检索结果-内蒙古大学图书馆

中国人兽共患病学报 2024年第5期40卷 421-429页

作者：陈国辉史喜绢别鑫恬杨行赵思越张大俊赵登率闫文倩陈玲玲赵美玉何路郑海学刘霞张克山甘肃农业大学生命科学技术学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控国家重点实验室兰州730046

目的探究猪源SIRT5对O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus serotype O,FMDV-O)复制的影响及其调控FMDV-O复制的初步机制。方法利用Western Blotting和RT-qPCR检测FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5表达情况;设计合成3对SIRT5特异性siRNA,通过Western Blotting和RT-qPCR检测SIRT5、FMDV-O蛋白水平、转录水平及病毒拷贝数的变化情况;构建SIRT5真核表达质粒转染至PK-15细胞,运用Western Blotting、RT-qPCR实验方法探究过表达SIRT5对FMDV-O复制的影响,同时利用RT-qPCR检测过表达SIRT5对SeV、FMDV-O诱导的I型干扰素刺激基因mRNA表达水平的影响。结果FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5的表达上调;siRNA干扰SIRT5抑制FMDV-O的复制;过表达SIRT5促进FMDV-O复制;过表达SIRT5降低了SeV、FMDV-O诱导的干扰素刺激基因mRNA的表达水平。结论FMDV-O感染刺激宿主SIRT5表达,而猪源SIRT5通过抑制I型干扰素刺激基因的产生进而促进FMDV-O复制。本研究为进一步探究猪源SIRT5促进FMDV-O复制的机制提供参考依据。

关键词：猪源SIRT5 FMDV-O 干扰素刺激基因 PK-15细胞

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激活标志物CD69蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2025年

作者：徐娜张芷盈杜星南于黛辉郑海学陈霞伍国强兰州理工大学生命科学与工程学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室华南农业大学兽医学院

为了评估原核表达的猪源CD69蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值，以pET-32a(+)为原核表达载体，猪源CD69基因为目的基因，构建重组质粒pET-32a-CD69，针对大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达；通过变性、复性等方法成功纯化蛋白... 详细信息

为了评估原核表达的猪源CD69蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值，以pET-32a(+)为原核表达载体，猪源CD69基因为目的基因，构建重组质粒pET-32a-CD69，针对大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达；通过变性、复性等方法成功纯化蛋白后，将纯化的CD69蛋白与佐剂按1∶1的比例混合，多次免疫雄性BALB/c小鼠制备多克隆抗体，并用免疫印迹试验(Western-blot)与酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)进行鉴定。结果表明，重组的CD69以包涵体形式表达，分子质量约为35 kDa；通过ELISA测定鼠源多克隆抗体效价，结果显示效价达到1∶64 000以上；Western-blot结果表明，该多克隆抗体表现出良好的反应性和特异性。激活标志物CD69蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备，为今后我国猪产业的发展与猪相关疾病检测提供了帮助。

关键词： CD69基因原核表达蛋白纯化多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外复制的研究

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中国兽医科学 2023年第11期53卷 1341-1347页

作者：赵登率张大俊史喜绢杨行郑海学刘湘涛张克山中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室、国家非洲猪瘟区域实验室甘肃兰州730046

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)和猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪病毒性传染病,对全球养猪业造成严重危害。随着PRRSV与ASFV的流行,增加了二者混合感染的可能性。前期工作已表明PRRSV在体外可以抑制ASFV复制。然而,ASFV是否影响PRRSV体外复制尚不可知。因此,本研究通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫印迹试验(Western-blot)检测了PRRSV疫苗株JXA1-R和ASFV弱毒株混合感染后PRRSV在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)和猪骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)的复制水平以及CD163的mRNA水平。结果显示,混合感染抑制了PRRSV的复制水平,并降低CD163的mRNA水平。本研究证明ASFV可抑制PRRSV在体外的复制,并抑制CD163的mRNA水平。该结果为PRRSV和ASFV混合感染的防控提供了理论依据。

关键词：非洲猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染抑制

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宿主OAS2蛋白抑制非洲猪瘟病毒体外复制的研究

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中国兽医科学 2024年第5期54卷 577-583页

作者：赵思越史喜绢杨行张大俊赵登率陈国辉陈玲玲闫文倩别鑫恬赵美玉李平郑海学张克山郜原甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为了探究宿主蛋白2′,5′-寡腺苷酸合成酶2(OAS2)与非洲猪瘟病毒(ASFV)复制之间的关系,本研究通过蛋白免疫印迹(Western-blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了ASFV感染对宿主OAS2的调控作用;构建并合成OAS2真核表达质粒以及siRNA干扰... 详细信息

