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中国兽医科学 2018年第4期48卷 443-449页

作者：王莉杰张少华毛立梁盼红王力王立群骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

为检测兔豆状囊尾蚴（Cysticercus pisiformis）感染，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增豆状囊尾蚴serpin基因，并对其开放阅读框（ORF）及编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。构建pET-30a（＋）-Cpserpin重组表达载体，并在大... 详细信息

为检测兔豆状囊尾蚴（Cysticercus pisiformis）感染，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增豆状囊尾蚴serpin基因，并对其开放阅读框（ORF）及编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。构建pET-30a（＋）-Cpserpin重组表达载体，并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。以纯化的重组蛋白（rCpserpin）为包被抗原．优化反应条件，建立检测兔豆状囊尾蚴病血清抗体的间接ELISA方法。结果表明，Cpserpin基因的完整ORF长为l149bp，含有serpin家族保守基序（DEEGAE）、serpin标签序列（FKVDHPFIFFI）以及serpin特有的反应中心环结构域（RCL）；rCpserpin主要以包涵体形式表达，且能被家兔豆状囊尾蚴阳性血清所识别。所建立的间接ELISA的最佳反应条件包括：rCpserpin包被质量浓度为2μg／mL，待检血清和酶标二抗的稀释度分别为1：100和1：2500，包被液和封闭液分别为pH9．6碳酸盐缓冲液和10g/L牛血清白蛋白。利用上述条件检测60份家兔豆状囊尾蚴阳性血清和108份阴性血清，证实该方法的临界值为0．368，敏感性和特异性分别为96．7％和93．5％。结果表明，基于Cpserpin重组蛋白的间接ELISA方法可用于家兔豆状囊尾蚴病的血清学诊断。

关键词：豆状囊尾蚴 Cpserpin 原核表达间接ELISA

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新疆边境地区蜱源巴贝斯虫的分子流行病学研究

新疆边境地区蜱源巴贝斯虫的分子流行病学研究

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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第一届青年科学家学术论坛

作者：许肖枫曲志强谭阳春倪军吴泽功刘文阁林汉亮马力克·艾则孜罗毅马站陈泽任巧云罗金罗建勋殷宏刘光远中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室新疆维吾尔自治区动物卫生监督所

[目的]调查新疆边境地区巴贝斯虫在蜱虫中的感染情况及其分布。[方法]2018-2019年的4月-5月,采用人工布旗法对新疆地区18个县(市)的游离蜱和寄生于家畜体表的蜱虫进行采集并鉴定。对采集的蜱虫提取基因组,利用巴贝斯虫特异引物对提取的... 详细信息

[目的]调查新疆边境地区巴贝斯虫在蜱虫中的感染情况及其分布。[方法]2018-2019年的4月-5月,采用人工布旗法对新疆地区18个县(市)的游离蜱和寄生于家畜体表的蜱虫进行采集并鉴定。对采集的蜱虫提取基因组,利用巴贝斯虫特异引物对提取的基因组进行PCR扩增及测序分析,用MEGA 6.0软件构建分子系统进化树。[结果]共采集蜱虫2279只,经鉴定分析,采集的蜱种包括森林革蜱,胫距革蜱,边缘革蜱,草原革蜱,银盾革蜱,小亚璃眼蜱,亚洲璃眼蜱,麻点璃眼蜱,血红扇头蜱,长角血蜱,刻点血蜱,4属的11个种。扩增得到了包括莫氏巴贝斯(Babesia motasi)、驽巴贝斯虫(Babesia caballi)、粗糙巴贝斯(Babesia crassa)、马巴贝斯虫(Babesia equi)4种已知巴贝斯虫和4株未定种。对其阳性率进行统计结果表明,不同地区的蜱虫阳性率为3.25%～79.17%,平均阳性率为19.85%。[结论]本研究首次利用巢式PCR对我国蜱源巴贝斯虫病的流行状况进行大范围的调查,为制定巴贝斯虫病防控策略提供了可靠的分子流行病学信息。

关键词：蜱巴贝斯虫阳性率系统进化分析

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蜱虫microRNA研究进展

蜱虫microRNA研究进展

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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第一届青年科学家学术论坛

作者：谭阳春刘文阁倪军许肖枫吴泽功仇晓飞林汉亮马力克·艾则孜罗毅马站罗金任巧云殷宏罗建勋刘光远中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室/农业部草食动物疫病重点开放实验室新疆维吾尔自治区动物卫生监督所

