检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2024年第7期54卷 866-872页

作者：赵梦杉吕熙王运航裴辰辰刘艺佳郭慧琛孙世琪杨丰利董虎长江大学动物科学技术学院湖北荆州434025 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 榆林学院生命科学学院陕西榆林719000

为研发猫疱疹病毒1型(FHV-1)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,将FHV-1 g D基因和自组装蛋白I301基因序列融合后克隆到pPink-HC载体中,由毕赤酵母表达重组g D蛋白。随后观察不同pH对蛋白质表达和VLPs组装效果的影响。结果显示,经SDS-PAGE和Western-... 详细信息

为研发猫疱疹病毒1型(FHV-1)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,将FHV-1 g D基因和自组装蛋白I301基因序列融合后克隆到pPink-HC载体中,由毕赤酵母表达重组g D蛋白。随后观察不同pH对蛋白质表达和VLPs组装效果的影响。结果显示,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,发现培养基pH3.0条件下毕赤酵母表达出了完整的重组g D蛋白,而pH6.0条件下表达的蛋白分子质量小于预计大小;另外,组装液pH8.0时VLPs的组装效果优于pH6.0、7.0。结果表明,酸性环境可有效抑制毕赤酵母内蛋白酶对重组g D蛋白的水解作用,重组g D蛋白可在弱碱性环境中利用自组装蛋白I301在体外完成组装,为FHV-1 VLPs疫苗制备奠定了基础。

关键词：猫疱疹病毒1型病毒样颗粒酵母表达系统 g D基因

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羊肠道病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

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中国兽医科学 2025年

作者：马雪青张雨星李平花王松泰魏达礼赵志荀朵红卢曾军孙普中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃农业大学动物医学院兰州市动物卫生监督所青海大学畜牧兽医科学院

为建立一种灵敏、特异、准确的羊肠道病毒（CEV）实时荧光定量RT-PCR检测方法，本研究基于CEV基因序列的保守区设计特异性引物和探针，并制备标准品，通过优化反应体系和反应条件，建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法，同时对其敏... 详细信息

为建立一种灵敏、特异、准确的羊肠道病毒（CEV）实时荧光定量RT-PCR检测方法，本研究基于CEV基因序列的保守区设计特异性引物和探针，并制备标准品，通过优化反应体系和反应条件，建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法，同时对其敏感性、特异性和重复性进行评估，并与常规RT-PCR比较检测临床样品。结果显示，所建方法的标准曲线R2为0.995，拷贝数与Ct值有良好的线性关系；该方法特异性强，与口蹄疫病毒（FMDV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、羊痘病毒（SPV）、羊口疮病毒（ORFV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）无交叉反应；敏感性最低检测限为23 copies/μL；组内与组间变异系数均小于2.5%，重复性好。使用本方法检测了598份羊的临床样品，阳性检出率（83/598）高于常规RT-PCR（30/598）。上述结果表明，本研究建立了一种灵敏、特异的CEV TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法，并建议采用羊的粪便或肛拭子即可进行CEV的流调工作，这为CEV的诊断、流行病学调查提供了重要的技术支持。

关键词：羊肠道病毒 TaqMan实时荧光定量RT-PCR 诊断

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蓝舌病毒血清1型VP5蛋白的截短表达及其单克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2025年

作者：刘学春户鑫兵宋昱庆孟凡华田占成关贵全殷宏独军政中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学

参考GenBank中蓝舌病毒血清1型（BTV-1）标准参考株VP5蛋白氨基酸序列，缺失N端1～79位氨基酸，按照大肠杆菌偏嗜性进行基因密码子优化后，合成编码BTV-1 VP5截短蛋白的基因VP5Δ79aa，将其克隆到表达载体pET-28a-sumo上，构建了重组质... 详细信息

参考GenBank中蓝舌病毒血清1型（BTV-1）标准参考株VP5蛋白氨基酸序列，缺失N端1～79位氨基酸，按照大肠杆菌偏嗜性进行基因密码子优化后，合成编码BTV-1 VP5截短蛋白的基因VP5Δ79aa，将其克隆到表达载体pET-28a-sumo上，构建了重组质粒pET-sumo-VP5Δ79aa。将该重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，用0.5 mmol/L IPTG分别在37 ℃和16 ℃条件下进行诱导表达和可溶性分析，经SDS-PAGE检测，重组VP5Δ79aa蛋白主要以包涵体形式表达。用Ni-NTA亲和层析法纯化重组VP5Δ79aa蛋白，得到与预期大小相符的单一目的条带。纯化后的重组VP5Δ79aa蛋白经不同浓度梯度的尿素透析复性后，将其免疫雌性BALB/c小鼠（6～8周龄），取免疫后脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经间接ELISA、免疫荧光和Western-blot分析，筛选得到2株反应性和特异性良好的单克隆抗体4A10和5H11，其不仅能与重组VP5Δ79aa截短蛋白以及重组全长VP5蛋白反应，而且能特异识别BTV-1感染细胞中的天然VP5蛋白，这为深入研究BTV VP5蛋白的生物学功能及其抗原表位鉴定奠定了基础。