为了探究宿主蛋白2′,5′-寡腺苷酸合成酶2(OAS2)与非洲猪瘟病毒(ASFV)复制之间的关系,本研究通过蛋白免疫印迹(Western-blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了ASFV感染对宿主OAS2的调控作用;构建并合成OAS2真核表达质粒以及siRNA干扰序列,通过RT-qPCR、Western-blot方法探究在MA-104细胞中外源过表达OAS2及在PAMs细胞中下调OAS2表达对ASFV体外复制的影响。结果显示,ASFV感染PAMs细胞后,OAS2的蛋白水平和转录水平皆上调,并且外源过表达OAS2显著抑制了ASFV的复制,下调OAS2表达促进了ASFV的复制。本研究通过对宿主蛋白OAS2进行过表达和敲低,证实了OAS2可以抑制ASFV体外复制,该结果为进一步研究宿主对ASFV的抗病毒免疫研究提供了理论基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 OAS2 天然免疫抑制

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宿主蛋白VDAC1抑制口蹄疫病毒复制的机制研究

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中国兽医科学 2024年第12期54卷 1563-1568,I0001页

作者：马柯薛巧刘鹏飞朱紫祥李宏斌刘会胜郑海学兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州1730050 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染偶蹄类动物(如猪、牛和羊)而引起的急性、高度传染性疾病。其非结构蛋白3D^(pol)在FMDV复制和致病过程中发挥着重要作用。为探究宿主蛋白与3D^(pol)蛋白的作用机制,本研究... 详细信息

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染偶蹄类动物(如猪、牛和羊)而引起的急性、高度传染性疾病。其非结构蛋白3D^(pol)在FMDV复制和致病过程中发挥着重要作用。为探究宿主蛋白与3D^(pol)蛋白的作用机制,本研究首先利用酵母双杂交和免疫共沉淀试验鉴定出VDAC1与FMDV3D^(pol)相互作用,再运用过表达VDAC1和抑制剂试验发现VDAC1通过自噬途径抑制3D^(pol)蛋白的表达,最后发现下调VDAC1后对FMDV的复制有促进作用,表明VDAC1靶向3D^(pol)蛋白抑制FMDV复制。本研究揭示了宿主蛋白抑制FMDV复制的新机制,本研究为口蹄疫防控提供了新的方向和靶点。

关键词：口蹄疫病毒 3D^(pol) 宿主蛋白VDAC1 自噬

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口蹄疫病毒样颗粒诱导表达型载体的构建及其BHK-21细胞池的筛获

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生物工程学报 2023年第12期39卷 4849-4860页

作者：谭书桢董虎孙世琪郭慧琛中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 云南省畜牧兽医科学院云南热带亚热带动物病毒重点病实验室云南昆明650224

瞬时表达是目前利用哺乳动物细胞表达口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白的主流方法。为实现染色体稳定表达FMDV衣壳蛋白并高效组装出病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究构建了piggy Bac(PB)转座-组成... 详细信息

瞬时表达是目前利用哺乳动物细胞表达口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白的主流方法。为实现染色体稳定表达FMDV衣壳蛋白并高效组装出病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究构建了piggy Bac(PB)转座-组成型表达、PB转座-四环素(tetracycline,Tet)诱导型表达两套质粒。利用荧光蛋白标记技术,验证了质粒的功能。通过抗生素筛选得到了组成型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21细胞池(C-WT、C-L127P)和诱导型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21细胞池(I-WT、I-L127P)。荧光观察和PCR检测证明了绿色荧光蛋白、3C蛋白酶、反向四环素转录激活因子等基因的稳定整合。Western blotting、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验证明了细胞池I-L127P具有更强的衣壳蛋白和VLPs生产能力。本研究首次实现了哺乳动物细胞染色体诱导表达FMDV衣壳蛋白,有助于推动哺乳动物生产FMDV VLPs疫苗的技术工艺,也为构建其他蛋白的哺乳动物细胞诱导型表达系统提供了参考。

关键词：口蹄疫病毒病毒样颗粒质粒构建细胞池诱导表达

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磷酸钙矿化口蹄疫病毒样颗粒工艺优化及免疫原性评价

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生物工程学报 2025年

作者：任丽华郭伟谢茜茜刘瑞鹏孙世琪董虎张韵白满元郭慧琛滕志东中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃农业大学动物医学院宁夏大学生命科学学院

生物矿化作为一种新兴策略，在提升疫苗免疫效果方面展现出巨大潜力。本研究聚焦于磷酸钙（calcium phosphate， CaP）矿化A型口蹄疫（foot-and-mouth disease， FMD）病毒样颗粒（virus-like particles， VLPs）的矿化过程，以期获得... 详细信息

