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中国兽医科学 2025年

作者：张慧艳李坤孙梦阳邢向川付元芳李平花李冬卢曾军曹轶梅中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

为建立口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型、Asia 1型通用结构蛋白抗体检测方法，本研究用FMDV各血清型间高度保守的结构蛋白VP2氨基端短肽为抗原，经过条件优化，建立了可检测牛血清中FMDV不同血清型结构蛋白抗体的间接ELISA方法，并分析了该方... 详细信息

为建立口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型、Asia 1型通用结构蛋白抗体检测方法，本研究用FMDV各血清型间高度保守的结构蛋白VP2氨基端短肽为抗原，经过条件优化，建立了可检测牛血清中FMDV不同血清型结构蛋白抗体的间接ELISA方法，并分析了该方法的敏感性、特异性、重复性以及与液相阻断ELISA(LPB-ELISA)的符合性。结果显示，该短肽最佳包被浓度为2 μg/mL，最适封闭液为1% BSA+5%蔗糖，血清最佳稀释度为1∶4，酶标二抗稀释比例为1∶5 000。以约登指数最大作为临界值，测定其敏感性为87.5%，特异性为93%，与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的阳性血清均未出现交叉反应，且批间与批内变异系数均≤10%。与LPB-ELISA的符合率为92.59%。该方法耗时短、操作简洁，可检测牛血清中FMDV不同血清型结构蛋白抗体，为FMDV感染的诊断和群体免疫状况的评估提供了一种通用方法。

关键词：口蹄疫病毒结构蛋白VP2 通用型间接ELISA

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过表达JMJD6基因的293T细胞系的构建及对水疱性口炎病毒增殖效率的评价

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中国兽医科学 2024年第5期54卷 569-576页

作者：黄梦瑶杨帆杨洋邵文华王家丽吕岳芹赵晓义陈治彤曹伟军张伟郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

为提高水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)在细胞中的增殖效率,本研究利用慢病毒包装系统构建Jumonji C结构域蛋白6(Jumonji domain-containing protein 6,JMJD6)过表达的HEK-293T/JMJD6细胞系,分析VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系与HEK-293T细胞中的复制差异。首先以JMJD6基因为目标,构建重组质粒pLV-puro-3×Flag-JMJD6,并与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装。将包装好的慢病毒感染HEK-293T细胞并通过嘌呤霉素筛选获得过表达JMJD6基因的阳性细胞。利用Western-blot、间接免疫荧光试验、流式细胞术和蚀斑试验检测VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系中的复制能力。结果显示,在HEK-293T/JMJD6细胞系中,VSV的复制能力显著增强。实时荧光定量检测VSV感染的HEK-293T/JMJD6细胞系和野生型HEK-293T细胞中干扰素下游基因的表达,结果显示HEK-293T/JMJD6细胞系抑制VSV诱导的Ⅰ型干扰素下游基因的产生。总之,本研究构建的HEK-293T/JMJD6细胞系能显著促进VSV的增殖并抑制Ⅰ型干扰素信号通路,为VSV疫苗候选细胞株的筛选奠定了基础。

关键词： JMJD6 水疱性口炎病毒慢病毒包装过表达细胞系干扰素

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猪CD40L的可溶性表达及其生物学活性检测

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中国兽医科学 2025年第3期55卷 389-395页

作者：贺艳艳郭慧琛孙世琪穆素雨敬晓棋榆林学院生命科学学院陕西榆林719000 中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为探讨可溶性猪CD40L(第113—261位氨基酸)对猪外周血单核细胞(PBMC)的活化作用,将构建好的含猪CD40L基因的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化的重组CD40L蛋白偶联FITC后与PBMC进行原位杂交,同时使用荧光显微镜和流式细胞仪分析研究CD... 详细信息