关键词：蓝舌病毒 VP5蛋白截短表达单克隆抗体

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靶向FMDV基因组3B和3Cpro基因CRISPR/Cas13d转基因细胞系的构建及应用

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中国兽医科学 2025年

作者：郑东东齐晓兰杨彪晏子龙郑海学冯涛徐红伟西北民族大学生命科学与工程学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

基因组编辑工具在抗病研究中具有巨大潜力。本研究旨在探究CRISPR/Cas13d系统在体外抗口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）研究的可行性。首先，靶向FMDV非结构蛋白3B和3Cpro的基因序列设计了2条向导RNA （guide RNA， ... 详细信息

基因组编辑工具在抗病研究中具有巨大潜力。本研究旨在探究CRISPR/Cas13d系统在体外抗口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）研究的可行性。首先，靶向FMDV非结构蛋白3B和3Cpro的基因序列设计了2条向导RNA （guide RNA， gRNA），并将其构建到Cas13d表达载体中；通过脂质体将表达载体转染到BHK21细胞中，再通过嘌呤霉素筛选，获得了转基因细胞系。随后，利用RT-qPCR、Western-blot以及TCID50等试验检测FMDV在转基因细胞系中的复制情况。结果显示，CRISPR/Cas13d系统显著抑制了FMDV在BHK21细胞中的复制。提示，CRISPR/Cas13d系统在口蹄疫病毒抗病研究中发挥重要作用，同时为创制具有抗病特性的家畜新品种提供了重要的理论基础，为畜禽疫病的防控提供了新的途径。

关键词：口蹄疫病毒 CRISPR/Cas13d 家畜抗病转基因

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一株羊肠道病毒的分离鉴定及其基因组特征分析

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中国兽医科学 2024年第4期54卷 511-518页

作者：张雨星马雪青李平花魏达礼李冬张婧王卉袁红王萌白兴文刘在新卢曾军曾巧英王桂荣孙普甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州1730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

本研究利用宏基因组测序技术,从死亡湖羊淋巴组织中检测出小反刍兽疫病毒与羊肠道病毒混合感染,为了分离羊肠道病毒,采取病毒总RNA转染BHK21细胞方法,连续传代后,通过致细胞病变、测序、TCID_(50)测定和病毒一步生长曲线、电镜观察等鉴... 详细信息

本研究利用宏基因组测序技术,从死亡湖羊淋巴组织中检测出小反刍兽疫病毒与羊肠道病毒混合感染,为了分离羊肠道病毒,采取病毒总RNA转染BHK21细胞方法,连续传代后,通过致细胞病变、测序、TCID_(50)测定和病毒一步生长曲线、电镜观察等鉴定分离出病毒,并与参考毒株比对分析分离病毒的基因特征。结果显示,转染病毒总RNA的BHK21细胞传至第2代就出现了明显的致细胞病变效应,测序证明培养物中仅含羊肠道病毒,其基因组全长为7446 nt,其中5′UTR长821 nt,3′UTR长109 nt,ORF长6516 nt,与参考毒株比较可划分为G种肠道病毒,病毒粒子大小为20~30 nm,第6代细胞毒感染8 h时TCID_(50)值最高,为10^(-4.2)/0.1 mL,命名为JSNT/1/2022株。本研究首次利用组织病料RNA转染细胞的方法成功分离出1株羊肠道病毒,说明羊肠道病毒核酸具有感染性,为羊肠道病毒的分离鉴定探索了一种更为可靠的方法,也为羊肠道病毒相关基础与应用研究奠定了病原学基础。

关键词：羊肠道病毒分离鉴定 RNA感染性基因组

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甘肃某羊场绵羊流产衣原体的分离鉴定

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中国兽医科学 2024年第12期54卷 1601-1608页

