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生物技术通报 2025年第1期41卷 39-48页

作者：尹号尤留超韩瑞高鹏程付磊储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具,而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一,传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题,而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白(SSAP)表现出了远超内... 详细信息

基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具,而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一,传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题,而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白(SSAP)表现出了远超内源性重组途径的基因组编辑效率,该蛋白具有单链DNA结合活性、介导基因组定向重组的特点,使其成为目前极具潜力的基因组编辑工具。本文主要对同源重组基本原理、噬菌体源SSAP介导的同源重组途径的基本元件、重组机制模型以及应用策略展开概述,旨在为进一步解析单链DNA退火蛋白介导的同源重组过程提供帮助,为研究更多细菌基因功能、致病机制以及开发工程菌株提供技术支撑,也为缺乏基因编辑方法的细菌提供技术参考。

关键词：细菌单链DNA退火蛋白同源重组机制应用

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基于天蚕素D的新型抗病毒多肽对猪繁殖呼吸综合征病毒的抑制作用

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生物工程学报 2025年

作者：臧浩月彭婕郭慧琛孙世琪曾巧英周静静甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

由猪繁殖呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）引发的猪繁殖呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）是目前危害养猪业的主要疾病之一。本研究旨在设计优化天然抗菌肽，筛选具有显著抑制PRRSV活性的抗病毒多肽，为PRRS防控制剂的研发提供新思路。将天蚕素D（cecropin D， CD）为母肽，通过氨基酸替换策略设计了CD-2、CD-3、CD-4这3个衍生物，利用固相合成技术合成CD及其衍生物，并使用质谱（mass spectrometry， MS）和反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography， RP-HPLC）进行多肽的序列鉴定、纯化和纯度分析。通过圆二色谱研究多肽二级结构，使用CellTiter 96?AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(CellTiter 96?AQueous one solution cell proliferation assay， MTS)测定多肽细胞毒性。通过蛋白免疫印迹（Western blotting， WB）、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR）以及间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay， IFA）研究多肽对PRRSV的抗病毒活性及作用阶段。MS以及RP-HPLC结果表明，CD及其衍生物被成功合成，且纯度高达95%。圆二色谱分析结果显示，CD衍生物在细胞膜模拟环境中表现出更稳定且丰富的α螺旋结构。MTS结果表明，所有被测多肽在100 μg/mL的工作浓度下的细胞毒性可忽略。多肽抗PRRSV的作用阶段试验结果显示，衍生多肽在病毒侵入阶段的抗病毒活性较母肽显著增强，说明通过引入赖氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，增强了衍生肽的疏水作用和正电荷，进而增强了衍生多肽在侵入阶段的抗PRRSV活性。以上结果为抗病毒多肽的应用及结构优化提供了理论基础，可为PRRSV的防控提供新的思路。

关键词：抗菌肽抗病毒活性阳离子氨基酸疏水性氨基酸猪繁殖呼吸综合征病毒

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口蹄疫病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达与鉴定

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南京农业大学学报 2025年

作者：李志要尹双辉郭慧琛鲍恩东南京农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

[目的]预防和控制严重影响畜牧业发展的口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）灭活苗在其病毒增殖生产过程中依然存在病毒泄露风险，研发具有与病毒粒子结构相似，且不含有核酸的病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）... 详细信息

[目的]预防和控制严重影响畜牧业发展的口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）灭活苗在其病毒增殖生产过程中依然存在病毒泄露风险，研发具有与病毒粒子结构相似，且不含有核酸的病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）、并通过毕赤酵母真核表达系统进行表达，来生产成本更加低廉的理想FMDV VLPs疫苗。[方法]为此，本研究首先将FMDV的VP0、VP3和VP1表达盒插入到同一个pPink-HC质粒上，再电转毕赤酵母以制备FMDV VLPs。[结果]试验结果显示，重组菌经过甲醇诱导后，蛋白免疫印记（Western blot，WB）可以检测到目的蛋白的表达；破碎离心后上清液经过蔗糖梯度离心可以分离得到纯化后的VLPs；通过动态光散射法（Dynamic light scattering，DLS）和透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）检测，可以观察到直径为30 nm的球形颗粒；通过ELISA检测，VLPs呈现出良好反应，这充分表明所制备的VLPs具备抗原性。VLPs经过ELISA检测后具有良好的反应，说明制备的VLPs具有抗原性。[结论]上述结果说明，采用单独表达VP0、VP3和VP1的方式在毕赤酵母中可成功制备FMDV VLPs，这为FMD疫苗的发展及其他小RNA病毒样颗粒的制备提供了实验依据。

