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中国兽医杂志 2023年第5期59卷 1-7页

作者：张坤鹏杨发誉张丹阳郑海学朱紫祥中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室口蹄疫国家参考实验室甘肃兰州730046 兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730000

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种以高热和出血为特征的急性传染病,世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物疾病,我国也将其列为一类动物疫病。由于ASFV的环境稳定性以及能借助中间宿主软蜱和不易感宿主野猪进行传... 详细信息

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种以高热和出血为特征的急性传染病,世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物疾病,我国也将其列为一类动物疫病。由于ASFV的环境稳定性以及能借助中间宿主软蜱和不易感宿主野猪进行传播的能力,使其防控具有一定难度。另外,由于缺乏对ASFV庞大的基因组和对应的编码蛋白的了解,其免疫学和疫苗学相关研究也具有一定的挑战。在缺乏具有稳定保护效力的安全疫苗情况下,ASF防控仍以扑杀和生物安全措施为主,这使得在应对ASF的过程中消耗了大量的人力、物力和财力。虽然我国2018年首次暴发ASF疫情后在较短的时间内即控制住了疫情进一步传播,但目前ASF依旧威胁着包括我国在内的全世界养猪行业的发展。本文对ASF的疾病特征、病原学特征和疫苗研发,以及ASFV所引起的天然免疫反应、适应性免疫反应等方面的研究进展进行概述,以期为ASFV的免疫学相关研究和ASF的疫苗研发提供一定的启示。

关键词：非洲猪瘟病毒天然免疫炎症反应细胞凋亡细胞自噬非洲猪瘟疫苗

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一株多谱系重组NADC34-like-PRRSV的分离鉴定及其基因组特征分析

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病毒学报 2024年第5期40卷 1062-1075页

作者：张兴民张婧虞凌雪王健王方洲李娇阳李国秀李冬马雪青白兴文龚真莉卢曾军曾巧英孙普中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046 甘肃农业大学兰州730070 中国农业科学研究院上海兽医研究所上海200441

本研究2021年9月从甘肃规模化猪场采集疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的仔猪肺脏组织和血清,经(Open Reading Frame 5,ORF5)基因分型RT-PCR扩增测序鉴定,阳性样品进行病... 详细信息

本研究2021年9月从甘肃规模化猪场采集疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的仔猪肺脏组织和血清,经(Open Reading Frame 5,ORF5)基因分型RT-PCR扩增测序鉴定,阳性样品进行病毒分离。经间接免疫荧光试验和感染细胞病理电镜切片鉴定分离毒株,采用RTPCR方法对PRRSV分离株进行全基因组序列扩增,利用生物学软件分析其遗传演化特征,同时也对该场107份猪血清样本检测。研究结果显示,ORF5基因分型RT-PCR扩增测序结果表明,该猪场为NADC34-like-PRRSV感染;间接免疫荧光显示能够与PRRSV N蛋白单克隆抗体(SR30)反应,电镜观察到感染细胞中直径大小为50-80 nm病毒粒子,其基因组全长大小为15078 bp,将分离株命名为PRRSV GSJT/9/2021株。分离株与不同谱系代表株VR-2332、JXA1、HuN4、NADC30和NADC34的全长核苷酸序列同源性分别为85.2%、86.4%、86.5%、88.7%和85.9%;ORF5基因序列与代表毒株ORF5基因序列及编码氨基酸序列的相似性分别为83.7%~94.9%与84.6%~95.5%,其中与IA/2014/NADC34毒株的核苷酸和氨基酸同源性较高分别为94.9%和95.5%;基于GSJT/9/2021全基因组和ORF5基因分别构建进化树对分离株进行分型,结果显示GSJT/9/2021的全基因组与类NADC30毒株亲缘关系较近,属于同一个分支,而ORF5基因遗传进化树表明GSJT/9/2021毒株与类NADC34毒株亲缘关系最近;ORF5氨基酸序列分析结果显示,ORF5的变异程度最大,GP5蛋白中4个糖基化位点与国内流行的NADC34毒株相比额外增加一个糖基化位点第57位,在诱骗表位37-45 aa中第38、39位出现独特突变(H38Q,L39F);Nsp2氨基酸序列分析结果显示,Nsp2蛋白存在“111+1+19a”(323-433位、483位、504-522位)缺失模式,与NADC30毒株缺失模式一致;重组分析表明GSJT/9/2021株由NADC30-like PRRSV、HUN4与IA/2014/NADC34之间发生重组变异而来,重组位点分别位于Nsp4、Nsp9、GP2a和M的氨基端。107份血清的PRRSV N蛋白抗体阳性率达98.2%。综上,PRRSV GSJT/9/2021株是1株多谱系重组变异NADC34-like-PRRSV,通过深入解析重组毒株的遗传变异和生长特性,为甘肃地区防控PRRS具有重要的指导意义。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒多谱系重组毒株分离鉴定基因组特征细胞嗜性

