泛流行并且引起巨大经济损失的"猪无名高热"的主要病源之一为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。为了便于对PRRSV进行反向遗传操作,本研究根据PRRSV基因组序列设计特异性引物,分五段扩增,将得到的片段克隆到pBlueScript II SK(+)载体中,并且利用相关的重叠区酶切位点将其构建成为全长克隆。在扩增5'端时,运用5'RACE获得了基因组5'最末端序列,在亚克隆入pBlueScript IISK(+)并且在5'端上游引入T7启动子序列。选取一个克隆在3'端ORF6下游引入Mlu I位点,以期作为感染性分子克隆的筛选标志。最终获得了含有PRRSV JX0612株基因组全长cDNA的重组质粒pJX0612和含有分子标志Mlu I的基因组全长cDNA克隆pJX0612-M。转染MARC-145细胞后得到拯救病毒,而且分子标志稳定存在。本研究中构建的基因组全长感染性cDNA克隆为探寻病毒基因组结构和功能奠定了基础。

关键词：感染性克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒 PRRSV JX0612 细胞转染全长克隆基因组序列反向遗传操作无名高热

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马动脉炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：韦祖樟袁世山中国农业科学院上海兽医研究所/中国动物卫生与流行病学中心上海分中心动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室

本研究旨在建立马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)的反向遗传操作系统。根据 GeneBank 相关 EAV 基因序列,设计合成特异引物,应用 RT-PCR 技术, 扩增了 EAV Bucyrus 株6段首尾重叠的全基因组 cDNA 片断。将扩增的各个 cDNA 重

关键词：马动脉炎病毒酶切位点基因组

猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合感染性克隆的构建和应用

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猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合感染性克隆的构建和应用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会

作者：李祥健张建武吕健余丹丹姚火春袁世山中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室

高致病性猪蓝耳病近年来在我国广泛流行,目前尚无高效疫苗用于该病的防制。本研究以PRRSV弱毒感染性克隆-pAPRRS作为主要骨架,将高致病性猪蓝耳病病毒江西分离株(JX143)的主要结构蛋白基因(ORF4-7)以及3'UTR区域替换入pAPPRS相应编... 详细信息

高致病性猪蓝耳病近年来在我国广泛流行,目前尚无高效疫苗用于该病的防制。本研究以PRRSV弱毒感染性克隆-pAPRRS作为主要骨架,将高致病性猪蓝耳病病毒江西分离株(JX143)的主要结构蛋白基因(ORF4-7)以及3'UTR区域替换入pAPPRS相应编码区域,构建了pSX12(ORF4-7-3'UTR)、p5NX12(ORF5-7-3'UTR)以及p56N12 (ORF5-6)三个PRRSV全长嵌合克隆。经DNA转染Marc-145细胞后拯救出嵌合病毒,并对拯救病毒进行了病毒生物学特性的分析;选取拯救病毒v56N12(ORF5-6)和vSX12(ORF4-7-3UTR)免疫29日龄猪进行免疫原性试验,结果表明,以v56N12免疫后抗体水平相对较低,故免疫原性相对较差;而vSX12病毒免疫后14d血清ELISA抗体达到阳性值(IDEXX ELISA值s/p≥0.4),免疫后28d中和抗体效价从原来的1:5以下达到1:15以上,说明vSX12具有良好的免疫原性并可进行免疫监测;免疫后28d以强毒Jx143株攻毒,结果vSX12免疫组未见发病,而未免疫攻毒对照组全部发病并有1头死亡,vSX12免疫猪攻毒后病毒血症持续6d后消失,而对照组攻毒后至少持续13d,说明vSX12可对高致病性猪蓝耳病提供有效的免疫保护。本研究构建的三个嵌合病毒为开发同时抗经典和变异株PRRSV感染的二价疫苗,以及探寻高致病性猪蓝耳病病毒的毒力因子奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征高致病性猪蓝耳病感染性克隆嵌合病毒候选疫苗

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马动脉炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：韦祖樟袁世山中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室

根据马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)Bucyrus株全基因组序列,设计并合成EAV特异引物,进而应用RT-PCR技术分6段扩增了EAV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片断PE124、PE631、PE1854、PE5191、PE61107、PE97Q分别克隆到载体PCR BluntII-TOPO中,建立了初级cDNA克隆。在扩增5'末端时,引入NotI酶切位点和T3启动子序列;在3'末段PolyA尾引入XhoI酶切位点,后者用于cDNA模板线性化。将扩增片断在PCR BluntII-TOPO中依次连接,最后亚克隆到质粒pBluescript II KS(+)中,获得了EAV全长cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明:该毒株基因组全长为12704个核苷酸,与EAV Bucyrus分离株的同源性为99.1%,全长基因组中有104个核苷酸发生突变,相应的导致编码区内34个氨基酸改变。本试验构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获取具有感染性的EAV分子克隆并研究动脉炎病毒基因组结构和功能奠定了基础。

关键词：基因组 RNA 马动脉炎病毒动脉炎病毒属

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒3’末端非翻译区病毒复制过程调控作用的研究

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猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒3’末端非翻译区病毒复制过程调控作...

第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：孙志王金勇张建武秦爱健袁世山中国农业科学院上海兽医研究所/中国动物卫生与流行病学中心上海分中心动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室扬州大学兽医学院

以北美株 PRRSV 感染性克隆 pCBC2为平台进行反向遗传操作,将3’UTR 中的一级结构进行了系列缺失或插入突变,并改变二级结构中的一个保守的茎环结构,构建全长 PRRSV 突变体克隆,解析3’UTR 突变对病毒感染性的影响,旨在

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 PRRSV 非翻译区病毒复制