蜱可以传播多种人畜共患病,对养殖业和人类健康构成巨大威胁,因此对于蜱的防控和研究很有必要。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码单链RNA分子,在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA可能在蜱各种发育... 详细信息

蜱可以传播多种人畜共患病,对养殖业和人类健康构成巨大威胁,因此对于蜱的防控和研究很有必要。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码单链RNA分子,在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA可能在蜱各种发育过程中发挥着重要作用,Barrero R A等在对微小牛蜱miRNA的研究中发现和鉴定了51种进化保守的miRNA;Zhou JL等发现在长角血蜱中miR-1,miR-375,miR-184,miR-263a,miR-739和bantam可能参与长角血蜱吸血过程;袁小松等分析发现亚洲璃眼蜱miR-10在不同发育阶段和各组织器官的表达具有选择性;对rmi-miR-5316b和rmi-miR-5331的研究表明,这两种miRNA可能在卵发育阶段发挥着重要作用;研究rmi-miR-3931和rmi-miR-5308发现,这两种miRNA参与调控幼蜱的生长发育;郝嘉伟等发现miR-275通过调控Vg-2基因参与长角血蜱的卵巢发育和血液消化过程;rmi-let-7a被发现对维持雌蜱正常的繁殖和产卵有着一定作用。目前对蜱miRNA的研究还甚少,对于蜱中microRNA所参与的生物过程缺乏实验性的功能验证。本文综述了miRNA在蜱体内的研究概况及其生物学功能的研究进展,以期为从后转录水平了解蜱的各种发育过程、先天性免疫机制和蜱传病的抑制或治疗提供参考。

关键词：蜱虫 miRNA 靶基因功能研究

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蜱虫相关功能基因的研究进展

蜱虫相关功能基因的研究进展

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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第一届青年科学家学术论坛

作者：仇晓飞罗金刘文阁许肖枫倪军吴泽功谭阳春任巧云殷宏罗建勋刘光远中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学

蜱虫作为一种营吸血性皮外寄生虫,不仅可以通过叮咬造成动物的机械损伤,而且可传播多种病原,对人类公共卫生健康和家畜养殖业造成了严重危害。因此,研究蜱源性功能基因,对于蜱虫种群控制以及蜱传疾病的防控有着重要的意义。目前,蜱源性... 详细信息

蜱虫作为一种营吸血性皮外寄生虫,不仅可以通过叮咬造成动物的机械损伤,而且可传播多种病原,对人类公共卫生健康和家畜养殖业造成了严重危害。因此,研究蜱源性功能基因,对于蜱虫种群控制以及蜱传疾病的防控有着重要的意义。目前,蜱源性基因主要研究包括信号通路相关基因,譬如G蛋白配体受体、Arrestin-domain protein、Na/K-ATPase、GTPase活化蛋白、KSR错误表达抑制剂等。该方向的研究为蜱虫基本生理功能的行使提供了理论依据,为生命科学的基础研究奠定了基础。其次在血液消化方面也做了大量的研究,譬如对半胱氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、subolesin、HL05等基因功能的研究为蜱虫血液消化机理的研究奠定了基础,为后期蜱虫能量代谢机制研究提供了依据。生殖发育相关基因功能的研究一直以来是广大科研工作者研究蜱虫减虫率的重要手段。在该方面,热休克蛋白、Bm86、核糖体蛋白L24、蛋白激酶A、蛸胺受体、卵泡抑素、丙氨酸乙醛酸转氨酶、二硫异构酶、卵黄蛋白等都是人们关注的重点。这之中Bm86的研究最为成功,基于该基因疫苗的应用对蜱的防控起到了积极的作用,但因为其并非是一种光谱疫苗,而逐渐淡出人们的视线。其他发育相关基因虽然没有形成产品,但是研究的进展是可喜的,都为蜱虫的防控措施的制定提供了重要参考。另外在蜱虫的免疫防御方面人们也做出了积极的研究,这其中包括溶酶体酸性磷酸酶、cyclophilin 40等基因。以上研究不仅为蜱虫防控做出了重要的贡献,特别是对蜱传疾病防控措施的制定,以及相关制剂的研究奠定了良好的理论基础。为人类相关疾病的防控和媒介疾病的认识产生了积极的影响。

关键词：蜱防控基因功能研究进展

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猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白的原核表达、纯化和鉴定