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牛支原体抗体胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2023年第7期53卷 831-836页

作者：田可昕高鹏程陈胜利郑福英许健付强史慧君储岳峰新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

本试验以牛支原体(Mycoplasma bovis)MilA基因重组蛋白P300为检测靶标抗原包被检测线(T线),山羊抗家兔IgG包被质控线(C线),金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金溶液,以建立牛支原体抗体胶体金免疫层析试纸条检测方法。通过检测牛布氏杆... 详细信息

本试验以牛支原体(Mycoplasma bovis)MilA基因重组蛋白P300为检测靶标抗原包被检测线(T线),山羊抗家兔IgG包被质控线(C线),金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金溶液,以建立牛支原体抗体胶体金免疫层析试纸条检测方法。通过检测牛布氏杆菌、丝状支原体、牛病毒性腹泻病毒、牛巴氏杆菌和口蹄疫病毒5种病原的阳性血清以及实验室保存的牛支原体阳性血清和临床血清,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果显示,该方法检测牛布氏杆菌、丝状支原体、牛病毒性腹泻病毒、牛巴氏杆菌和口蹄疫病毒5种病原的阳性血清均为阴性;对已知牛支原体阳性血清的检测最高稀释梯度可达1∶2 048;对临床血清检测,与ELISA的检测结果符合率为94.04%。结果表明,牛支原体抗体胶体金免疫层析试纸条特异性好、敏感性高。可用于牛支原体感染的快速诊断,尤其适用于现场检测。

关键词：牛支原体 P300重组蛋白胶体金免疫层析

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ASFV毒力蛋白MGF360-9L降解宿主蛋白MATR3促进病毒复制的研究

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中国兽医科学 2023年第5期53卷 537-544页

作者：郝雨杨金柯杨博杨行史喜绢张大俊赵登率闫文倩陈玲玲陈国辉别鑫恬郑海学刘湘涛鲍恩东张克山南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染所引起的一种高度致死的传染性疾病。ASFV多基因家族编码的MGF360-9L已被证实是ASFV重要的毒力蛋白,是ASFV逃逸宿主天然免疫应答的关键之一。... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染所引起的一种高度致死的传染性疾病。ASFV多基因家族编码的MGF360-9L已被证实是ASFV重要的毒力蛋白,是ASFV逃逸宿主天然免疫应答的关键之一。本实验室的前期研究基础表明,宿主细胞核基质蛋白3(Matrin 3,MATR3)可能是MGF360-9L的相互作用蛋白之一,但这种相互作用未经验证。此外,MGF360-9L和MATR3之间是否存在相互调控,对于病毒复制或宿主免疫有何意义尚不可知。因此,本研究首先通过免疫共沉淀(Co-immunprecipitation,Co-IP)验证MGF360-9L与MATR3的相互作用;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western-blot)分析ASFV野生型病毒株(ASFV-WT)、ASFV MGF360-9L缺失毒株(ASFV-ΔMGF360-9L)感染或MGF360-9L过表达对MATR3表达的影响;通过RT-qPCR、Western-blot以及分析ASFV荧光重组毒株复制产生的荧光强度去探究外源过表达MATR3对不同ASFV毒株体外复制的影响。结果,在PK-15细胞中,MGF360-9L与MATR3特异性相互作用并剂量依赖性降解MATR3;在MA-104细胞中,外源过表达MATR3显著抑制ASFV-ΔMGF360-9L体外复制,但不影响ASFV-WT体外复制。本研究证实ASFV毒力蛋白MGF360-9L通过降解宿主限制因子MATR3促进ASFV复制,拓展了MGF60-9L的宿主免疫逃逸途径,为进一步探究ASFV的致病机制奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 MGF360-9L MATR3 蛋白相互作用宿主免疫逃逸

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非洲猪瘟病毒I215L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2024年第11期54卷 1473-1481页

作者：杜煜孙茂文曹丽艳孔祥雨李想通张宇王琦郑海学兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 中国农业科学院都市农业研究所四川成都610213

本研究聚焦于非洲猪瘟病毒(ASFV)I215L基因编码的泛素结合酶(UBCv1),对其进行原核系统表达并制备了多克隆抗体。以ASFV CN/GS/2018株为模板,成功扩增I215L基因并插入原核表达载体,形成重组质粒pET28a-I215L。经大量诱导表达后,利用切胶... 详细信息