生物矿化作为一种新兴策略，在提升疫苗免疫效果方面展现出巨大潜力。本研究聚焦于磷酸钙（calcium phosphate， CaP）矿化A型口蹄疫（foot-and-mouth disease， FMD）病毒样颗粒（virus-like particles， VLPs）的矿化过程，以期获得具有高矿化率和适用于规模化生产的方案。本研究系统优化了Ca2+、HPO42-、NaCl和VLPs浓度及搅拌速率等关键参数，并对放大后的反应体系进行了稳定性检测，同时开展小鼠免疫试验分析矿化疫苗的免疫原性。结果表明25.5 mmol/L Ca(NO3)2、15 mmol/L Na2HPO4、300 mmol/L NaCl、0.75 mg/mL VLPs、1500 r/min搅拌速率下形成的矿化颗粒具有高矿化率，且颗粒尺寸和形貌较好。将反应体系放大25倍，矿化率和颗粒形貌未受到显著影响。免疫结果显示，VLPs-CaP免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平均高于FMD VLPs免疫组（P＜0.05），而且与细胞免疫应答相关的IgG2a/IgG1比值和γ干扰素水平均显著提升（P＜0.05），表明矿化疫苗能够诱导更强的免疫反应。本研究获得了CaP矿化A型FMD VLPs的稳定反应条件，制备的VLPs-CaP纳米疫苗具有良好的免疫原性，为规模化生产高效VLPs-CaP疫苗提供了理论和技术基础。

关键词：口蹄疫病毒样颗粒磷酸钙矿化反应条件免疫原性

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猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

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中国畜牧兽医 2024年第7期51卷 3056-3066页

作者：欧云文潘琴汪洋代军飞任绍科张洋翟佳佳张杰开江县动物疫病预防控制中心达州636250 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室秦皇岛066004

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段... 详细信息

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

关键词：猪圆环病毒3型(PCV3) Cap蛋白截短表达 ELISA

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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Nup155基因敲除的PK-15细胞系

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中国兽医科学 2025年第5期55卷 569-576页

作者：孙瑜嘉殷娟斌刘瀛李可卿曹轶梅朵红卢曾军赵志荀张强中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心青海大学畜牧兽医科学院

本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株，并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sg RNA，与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装；再使用2μg/m L嘌呤霉素筛选... 详细信息

本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株，并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sg RNA，与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装；再使用2μg/m L嘌呤霉素筛选细胞株；通过RT-qPCR和Western-blot来确认细胞中Nup155基因是否被敲除；最终通过CCK8试验检测Nup155基因敲除对PK-15细胞活性的影响。RT-qPCR及Westernblot结果显示，细胞株Nup155基因的m RNA和蛋白表达水平显著降低；CCK8试验结果显示，部分敲除Nup155基因的PK-15细胞活力下降。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了1株Nup155基因部分敲除的PK-15细胞系，并发现部分敲除Nup155基因会显著影响PK-15细胞活力，为深入研究Nup155基因的功能机制提供了理想的细胞模型。

关键词： PK-15细胞基因敲除 Nup155 慢病毒包装

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真空冷冻干燥提升表达A型FMDV结构蛋白大肠杆菌的稳定性

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中国兽医科学 2025年

作者：郭伟刘瑞鹏张佳甜尉嘉锡郭慧琛孙世琪马全英滕志东王晓强兰州交通大学生物与制药工程学院兰州交通大学化学化工学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

为提升表达A型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白大肠杆菌的稳定性，以大肠杆菌活性为评价指标，在单因素试验基础上采用Box-Behnken响应面法优化冻干保护剂组合。利用Box-Behnken结果进行回归模型拟合，得到最佳冻干保护剂配方为3.192%（质... 详细信息

为提升表达A型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白大肠杆菌的稳定性，以大肠杆菌活性为评价指标，在单因素试验基础上采用Box-Behnken响应面法优化冻干保护剂组合。利用Box-Behnken结果进行回归模型拟合，得到最佳冻干保护剂配方为3.192%（质量分数，下同）山梨醇、3.094%谷氨酸钠、6.924%乳糖、3%脱脂奶粉和5%海藻糖，并对配方进行了验证。为分析真空冷冻干燥菌种的稳定性，将冻干及未冻干的菌种置于25 ℃和37 ℃放置不同时间，重溶后测定大肠杆菌的活性和表达蛋白的水平，结果显示，在25 ℃和37 ℃条件下，冻干样品相比于未冻干样品显示出更好的活性，表明冷冻干燥可以提高表达A型FMDV结构蛋白大肠杆菌的储存时长和稳定性。本研究为提升原核表达系统的稳定性和储存期提供了新方案。

关键词：口蹄疫病毒大肠杆菌真空冷冻干燥 Box-Benhnken响应面法

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