作者：李赟辉李韦张淮瑜金有顺赵鹏善王彦俨王一晗肖乾李兆才许信刚周继章西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730000 甘肃元生农牧科技有限公司甘肃金昌737000

为确定导致甘肃省某绵羊养殖场妊娠母羊流产的病原,笔者采集流产母羊的血清和胎水样本,采用ELISA、荧光PCR以及16S rRNA和ompA基因扩增测序,进行流产相关病原检测,并对阳性样本进行病原分离鉴定。结果显示,20份血清流产衣原体抗体均为阳... 详细信息

为确定导致甘肃省某绵羊养殖场妊娠母羊流产的病原,笔者采集流产母羊的血清和胎水样本,采用ELISA、荧光PCR以及16S rRNA和ompA基因扩增测序,进行流产相关病原检测,并对阳性样本进行病原分离鉴定。结果显示,20份血清流产衣原体抗体均为阳性,而布鲁氏菌抗体和贝氏柯克斯体抗体均为阴性。5份胎水中仅检出流产衣原体特异性核酸。流产衣原体阳性胎水接种SPF鸡胚,成功分离到1株衣原体,经16S rRNA和ompA基因测序、包涵体观察和免疫荧光染色,鉴定分离株为流产衣原体。鸡胚半数致死量试验显示,0.4 mL流产衣原体分离菌株的ELD_(50)为10^(-7.55),表明分离株对鸡胚的毒力较强。结果表明,引起该绵羊养殖场妊娠绵羊流产的病原为流产衣原体,并成功分离到流产衣原体流行菌株,为绵羊流产衣原体病的流行病学和防制提供了参考。

关键词：流产衣原体分离鉴定 PCR 免疫荧光染色绵羊

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非洲马瘟病毒VP7蛋白的可溶性表达及抗体阻断ELISA方法的初步建立

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中国兽医科学 2024年第10期54卷 1318-1326页

作者：徐婧户鑫兵宋昱庆张鸿歌田占成关贵全罗建勋殷宏魏衍全独军政甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

为了实现非洲马瘟病毒(AHSV)VP7蛋白的可溶性表达,制备其特异性单克隆抗体,建立AHSV VP7阻断ELISA抗体检测方法,通过对编码AHSV VP7蛋白的基因序列进行突变设计与密码子优化,以大肠杆菌表达系统表达可溶性VP7蛋白并进行纯化,免疫BALB/c... 详细信息

为了实现非洲马瘟病毒(AHSV)VP7蛋白的可溶性表达,制备其特异性单克隆抗体,建立AHSV VP7阻断ELISA抗体检测方法,通过对编码AHSV VP7蛋白的基因序列进行突变设计与密码子优化,以大肠杆菌表达系统表达可溶性VP7蛋白并进行纯化,免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得VP7蛋白单克隆抗体。通过细胞免疫荧光和Western-blot鉴定单克隆抗体的特异性,并建立AHSV VP7阻断ELISA方法。结果显示,利用大肠杆菌表达系统成功表达了可溶性重组AHSV VP7蛋白,将纯化的VP7蛋白免疫小鼠筛选制备了2株稳定分泌VP7蛋白单克隆抗体的细胞株,分别为3F7和7H8。经鉴定证明这2株VP7单克隆抗体不仅能与大肠杆菌重组表达的VP7蛋白反应,而且也与BHK-21细胞表达的具有天然构象的重组VP7蛋白反应,具有良好的特异性和反应性。以重组VP7蛋白和单克隆抗体7H8分别为包被抗原和阻断抗体建立了AHSV VP7阻断ELISA方法,检测了277份马血清样本,结果与商品化进口AHSV抗体检测试剂盒测定结果一致。本研究在大肠杆菌表达系统中实现了AHSV VP7蛋白的可溶性表达,制备获得了VP7特异性单克隆抗体,并建立了AHSV VP7阻断ELISA方法,为我国有效防控非洲马瘟的传入提供了技术储备。

关键词：非洲马瘟病毒 VP7蛋白可溶性表达单克隆抗体阻断ELISA

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NRF2激动剂衣康酸4-辛酯对猪伪狂犬病病毒的抑制作用研究

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中国兽医科学 2024年第11期54卷 1421-1429页

作者：方春艳杨发誉朱紫祥郑海学包世俊魏衍全张石磊甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730070 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

为筛选高效抑制猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的小分子抑制剂,首先利用流式细胞分析技术结合小分子药物库筛选出对PRV具有高效抑制活性的小分子药物,并利用CCK-8法检测其对PK15细胞活力的影响。其次,利用Western-blot检测PRV ... 详细信息