本研究聚焦于非洲猪瘟病毒(ASFV)I215L基因编码的泛素结合酶(UBCv1),对其进行原核系统表达并制备了多克隆抗体。以ASFV CN/GS/2018株为模板,成功扩增I215L基因并插入原核表达载体,形成重组质粒pET28a-I215L。经大量诱导表达后,利用切胶方法成功纯化出重组蛋白。将提纯后的I215L蛋白与佐剂混合对动物进行多次免疫,获得鼠/兔抗I215L蛋白的多克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,鼠抗I215L多抗效价达到1∶64000以上,兔抗I215L多抗效价达到1∶512000;间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)结果显示,该多抗具有特异性识别ASFV感染后I215L蛋白的能力,并且显示出良好的效果。本研究在体外表达并纯化了ASFV I215L蛋白,成功获得鼠/兔抗I215L蛋白的多克隆抗体,这为后期ASFV I215L蛋白的结构解析、功能研究及病毒相关致病机制的探索奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 I215L蛋白原核表达多克隆抗体

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5'UTR缺失重组塞内卡病毒的构建与生物学特性分析

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农业生物技术学报 2025年

作者：张岩杨帆曹伟军杜晓莉郑海学包世俊甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院/动物疫病防控全国重点实验室/国家口蹄疫参考实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心西北民族大学生命科学与工程学院

塞内卡病毒A (Senecavirus A,SVA)是属于塞内卡病毒属的小RNA病毒。感染该病毒后可引发原发性猪(Sus scrofa)的水疱病，在临床上很难与口蹄疫、猪水泡病和水疱性口炎区分。本研究成功从临床中分离鉴定了1株SVA变异毒株，发现其5'UT... 详细信息

塞内卡病毒A (Senecavirus A,SVA)是属于塞内卡病毒属的小RNA病毒。感染该病毒后可引发原发性猪(Sus scrofa)的水疱病，在临床上很难与口蹄疫、猪水泡病和水疱性口炎区分。本研究成功从临床中分离鉴定了1株SVA变异毒株，发现其5'UTR存在13个核苷酸(nucleotide,nt)缺失。为了研究该缺失对SVA生物学特性的影响，本研究利用反向遗传技术，以SVA CH/FJ/2017毒株的全长cDNA感染性克隆为基础，对其基因组5'UTR序列进行定向缺失，将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救出1株5'UTR基因缺失的塞内卡病毒rSVA-5UTRM，利用间接免疫荧光试验和Western blot对重组毒株进行鉴定；并将重组病毒在BHK-21细胞上连续传代，进行遗传稳定性分析；然后通过蚀斑试验和病毒生长曲线比较重组病毒与亲本毒株在BHK-21细胞上的增殖特性。结果显示，重组病毒能够与SVA抗体及SVA VP2抗体发生特异性反应，表明重组毒株拯救成功；遗传稳定性分析结果显示，5'UTR基因缺失的重组病毒传代至20代，缺失基因仍稳定存在，表明重组毒株具有良好的遗传稳定性；生物学特性分析结果表明，重组毒株与亲本毒株SVA CH/FJ/2017在BHK-21细胞上的复制特性相近，且具有较高的病毒滴度，说明5'UTR中13 nt的核苷酸缺失并不影响病毒在BHK-21细胞上的复制。本研究成功拯救出5'UTR缺失的重组SVA毒株，研究了缺失区段的功能，为阐明SVA非编码功能提供了新的科学数据。

关键词：塞内卡病毒 5'UTR 缺失重组病毒生物学特性

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云南省食蟹猴与猕猴毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的分子流行病学研究

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中国兽医科学 2024年第2期54卷 233-239页

作者：马平平邹扬牟文杰张月玥刘仲藜张龙陈利仙王帅刘国华湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 昆明亚灵生物科技有限公司云南昆明650500

旨在探究云南省笼养食蟹猴与猕猴毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的感染及基因型分布情况。从云南省昆明市和玉溪市元江县采集到笼养食蟹猴461份和笼养猕猴72份的新鲜粪便样本,采用巢式PCR方法扩增粪便DNA样本,基于毕氏肠微孢子虫核糖体内转... 详细信息

旨在探究云南省笼养食蟹猴与猕猴毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的感染及基因型分布情况。从云南省昆明市和玉溪市元江县采集到笼养食蟹猴461份和笼养猕猴72份的新鲜粪便样本,采用巢式PCR方法扩增粪便DNA样本,基于毕氏肠微孢子虫核糖体内转录间隔区和环孢子虫SSU rRNA基因,分别对2种肠道原虫感染进行检测。结果显示:毕氏肠微孢子虫的总感染率为1.5%(8/533)。通过测序分析鉴定出3种已知毕氏肠微孢子虫基因型:D、TypeⅣ和CM1。此外,环孢子虫的总感染率为0.9%(5/533),序列比对仅发现1种环孢子虫基因型。各年龄组、性别、物种和地区间2种原虫的感染率差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明,云南地区笼养食蟹猴与猕猴存在较低的毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的感染率,该地区存在一定的毕氏肠微孢子虫和环孢子虫传播的潜在风险。本研究结果为我国云南地区笼养食蟹猴与猕猴感染毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的防控提供了基础参考资料。