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医学动物防制 2018年第7期34卷 671-675页

作者：江嘉欣王钊哲许瑞吴思敏李嘉静蔡爱群林矫矫洪炀陆珂李浩陈兆国石耀军朱传刚中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室国家防治动物血吸虫病专业实验室上海200241 韶关学院英东生命科学学院

目的对猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)Cap蛋白的主要B细胞抗原表位进行分析,构建Cap表达多表位的原核表达系统,并对表达的目的蛋白进行分析,为猪圆环病毒诊断试剂开发奠定基础。方法设计并合成PCV2Cap基因,与PET-28a(+)载体连接后... 详细信息

目的对猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)Cap蛋白的主要B细胞抗原表位进行分析,构建Cap表达多表位的原核表达系统,并对表达的目的蛋白进行分析,为猪圆环病毒诊断试剂开发奠定基础。方法设计并合成PCV2Cap基因,与PET-28a(+)载体连接后并转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组质粒PET-28(a)-Cap,对重组质粒进行诱导表达获得重组蛋白,通过His亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果重组质粒在大肠杆菌中成功表达,蛋白质分子量约为17.4 k Da,与预期相符;Western blot结果显示,重组蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清发生特异性结合。结论PCV2 Cap蛋白的表达纯化为圆环病毒血清抗体诊断方法的建立,进而为养殖场有效监控猪圆环病毒的免疫保护情况奠定基础。

关键词：猪圆环病毒 Cap蛋白表达纯化

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柔嫩艾美耳球虫两种表面抗原基因的原核表达与鉴定

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动物医学进展 2017年第7期38卷 17-22页

作者：陈会亚费陈忠杨帆帆王霄旸薛飞群中国农业科学院上海兽医研究所/中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室/农业部动物寄生虫病学重点开放实验室上海200241

为进一步研究柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白,应用RT-PCR从柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子总RNA扩增表面抗原基因SAG19(Q70CD0)和SAGfm(U6L233),与pGEM-T easy载体连接,扩增目的片段后分别双酶切扩增产物与pET-28a(+),连接转化至BL21后,诱导表... 详细信息

为进一步研究柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白,应用RT-PCR从柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子总RNA扩增表面抗原基因SAG19(Q70CD0)和SAGfm(U6L233),与pGEM-T easy载体连接,扩增目的片段后分别双酶切扩增产物与pET-28a(+),连接转化至BL21后,诱导表达,分别获得两种重组蛋白。SDSPAGE结果表明,两种重组蛋白的分子质量均为32ku,为包涵体蛋白形式。分别以感染柔嫩艾美耳球虫的鸡血清和重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的多克隆抗体作为一抗,经Western blot分析,结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。通过对这两种表面抗原基因的研究,为基因工程疫苗的研究提供一定的理论依据。

关键词：柔嫩艾美耳球虫表面抗原原核表达

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刚地弓形虫表面抗原1、2 B细胞表位基因的融合表达和鉴定

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2017年第6期35卷 575-579页

作者：王钊哲许瑞洪炀林矫矫陆珂李浩陈兆国石耀军吴思敏江嘉欣李嘉静朱传刚中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫学重点开放实验室国家防治动物血吸虫病专业实验室上海200241 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

目的构建刚地弓形虫(以下简称弓形虫)表面抗原(SAG)1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形虫表... 详细信息

目的构建刚地弓形虫(以下简称弓形虫)表面抗原(SAG)1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因,将目的基因与p ET-28a(+)表达质粒连接,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中,挑取完整单个菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中,菌液进行PCR扩增、双酶切和测序鉴定;菌液振荡培养至吸光度(A450值)为0.6~0.8时,加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,得到带有His标签的融合蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE))电泳,对蛋白的可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,将带有His标签的纯化重组蛋白进行蛋白质印迹(Western blotting)分析和ELISA分析免疫反应性。结果构建的p ET28a(+)-SAG重组质粒,菌液经PCR、双酶切鉴定结果显示,在909 bp处出现特异性目的条带,与预期相符,经测序表明重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE鉴定结果显示,重组蛋白rSAG相对分子质量(Mr)约50 000,为可溶性表达,与预期结果相符。Western blotting分析结果显示,重组蛋白可以与弓形虫感染小鼠阳性血清1∶100发生特异性结合。ELISA检测结果显示,重组蛋白稀释度为1∶1,阳性血清稀释度为1∶50时,阳性反应最明显,A450值为1.037 9。不同稀释倍数的重组蛋白r SAG与不同浓度的小鼠弓形虫阳性血清均可发生反应,并能很好的区分阴性和阳性血清。结论构建了弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因的原核表达系统,重组蛋白rSAG为可溶性表达,并具有较好的免疫反应性。

