检索结果-内蒙古大学图书馆

基于山羊支原体山羊肺炎亚种HP65蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

中国兽医科学 2025年

作者：张一帆陈胜利金祥瑞金珊宇梁晋嘉兰仕梅李章程储岳峰史耀旭郝华芳中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心中农威特生物科技股份有限公司

为建立山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）的抗体检测方法，筛选Mccp潜在诊断靶标——假定膜蛋白HP65，以纯化的rHP65蛋白为包被抗原，通过优化条件，建立间接ELISA抗体检测方法，并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估和临床应用。... 详细信息

为建立山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）的抗体检测方法，筛选Mccp潜在诊断靶标——假定膜蛋白HP65，以纯化的rHP65蛋白为包被抗原，通过优化条件，建立间接ELISA抗体检测方法，并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估和临床应用。结果显示，rHP65蛋白大小约72 kDa；Western-blot证实该蛋白与Mccp阳性血清具有良好的反应性。建立的ELISA方法的最佳条件为：抗原包被量为180 ng/孔，37℃孵育2 h后4℃过夜包被，10 g/L BSA 37℃封闭90 min，血清1∶200稀释后37℃孵育1 h，酶标二抗1∶10 000稀释后37℃孵育1 h；底物在37℃显色10 min。与绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种、小反刍兽疫病毒和衣原体的阳性血清均无交叉反应，具有良好的特异性，敏感性达1∶10240。批内和批间重复性变异系数均低于10%。应用该方法对Mccp免疫、感染血清和临床血清进行检测，疫苗免疫7 d可检测到血清抗体转阳、人工感染血清7～14 d可检测到血清阳性，187份临床血清中有102份阳性、85份阴性。以上结果表明，基于HP65蛋白建立的ELISA方法可用于山羊传染性胸膜肺炎疫苗免疫抗体检测，为该病临床诊断试剂盒开发奠定了基础。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种山羊传染性胸膜肺炎 HP65蛋白原核表达间接ELISA

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牛种布鲁氏菌ArsR2蛋白的原核表达及磷酸化位点鉴定

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动物医学进展 2024年第9期45卷 39-44页

作者：刘科蒙耿好苏梦茹许健支飞杰储岳峰新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

用原核表达系统表达并纯化牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白,软件分析该蛋白相关信息,质谱鉴定该蛋白修饰位点。以牛种布鲁氏菌S2308株基因组为模板,通过PCR扩增arsR2基因,构建pET-32a-ArsR2重组质粒,经测序正确后,转化至大肠埃希氏菌感受... 详细信息

用原核表达系统表达并纯化牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白,软件分析该蛋白相关信息,质谱鉴定该蛋白修饰位点。以牛种布鲁氏菌S2308株基因组为模板,通过PCR扩增arsR2基因,构建pET-32a-ArsR2重组质粒,经测序正确后,转化至大肠埃希氏菌感受态细胞BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析法进行ArsR2蛋白的纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;对牛种布鲁氏菌ArsR2蛋白的理化性质和磷酸化位点进行预测,通过质谱鉴定ArsR2蛋白的修饰位点。结果显示,成功表达并纯化ArsR2蛋白,ArsR2蛋白无跨膜区,存在磷酸化修饰,质谱鉴定出ArsR2蛋白具有2个磷酸化位点。表明原核表达的牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白存在磷酸化修饰位点,为探究该蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：布鲁氏菌 arsR2基因原核表达蛋白纯化

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RAB20基因敲除PK-15细胞系的构建及其对口蹄疫病毒复制的影响

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中国兽医科学 2025年

作者：蔡建涛张伟陈治彤刘泓屹吕岳芹曹伟军冷非凡杨帆郑海学兰州理工大学生命科学与工程学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RAB20基因敲除的PK-15细胞系，为RAB20蛋白功能研究提供生物材料，同时初步探究RAB20蛋白对口蹄疫病毒（FMDV）增殖的影响。首先，根据RAB20基因序列设计合成2对sgRNA，分别构建于载体质粒pX... 详细信息