关键词：云南省食蟹猴猕猴毕氏肠微孢子虫环孢子虫

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口蹄疫病毒热驯化及生物学特性分析

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病毒学报 2023年第6期39卷 1670-1676页

作者：刘仲元张振兴张韵卢渊录孙世琪郭慧琛董虎宋建领中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是一种全球性的、感染偶蹄动物的传染病。病毒衣壳对温度,pH敏感,容易在疫苗生产及储存过程中裂解为免疫原性较低的五聚体,影响疫苗的质量。口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)对热敏感... 详细信息

口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是一种全球性的、感染偶蹄动物的传染病。病毒衣壳对温度,pH敏感,容易在疫苗生产及储存过程中裂解为免疫原性较低的五聚体,影响疫苗的质量。口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)对热敏感的机制研究对于疫苗抗原稳定性意义重大。本文通过循环热应激驯化方式诱导基因突变向耐热性发展,经噬斑纯化获得了驯化毒株M3,M9和M10。通过多序列比对分析发现驯化毒株P1区发生氨基酸突变,一步生长曲线表明驯化毒株氨基酸突变基本不影响病毒的复制,而驯化毒株相比野生型毒株衣壳耐热性有显著提高。驯化毒株M10单一位点突变(A1013T)增强衣壳稳定性,表明A1013T位点对于O型FMDV毒株衣壳耐热性的重要性,但机制仍待后期进一步阐明。该研究将为制备耐热性的FMD疫苗提供了理论依据。

关键词：口蹄疫病毒热筛选热稳定性氨基酸突变

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非洲猪瘟病毒跨细胞膜内化过程研究进展

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中国兽医杂志 2023年第5期59卷 8-11页

作者：杨发誉王一张石磊郑海学朱紫祥动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730000 中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃兰州730000

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪、野猪等引起的急性、烈性、出血性传染病,致死率可达100%。ASFV是一种二十面体具备囊膜结构的DNA病毒,其内化过程具备囊膜病毒的特征。本文从ASFV膜蛋白及其功能的角度,总结了膜蛋白参与... 详细信息

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪、野猪等引起的急性、烈性、出血性传染病,致死率可达100%。ASFV是一种二十面体具备囊膜结构的DNA病毒,其内化过程具备囊膜病毒的特征。本文从ASFV膜蛋白及其功能的角度,总结了膜蛋白参与跨膜和内化的过程,旨在加深对ASFV跨膜和内化的认知,对ASF的防控具有积极作用。

关键词：非洲猪瘟病毒囊膜病毒膜融合跨膜膜蛋白

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呼吸道合胞病毒NS2蛋白单克隆抗体的制备及初步研究

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病毒学报 2024年第2期40卷 302-313页

作者：王亚娟陈娇陈志华茹毅郑海学裴晶晶兰州理工大学生命科学与工程学院兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿下呼吸道感染的RNA病毒,其非结构蛋白(Nonstructural protein 2,NS2)在病毒复制和宿主抗病毒免疫中起到关键作用,但目前尚无商品化NS2单克隆抗体。本研究选取NS2基因,... 详细信息

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿下呼吸道感染的RNA病毒,其非结构蛋白(Nonstructural protein 2,NS2)在病毒复制和宿主抗病毒免疫中起到关键作用,但目前尚无商品化NS2单克隆抗体。本研究选取NS2基因,经密码子优化后构建重组质粒pET-32a-NS2。将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经16℃诱导表达后,对表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定。应用亲和层析技术纯化重组蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,并将该单克隆抗体用于Western blot分析、免疫荧光检测和免疫沉淀反应。结果表明,诱导后的重组蛋白为可溶性表达,并经纯化后得到高纯度的NS2蛋白;纯化的NS2蛋白免疫小鼠后,获得了一株特异性强、反应性好的RSV NS2单克隆抗体4A4 2B2,其亚型为IgG1,且抗体效价可达1∶1024000;使用该单克隆抗体鉴定出RSV NS2蛋白在转染和感染细胞中正常表达,且NS2主要分布在细胞质中,在细胞核周围形成点状聚集体;在免疫沉淀反应中,该单克隆抗体作为捕获抗体能够特异性结合细胞中表达的NS2蛋白,为NS2蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：呼吸道合胞病毒 NS2蛋白原核表达单克隆抗体

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