为探讨可溶性猪CD40L(第113—261位氨基酸)对猪外周血单核细胞(PBMC)的活化作用,将构建好的含猪CD40L基因的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化的重组CD40L蛋白偶联FITC后与PBMC进行原位杂交,同时使用荧光显微镜和流式细胞仪分析研究CD40L蛋白刺激B细胞的生物学活性。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,表达的重组CD40L蛋白大小约14 kDa,确定最佳表达条件为16℃、D_(600 nm)值为1.1、0.5 mmol/L IPTG诱导12 h;流式细胞仪分析表明,重组CD40L蛋白能与PBMC表面的CD40蛋白分子结合,重组CD40L蛋白可以明显活化B细胞(P<0.001)。结论:CD40L具有促进B细胞活化的生物学活性,CD40L能促进免疫细胞反应,具有免疫调节作用。本研究为CD40L在重要家畜物种和人类疾病动物模型中的作用奠定了基础。

关键词：猪CD40L 原核表达生物学活性

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西藏地区藏羊隐孢子虫的分子流行病学调查

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中国兽医科学 2025年第4期55卷 507-511页

作者：孔皓月张月玥马平平牟文杰邹扬郭亚琼王帅张少华华南农业大学兽医学院广东广州510640 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

为了探究西藏高海拔地区藏羊隐孢子虫感染的流行情况,本研究从西藏自治区日喀则市岗巴县的集约化养殖场收集了藏羊粪便样品共420份,使用巢式PCR方法对隐孢子虫SSU rRNA基因进行扩增;利用gp60基因对隐孢子虫阳性样本进行亚型鉴定。结果显... 详细信息

为了探究西藏高海拔地区藏羊隐孢子虫感染的流行情况,本研究从西藏自治区日喀则市岗巴县的集约化养殖场收集了藏羊粪便样品共420份,使用巢式PCR方法对隐孢子虫SSU rRNA基因进行扩增;利用gp60基因对隐孢子虫阳性样本进行亚型鉴定。结果显示,所检地区藏羊隐孢子虫的总感染率为9.0%(38/420)。SSU rRNA基因分析显示,藏羊感染的隐孢子虫虫种为肖氏隐孢子虫和泛在隐孢子虫。差异分析表明,隐孢子虫感染率在不同年龄和性别间表现出统计学上的显著差异(P<0.05)。gp60基因分析显示,22份肖氏隐孢子虫样品成功扩增18份,存在4个亚型家族,分别是ⅩⅩⅢh(n=8)、ⅩⅩⅢl(n=6)、ⅩⅩⅢe(n=2)和ⅩⅩⅢd(n=2);而所有泛在隐孢子虫样本均被鉴定为Ⅻa型(n=16)。由于Ⅻa亚型能够感染人类及多种动物,这表明该地区藏羊携带的隐孢子虫可能存在人兽共患的潜在风险,该地区应采取有效的防控措施。

关键词：藏羊隐孢子虫基因亚型人兽共患

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一株牛口咽液分离口蹄疫病毒的特性分析

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微生物学报 2025年

作者：蔡梦婷袁红王利豪杨竞纯王涛包慧芳杨宇轩孙普李坤黄书伦郭海洋李平花卢曾军何继军白兴文中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室 WOAH/国家口蹄疫参考实验室华中农业大学动物医学院甘肃省病原生物学基础学科研究中心

【目的】旨在分离、鉴定一株牛源口咽液中的口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus， FMDV)，分析其抗原蛋白氨基酸变异及增殖特性。【方法】采用RT-PCR及基因测序技术鉴定FMDV阳性牛口咽液样本，通过细胞接种从阳性样本中分离病毒... 详细信息