本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RAB20基因敲除的PK-15细胞系，为RAB20蛋白功能研究提供生物材料，同时初步探究RAB20蛋白对口蹄疫病毒（FMDV）增殖的影响。首先，根据RAB20基因序列设计合成2对sgRNA，分别构建于载体质粒pX459中，将重组质粒转染PK-15细胞，用嘌呤霉素筛选，并经有限稀释法进行亚克隆。接着，对单克隆细胞测序及Western-blot以鉴定RAB20基因的敲除，并利用CCK-8测定RAB20敲除对细胞活力的影响。然后，用FMDV感染RAB20敲除细胞和野生型细胞，利用Western-blot、实时荧光定量PCR、间接免疫荧光试验和病毒滴度测定等方法比较FMDV在敲除细胞系与野生型细胞中的复制差异。结果显示：成功构建了RAB20基因敲除的PK-15细胞系，且与野生型细胞相比，FMDV在RAB20敲除细胞中的复制水平显著提升，表明RAB20对FMDV的复制具有抑制作用。该结果为进一步研究RAB20功能及其调控病毒复制的机制提供了细胞模型与数据支持。

关键词： CRISPR/Cas9 RAB20基因细胞系口蹄疫病毒

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非洲马瘟病毒VP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其抗体制备

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中国兽医科学 2024年第3期54卷 357-363页

作者：范亚亚王轩莹户鑫兵田占成关贵全罗建勋殷宏郑玉姝独军政河南科技学院动物科技学院河南新乡453003 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

为了确定非洲马瘟病毒(AHSV)VP5蛋白的免疫学特性,通过人工合成非洲马瘟病毒VP5蛋白的S6全长基因序列,经PCR扩增后克隆到转座质粒载体pFastBac HTb上,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑试验筛选出重组杆状病毒质粒Bacmid-AH... 详细信息

为了确定非洲马瘟病毒(AHSV)VP5蛋白的免疫学特性,通过人工合成非洲马瘟病毒VP5蛋白的S6全长基因序列,经PCR扩增后克隆到转座质粒载体pFastBac HTb上,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑试验筛选出重组杆状病毒质粒Bacmid-AHSVS6,转染Sf9昆虫细胞;构建了重组质粒pFastBac-AHSVS6,拯救获得含有AHSV S6基因的重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-blot鉴定表明,在Sf9昆虫细胞中成功表达分子质量大小为60 ku的AHSV VP5重组蛋白。采用组氨酸标签纯化树脂对重组VP5蛋白进行纯化,将其与弗氏佐剂乳化后3次免疫新西兰大白兔收集血清,获得了针对AHSV VP5蛋白的多克隆抗体,并通过Western-blot和间接免疫荧光试验验证了该抗体的特异性。本试验利用杆状病毒表达系统成功表达了AHSV全长VP5重组蛋白,成功制备出特异的VP5蛋白多克隆抗体,这为进一步研究AHSV VP5蛋白的功能及研制亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：非洲马瘟病毒 VP5蛋白杆状病毒表达系统多克隆抗体免疫荧光

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L蛋白第177位氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响

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中国兽医科学 2025年

作者：李静雯曹伟军杨帆朱紫祥张伟郑海学蒋大伟河南农业大学国家动物免疫学国际联合研究中心中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

为探究前导蛋白Lpro氨基酸突变对口蹄疫病毒（FMDV）生物学特性的影响，利用FMDV反向遗传操作技术，构建含有L-V177M定点突变的FMDV全长cDNA克隆，转染IBRS-2细胞进行体内拯救，通过生长曲线、PCR Array检测、146S抗原产能分析等鉴定突... 详细信息