为筛选高效抑制猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的小分子抑制剂,首先利用流式细胞分析技术结合小分子药物库筛选出对PRV具有高效抑制活性的小分子药物,并利用CCK-8法检测其对PK15细胞活力的影响。其次,利用Western-blot检测PRV g B蛋白、TCID_(50)测定PRV滴度等方法检测小分子药物对PRV的抑制作用。最后,利用Western-blot检测小分子药物抑制PRV生命周期的具体阶段。结果显示,流式细胞术分析筛选出的对PRV抑制最明显的3种小分子药物中,Cyanosafracin B、Staurosporine对PK15细胞有很强的细胞毒性,而衣康酸4-辛酯(4-OI)在300μmol/L的浓度下对PK15细胞基本无毒性。4-OI对不同MOI的PRV均表现出较强的抑制作用,表现为PRV子代病毒滴度的降低、PRV g B蛋白的表达水平下降,并呈剂量依赖性。4-OI及其靶蛋白Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(NRF2)能够抑制PRV在细胞内的复制,而不影响PRV吸附PK15细胞及其内化过程。本研究表明4-OI是一种潜在的高效抑制PRV的小分子药物,为PRV防控提供了新的参考依据。

关键词：药物筛选衣康酸4-辛酯(4-OI) 猪伪狂犬病病毒(PRV) 抗病毒作用

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功能化铁蛋白纳米颗粒疫苗的研究进展

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农业生物技术学报 2024年第4期32卷 903-910页

作者：张荣魏彦明茹毅甘肃农业大学动物医学院中农威特生物科技股份有限公司甘肃省病原生物学基础学科研究中心/中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院/动物疫病防控全国重点实验室

在众多的纳米载体中，蛋白质纳米颗粒由于其生物相容性及设计的灵活性，是疫苗纳米载体生物技术中的研究热点。与分离的蛋白质亚基相比，蛋白质纳米颗粒疫苗更容易被抗原提呈的树突状细胞吸收。铁蛋白是一种普遍存在的铁储存和解毒蛋白... 详细信息

在众多的纳米载体中，蛋白质纳米颗粒由于其生物相容性及设计的灵活性，是疫苗纳米载体生物技术中的研究热点。与分离的蛋白质亚基相比，蛋白质纳米颗粒疫苗更容易被抗原提呈的树突状细胞吸收。铁蛋白是一种普遍存在的铁储存和解毒蛋白，可以保护细胞免受铁诱导的氧化损伤，化学和热稳定性良好，具有可逆的组装、拆卸及展示抗原的能力。铁蛋白不仅是实用的纳米反应器和纳米载体，也是有效的疫苗开发平台。本文综述了铁蛋白的结构和功能特性、自组装、新的生物工程策略、铁蛋白纳米颗粒的生产、纯化和功能化，并讨论了铁蛋白在疫苗开发领域的应用进展及前景。本文为纳米生物技术在疫苗研制中的应用提供理论支持。

关键词：铁蛋白纳米颗粒基因融合自组装疫苗

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稳定表达猪BRD4-BD1/2蛋白的猪肺泡巨噬细胞传代细胞系的构建及其用于ASFV增殖的效果观察

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畜牧兽医学报 2024年第10期55卷 4646-4659页

作者：吴梦丽孙华林杨吉飞赵亚茹关贵全殷宏牛庆丽中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046 扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD1/2结构域,利用慢病毒表达系统成功构建稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系,分析ASFV在3D4/21-BRD4-BD1/2细胞系与WT细胞系之间的复制差异。首先,以家猪基因BRD4-BD1/2为靶标,构建了含有3x Flag标签的重组质粒pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2,并将其与质粒pMD2.G和pSPAX2共同转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装,获得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染3D4/21细胞后通过嘌呤霉素药物筛选,成功获得了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染3D4/21-BRD4-BD1/2细胞后CP204L和B602L基因的转录水平以及相应蛋白表达水平,并通过HAD50测定评价ASFV的复制能力。研究结果表明:成功构建了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。与3D4/21-WT细胞系相比,BRD4-BD1/2稳定表达细胞系能够显著促进ASFV复制。本研究提供了深入研究BRD4蛋白在ASFV复制中功能的生物材料,并为ASFV疫苗候选株的开发提供了理论基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 BRD4 BD1/2 3D4/21细胞稳定表达细胞系

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