关键词：刚地弓形虫抗原表位重组序列免疫反应性

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猪瘟病毒表面抗原E2基因的克隆与原核表达

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中国动物传染病学报 2017年第5期25卷 32-36页

作者：吴思敏王钊哲许瑞林矫矫洪炀陈兆国陆珂李浩石耀军江嘉欣李嘉静朱传刚唐亚兰中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫学重点开放实验室国家防治动物血吸虫病专业实验室上海200241 韶关学院英东生命科学学院韶关512000

为获得可用于诊断的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白重组抗原,对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与p ET-28a(+)载体连接后,转化至宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAG... 详细信息

为获得可用于诊断的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白重组抗原,对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与p ET-28a(+)载体连接后,转化至宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性,His亲和层析柱纯化蛋白并进行抗原性检测。重构后的猪瘟病毒E2基因多抗原表位基因大小约500 bp,PCR、双酶切鉴定结果显示与预期相符;重组蛋白为可溶性表达,大小约23 k Da;Western blot结果显示,重组蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性,可作为诊断抗原用于猪瘟病毒感染动物的血清抗体检测。

关键词：猪瘟病毒 E2基因原核表达蛋白纯化

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猪带绦虫Ddi1-like蛋白的真核表达及其抗血清的制备

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中国兽医科学 2017年第5期47卷 582-586页

作者：何伟殷静岳生赟刘仲藜王帅才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

为了对DNA损伤诱导蛋白1(Ddi1-like)基因功能进行研究,本研究参考GeneDB中猪带绦虫基因组注释信息,通过设计5′和3′端特异性引物,利用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得全长cDNA,并在毕赤酵母GS115中进行诱导表达;将纯化后的Ddi1-like重组... 详细信息

为了对DNA损伤诱导蛋白1(Ddi1-like)基因功能进行研究,本研究参考GeneDB中猪带绦虫基因组注释信息,通过设计5′和3′端特异性引物,利用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得全长cDNA,并在毕赤酵母GS115中进行诱导表达;将纯化后的Ddi1-like重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗血清。结果,成功利用RACE获得Ddi1-like基因的全长cDNA序列;在真核表达系统中,绦虫上的Ddi1-like重组蛋白获得表达;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得重组蛋白即为Ddi1-like蛋白;免疫后获得抗血清,其效价达到1∶12 800。上述结果为后续研究Ddi1-like蛋白的酶切活性研究提供了基础。

关键词：绦虫 Ddi1-like蛋白真核表达蛋白酶

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弓形虫胶体金免疫层析试纸条的研制

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中国动物传染病学报 2017年第5期25卷 68-72页

作者：王钊哲许瑞洪炀林矫矫陆珂李浩陈兆国唐亚兰吴思敏江嘉欣李嘉静朱传刚中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫学重点开放实验室国家防治动物血吸虫病专业实验室上海200241 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

为了研制一种可用于检测弓形虫的快速诊断胶体金免疫层析试纸条,本研究对弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)SAG1和SAG2的基因片段进行重构合成,与PET-28a(+)载体连接后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His亲和层析柱对融合蛋白... 详细信息

为了研制一种可用于检测弓形虫的快速诊断胶体金免疫层析试纸条,本研究对弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)SAG1和SAG2的基因片段进行重构合成,与PET-28a(+)载体连接后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,获得SAG重组表位抗原,Western blot对重组蛋白免疫原性进行分析。用r SAG重组蛋白及r SPG分别划线,作为检测线和质控线,制作胶体金免疫层析试纸条,利用小鼠弓形虫阳性血清及小鼠阴性血清检验胶体金免疫层析试纸条检查效果。本研究成功表达纯化了SAG抗原表位的重组蛋白,且该重组蛋白具有较好的免疫原性。以此多抗原表位的重组蛋白作为检查抗原研制了胶体金免疫层析试纸条,能够快速检测弓形虫的阳性血清,为基层弓形虫病的快速诊断奠定了基础。

关键词：胶体金免疫层析试纸条重组蛋白弓形虫

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