为探究前导蛋白Lpro氨基酸突变对口蹄疫病毒（FMDV）生物学特性的影响，利用FMDV反向遗传操作技术，构建含有L-V177M定点突变的FMDV全长cDNA克隆，转染IBRS-2细胞进行体内拯救，通过生长曲线、PCR Array检测、146S抗原产能分析等鉴定突变氨基酸对FMDV生物学特性的影响。结果表明：定点突变毒rO-L/V177M和亲本毒rWT相比，两者在IBRS-2细胞中的生长曲线复制动态相似，但前者的病毒滴度却显著降低且形成小的蚀斑，抗病毒基因OAS2、NOS2、IFITM1以及促炎基因CCL4、PYCARD、CXCL11、CD80的表达水平也显著上调，两者在悬浮BHK-21细胞上的抗原产量并无显著变化。该研究揭示了该氨基酸位点对FMDV复制和致病性中的关键作用，并且为理解FMDV与宿主免疫系统的相互作用提供了新的视角，为开发减毒活疫苗提供了潜在的候选毒株，不仅深化了对FMDV Lpro蛋白功能的理解，还为口蹄疫疫苗研发和开发靶向抗病毒策略提供了重要的理论支撑。

关键词：口蹄疫病毒 L蛋白生物学特性

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宿主蛋白BST-2抑制非洲猪瘟病毒体外复制的研究

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中国兽医科学 2024年第2期54卷 143-150页

作者：赵美玉杨行史喜绢张大俊赵登率陈玲玲别鑫恬闫文倩陈国辉赵思越李平郑海学栗孟飞张克山甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控国家重点实验室甘肃兰州730000

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高致死率传染病。骨髓基质细胞抗原2(BST-2,也称为Tetherin/HM1.24/CD317)被鉴定为一种抑制包膜病毒释放的新型宿主限制因子,它可以将病... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高致死率传染病。骨髓基质细胞抗原2(BST-2,也称为Tetherin/HM1.24/CD317)被鉴定为一种抑制包膜病毒释放的新型宿主限制因子,它可以将病毒颗粒结合到细胞表面,随后在溶酶体中进行内化和降解,从而抑制病毒复制。因此,它对宿主的抗病毒作用十分重要。本实验室前期研究表明,怀孕猪血清会促进ASFV的复制。ITRAQ分析表明,BST-2蛋白属于下调前十的蛋白之一。为探究宿主蛋白BST-2与ASFV复制之间的关系,本试验通过蛋白免疫印迹(Western-blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了ASFV感染对BST-2表达的影响;构建并合成了BST-2真核表达质粒以及siRNA干扰序列,通过RT-qPCR、Western-blot去探究外源过表达BST-2及敲低BST-2对ASFV体外复制的调控作用。结果显示,外源过表达BST-2显著抑制了ASFV的复制,敲低BST-2促进了ASFV的复制。本研究通过对BST-2进行过表达和敲低,证实了BST-2作为一种宿主抗病毒分子能抑制ASFV的体外复制,为进一步深入研究宿主蛋白抗ASFV功能提供了新的途径,也为ASF的防控提供了新思路。

关键词：非洲猪瘟病毒 BST-2 天然免疫宿主蛋白抑制体外复制

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马源性免疫球蛋白的研究应用进展

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中国兽医科学 2024年第1期54卷 115-123页

作者：周玉娟吴强储岳峰刘子越贾涛中国生物技术股份有限公司北京100024 成都蓉生药业有限责任公司四川成都610093 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

马源性免疫球蛋白是采用特定抗原主动免疫马匹后产生的较高滴度的能够中和这种抗原的抗体(主要成分是IgG),通过胃蛋白酶消化,切掉与种属间免疫原性相关的Fc段,仅纯化出具有中和活性的F(ab’)2片段,发挥特异性免疫作用,用于预防和治疗以... 详细信息

马源性免疫球蛋白是采用特定抗原主动免疫马匹后产生的较高滴度的能够中和这种抗原的抗体(主要成分是IgG),通过胃蛋白酶消化,切掉与种属间免疫原性相关的Fc段,仅纯化出具有中和活性的F(ab’)2片段,发挥特异性免疫作用,用于预防和治疗以传染病为主的许多疾病。本文对马源性免疫球蛋白的结构和功能、马源性免疫球蛋白在冠状病毒感染等传染病的防治中发挥的作用进行了综述,以便为积极发挥马源性免疫球蛋白的优势总结经验,并为突破马源性免疫球蛋白研发应用中存在的瓶颈问题提供参考和建议。