【目的】旨在分离、鉴定一株牛源口咽液中的口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus， FMDV)，分析其抗原蛋白氨基酸变异及增殖特性。【方法】采用RT-PCR及基因测序技术鉴定FMDV阳性牛口咽液样本，通过细胞接种从阳性样本中分离病毒，并利用间接免疫荧光法对分离病毒进行鉴定。通过PCR分段扩增及序列测定获得分离FMDV的全基因组，进一步通过序列比对分析分离FMDV的抗原蛋白氨基酸变异，通过蚀斑形成试验和一步生长曲线评价分离FMDV的增殖特性。【结果】成功从牛口咽液中分离、鉴定出一株FMDV，命名为O/FMDV/OP/2022/B。该病毒属于O型Ind2001谱系，其抗原蛋白VP1、VP2和VP3的氨基酸残基发生变异。在BHK-21细胞上，O/FMDV/OP/2022/B毒株形成的蚀斑显著小于疫苗毒株O/FMDV/HN/93的蚀斑，且其一步生长曲线明显低于O/FMDV/HN/93。【结论】本研究从牛口咽液中分离出一株FMDV，发现其抗原蛋白氨基酸发生变异，且增殖能力显著低于疫苗毒株O/FMDV/HN/93。该研究有助于从病毒学角度深入理解FMDV持续感染牛口咽组织的机制，并为口蹄疫的防控提供参考依据。

关键词：口蹄疫病毒持续性感染氨基酸突变病毒增殖

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稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

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畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1159-1169页

作者：荆扬王玉淼李洋常辉马志倩李志伟肖书奇中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 塔里木大学动物科学与技术学院阿拉尔843300

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该... 详细信息

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒过表达细胞系 ORF6基因 M蛋白 MARC-145细胞

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猪流行性腹泻疫苗研究进展

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中国畜牧兽医 2024年第11期51卷 5004-5013页

作者：张洋欧云文马春霞任绍科潘琴邓书明翟佳佳杨山山开江县动物疫病预防控制中心达州636250 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 达州中医药职业学院达州635000

近年来,随着中国养猪事业的高速发展,猪流行性腹泻(PED)已成为猪群的重要传染病,PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的,以腹泻、呕吐、脱水为特征的急性病毒性传染病。PED主要通过呼吸道和消化道传播,哺乳仔猪最易感,死亡率可高达100%,... 详细信息

近年来,随着中国养猪事业的高速发展,猪流行性腹泻(PED)已成为猪群的重要传染病,PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的,以腹泻、呕吐、脱水为特征的急性病毒性传染病。PED主要通过呼吸道和消化道传播,哺乳仔猪最易感,死亡率可高达100%,给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV是单股正链RNA病毒,具有4个主要结构蛋白、16个非结构蛋白和1个辅助蛋白ORF3。自2010年以来,该病毒变异株传播范围不断扩大,流行趋势日益复杂,经典毒株(CV777)相关疫苗已无法提供有效保护。因此,开发更加安全、有效的疫苗已迫在眉睫。灭活疫苗安全性高,但需多次接种且保护效果不佳;弱毒疫苗免疫原性良好,但存在毒力返祖风险;亚单位疫苗不携带病毒其他蛋白结构,使用安全、价格便宜,但其免疫原性差;重组病毒活载体疫苗可诱导产生特异性免疫反应,但安全性不足;重组细菌活载体疫苗能口服刺激机体黏膜免疫,并且载体具有佐剂作用,但其免疫效率不高;转基因植物疫苗安全稳定,但表达量低且研发周期长;核酸疫苗研发周期短、灵活性高,但安全性不高、外源基因易与宿主基因重组。随着相关研究的深入,各类疫苗研究已取得重要研究成果。笔者就PED灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、重组病毒活载体疫苗、重组细菌活载体疫苗、转基因植物疫苗、核酸疫苗进行综述,以期为PED的防治和新型疫苗研发提供参考。

关键词：猪流行性腹泻猪流行性腹泻病毒(PEDV) 流行特点疫苗

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HIF-1α在病原体感染中的作用研究进展

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畜牧兽医学报 2024年第6期55卷 2357-2367页