关键词：马源性免疫球蛋白免疫感染抗体作用机制

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2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)在支原体培养中的应用研究

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中国兽医科学 2023年第12期53卷 1537-1543页

作者：刘立元许健张瑜瑜宋银娟支飞杰储岳峰秦建华河北农业大学动物医学院河北保定071001 中国农业科学院、兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室、兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730046 新疆农业大学动物医学院新疆乌鲁木齐830091

为了分析细菌培养指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)在支原体培养中的应用,笔者将牛支原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、绵羊肺炎支原体、鸡毒支原体、肺炎支原体分别接种于含有TTC的改良Thiaucourt’s液体培养基(TT... 详细信息

为了分析细菌培养指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)在支原体培养中的应用,笔者将牛支原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、绵羊肺炎支原体、鸡毒支原体、肺炎支原体分别接种于含有TTC的改良Thiaucourt’s液体培养基(TTC-MTB)和改良Thiaucourt’s固体培养基(TTC-MTA)中,同时以常规酚红指示剂培养基作为对照,观察支原体在2种培养基中的生长情况,并筛选TTC在培养基中的最适指示浓度。结果显示,与常规酚红指示剂相比较,TTC有更为灵敏的培养指示效果;在固体培养基中,TTC指示的支原体红色菌落更有利于菌落的计数及形态的观察;TTC的最佳使用浓度为0.2 mg/mL。本研究可为支原体培养和优化疫苗生产工艺提供参考。

关键词： 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC) 生长指示剂支原体

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猪瘟与口蹄疫二联疫苗的制备及其免疫效果评价

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中国预防兽医学报 2025年第2期47卷 172-178页

作者：高洁袁红焦云娟李坤李平花杨宇轩黄书伦郭海洋邱酉飞包慧芳孙普李冬刘在新卢曾军白兴文中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 WOAH/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为研制猪瘟(CSF)与口蹄疫(FMD)二联疫苗并评价其免疫效果,本研究采用真核表达系统瞬时表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白后经AKTA蛋白纯化仪和Hi Trap TALON纯化柱纯化,采用SDS-PAGE检测重组E2蛋白(r E2)的表达与纯化效果,采用western blot检测r... 详细信息

为研制猪瘟(CSF)与口蹄疫(FMD)二联疫苗并评价其免疫效果,本研究采用真核表达系统瞬时表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白后经AKTA蛋白纯化仪和Hi Trap TALON纯化柱纯化,采用SDS-PAGE检测重组E2蛋白(r E2)的表达与纯化效果,采用western blot检测r E2与His-Tag单克隆抗体(MAb)的反应原性。结果显示,在约50 ku处出现目的蛋白条带,纯化后在约50 ku处出现单一条带。western blot结果显示在50 ku处出现特异性条带。表明,r E2获得了表达且纯化效果较好,反应原性较强。将纯化后的r E2与灭活的口蹄疫病毒(FMDV)O/Tibet/99株混合后经ISA 201佐剂乳化制备二联疫苗,将小鼠分为4组:CSFV E2+FMDV(20μg^(+)1μg)组、CSFV E2(20μg)组、FMDV(1μg)组及PBS阴性对照组。于第1 d和21 d分别将相应疫苗以肌肉注射方式免疫6周龄~8周龄的各组雌性BALB/c小鼠,首免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d采血,利用ELISA检测各组小鼠血清中的抗体水平;利用流式细胞术检测免疫后42 d各组小鼠血液中CD3^(+)/CD4^(+)T淋巴细胞、CD3^(+)/CD8^(+)T淋巴细胞和CD19^(+)B淋巴细胞的占比;采用ELISA检测免疫后42 d各组小鼠血清中IFN-γ的分泌水平。抗体检测结果显示,与PBS组相比,E2组、FMDV组和E2+FMDV组小鼠产生的针对两种病毒的抗体水平均显著和极显著升高(P<0.05、P<0.01、P<0.0001);E2+FMDV组与E2组和FMDV组小鼠血清中CSFV和FMDV的抗体水平均无显著差异(P>0.05)。流式细胞术结果显示,E2组、FMDV组和E2+FMDV组小鼠CD3^(+)/CD4^(+)T淋巴细胞、CD3^(+)/CD8^(+)T淋巴细胞及CD19^(+)B淋巴细胞的占比均显著和极显著高于PBS组(P<0.05、P<0.01、P<0.0001);E2+FMDV组与E2组小鼠上述指标均无显著差异;与FMDV组相比,E2+FMDV组小鼠CD3^(+)/CD4^(+)T淋巴细胞的占比极显著升高(P<0.01),而另外两个指标均无显著差异。ELISA检测结果显示,3个实验组小鼠血清中IFN-γ的分泌水平均显著和极显著高于PBS组(P<0.05、P<0.01),E2+FMDV组与二者单独免疫组小鼠IFN-γ的分泌水平均无显著差异。上述结果表明,E2+FMDV二联疫苗对小鼠的免疫效果与单独免疫E2亚单位疫苗和FMDV灭活疫苗的免疫效果相当,CSFV E2蛋白与FMDV灭活病毒的联合免疫是可行的。综上,本研究首次制备的CSFV E2+FMDV二联苗可作为防控CSF和FMD的一种潜在候选疫苗,为这两种病毒二联甚至多联疫苗的研制奠定了实验基础。

关键词：猪瘟 E2蛋白口蹄疫二联疫苗

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基于响应面法优化脂质纳米颗粒的配方及表征

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中国兽医科学 2024年第10期54卷 1399-1407页

作者：麻玉清柳海云郭伟江丽馨孙世琪王晓强马全英郭慧琛兰州交通大学化学化工学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 兰州交通大学生物与制药工程学院甘肃兰州730070

脂质纳米颗粒是目前最有应用前景的药物载体之一,本研究旨在解决原材料配方对脂质纳米颗粒自组装的影响,优化其配方。首先,以包封率为评价指标,通过单因素试验确定膜材比、脂质浓度和DMG-PEG 2000的含量。其次,采用Box-Benhnken响应面... 详细信息

脂质纳米颗粒是目前最有应用前景的药物载体之一,本研究旨在解决原材料配方对脂质纳米颗粒自组装的影响,优化其配方。首先,以包封率为评价指标,通过单因素试验确定膜材比、脂质浓度和DMG-PEG 2000的含量。其次,采用Box-Benhnken响应面分析法优化脂质纳米颗粒制备工艺,并对其进行表征评价。结果表明,通过单因素试验确定的三因素分别是:膜材比、脂质浓度和DMG-PEG 2000含量。三因素的三水平分别为:膜材比选择1∶1、2∶1、3∶1,脂质浓度选择15、20、25 mmol/L,DMG-PEG2000含量选择5%、7%、9%。通过Box-Benhnken响应面分析法得出:当脂质纳米颗粒的膜材比为2∶1,脂质浓度为20 mmol/L,DMG-PEG2000含量为7%时,其脂质纳米颗粒的包封率为(94.8±0.15)%,粒径为(43.77±0.25)nm,聚合物分散指数(polymer dispersity index,PDI)为(0.14±0.04),Zeta电位为(-0.44±0.15)m V。利用透射电镜观察该脂质纳米颗粒的形态为球形结构、分散均匀。稳定性试验显示4℃放置28 d,脂质纳米颗粒的平均粒径、PDI和包封率无显著变化,说明该脂质纳米颗粒稳定性良好。本研究为制备一种高效的脂质纳米颗粒提供了参考依据。

关键词：脂质纳米颗粒 Box-Benhnken响应面法单因素包封率

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