作者：张正洋宋银娟储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046 农业农村部动物病原生物学重点实验室农业农村部反刍动物重大疫病防控重点实验室(西部) 兰州730046

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞应对缺氧反应的中枢调节因子,稳定的HIF-1α具有多种功能,参与血管生成、代谢调节、细胞自噬及细胞凋亡等多种生物学过程。HIF-1α的稳定性受到多种信号的调节,包括氧气水平、病原体感染以及代谢中间体... 详细信息

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞应对缺氧反应的中枢调节因子,稳定的HIF-1α具有多种功能,参与血管生成、代谢调节、细胞自噬及细胞凋亡等多种生物学过程。HIF-1α的稳定性受到多种信号的调节,包括氧气水平、病原体感染以及代谢中间体等。近年来,越来越多的研究表明,HIF-1α在感染性疾病中起着重要作用。因此,本文就HIF-1α稳定性的调节机制及其在病毒、细菌等病原体感染和相关疾病发生发展中的作用进行讨论和总结,旨在为进一步解析HIF-1α在防御多种病原体感染中的作用和其作为靶向治疗的潜在靶点等相关研究提供参考。

关键词： HIF-1α 稳定性病原体感染作用机制

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EphA2基因敲除和过表达BHK-21细胞系的构建及其对口蹄疫病毒复制的影响

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中国兽医科学 2025年

作者：李熙忠范许许朱兆宇裴丹诗王一卓何路任青峰郑海学李伟伟郜原甘肃农业大学生命科学与技术学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室河南农业大学动物医学院

构建促红细胞生成素肝细胞受体A2（Erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2）基因敲除和过表达的BHK-21细胞系，探究其对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建EphA2基因敲除的BHK-21细胞系，利用慢病毒感染构建EphA2基因过表达的BHK-21细胞系。经嘌呤霉素筛选及单克隆挑取，成功获得稳定细胞系。随后，以野生型BHK-21细胞为对照，将FMDV分别感染上述细胞系，采用实时荧光定量 PCR、蛋白质免疫印迹等方法检测病毒核酸和蛋白水平。结果表明，EphA2基因敲除后，FMDV在BHK-21细胞中的复制显著受到抑制，病毒核酸和蛋白表达量明显降低；而EphA2基因过表达时，FMDV复制增强。本研究揭示了EphA2基因在FMDV复制过程中具有重要作用，为深入理解FMDV的感染机制及防控策略提供了理论依据。

关键词： CRISPR/Cas9 EphA2 口蹄疫病毒

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O型口蹄疫病毒3D突变毒株的构建及其生物学特性分析

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中国兽医科学 2025年第6期 719-724页

作者：朱兆宇范许许裴丹诗王一卓何路李熙忠任青峰郑海学李伟伟郜原甘肃农业大学生命科学技术学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室河南农业大学动物医学院

本研究利用反向遗传技术构建O型口蹄疫病毒（FMDV）3D蛋白突变毒株r FMDV-M403A，并分析了其生物学特征。结果表明，重组病毒在传代过程中氨基酸能稳定突变；病毒滴度显示，突变毒株生长速度较野生毒株有所降低，重组病毒毒力显著低于... 详细信息

本研究利用反向遗传技术构建O型口蹄疫病毒（FMDV）3D蛋白突变毒株r FMDV-M403A，并分析了其生物学特征。结果表明，重组病毒在传代过程中氨基酸能稳定突变；病毒滴度显示，突变毒株生长速度较野生毒株有所降低，重组病毒毒力显著低于野生毒株；乳鼠感染试验结果显示，突变毒株会使乳鼠存活率提高，肝中病毒载量和组织病变显著降低。该研究对口蹄疫病毒致病机理的认识及制定防控措施具有重要意义，同时，也为后续开发口蹄疫基因工程疫苗奠定了坚实的理论基础。

关键词： O型口蹄疫病毒反向遗传操作 3D蛋白突变生物学特性

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