关键词：口蹄疫病毒病毒样颗粒真核表达毕赤酵母

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南非2型口蹄疫病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用

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病毒学报 2025年第3期 856-867页

作者：石鑫泰朱昱茜石正旺罗俊聪席韬张帆何印娣李帅鹏郑海学田宏中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃农业大学动物医学院

本研究旨在开发一种用于检测南非2型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth sisease virus south African territory 2,FMDV-SAT2）抗体的简便、迅速、高特异性和灵敏性的胶体金免疫层析方法。该方法利用胶体金颗粒标记的VP1蛋白作为标记抗原，并... 详细信息

本研究旨在开发一种用于检测南非2型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth sisease virus south African territory 2,FMDV-SAT2）抗体的简便、迅速、高特异性和灵敏性的胶体金免疫层析方法。该方法利用胶体金颗粒标记的VP1蛋白作为标记抗原，并在硝酸纤维素膜上固定VP1蛋白及其单克隆抗体（Monoclonal antibody,m Ab），分别形成检测线（T线）和质量控制线（C线）。通过一系列优化试验，胶体金标记VP1蛋白的最适p H、标记量分别为8.0和24μg/m L,C线的喷膜浓度为1.5 mg/m L,T线的喷膜浓度为0.2 mg/m L，可在12～15 min内完成检测，用于检测FMDV-SAT2抗体。结果显示，研制的胶体金试纸条与塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）、O型口蹄疫病毒（FMDV-O）、A型口蹄疫病毒（FMDV-A）的灭活血清以及南非1型口蹄疫病毒（FMDV-SAT1）、南非3型口蹄疫病毒（FMDV-SAT3)VP1蛋白免疫的兔血清均无交叉反应；与南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白（FMDV-SAT2-VP1）免疫的兔血清的反应灵敏度可达1∶64；对110份FMDV-O型和50份FMDV-A型阳性猪血清样品进行检测，所有检测结果均显示为阴性；该试纸条在室温（18℃～25℃）和冷藏（4℃）环境下可分别保持稳定6个月和9个月。结果表明，本研究研发的胶体金免疫层析试纸条展现出高度的灵敏性和特异性，同时具备检测快速、操作便捷、结果直观等特点，对FMDV-SAT2的现场检测具有实际应用价值。

关键词：南非2型口蹄疫病毒胶体金试纸条抗体检测方法

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三种表达口蹄疫病毒抗原蛋白的DNA质粒及其mRNA在不同细胞系中表达效率分析

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生物工程学报 2025年

作者：江丽馨柳海云刘一凡麻玉清孙世琪郑泽中郭慧琛华南农业大学兽医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

口蹄疫是目前全球范围内最重要的动物传染病之一，所有偶蹄动物均易感。疫苗免疫是口蹄疫防控的首要选择。mRNA疫苗可以在体外快速设计合成和大规模生产，且能够诱导高效的保护性免疫应答，具有开发速度快、易制备、生物安全风险低等优... 详细信息

口蹄疫是目前全球范围内最重要的动物传染病之一，所有偶蹄动物均易感。疫苗免疫是口蹄疫防控的首要选择。mRNA疫苗可以在体外快速设计合成和大规模生产，且能够诱导高效的保护性免疫应答，具有开发速度快、易制备、生物安全风险低等优点。其中，非编码区的设计是增强mRNA疫苗表达和效力的关键。为了获取获得高效的FMD mRNA疫苗，本研究体外合成了3种具有不同非编码区的口蹄疫P12A3C DNA与对应的mRNA，通过比较其在不同时间点和细胞系中的表达量差异，发现mRNA P12A3C-UTR3表达量优异且普适性最好。本研究为口蹄疫mRNA疫苗的研制奠定了基础，也为高效mRNA的序列设计提供了理论依据。

关键词：口蹄疫病毒非复制型mRNA 非编码区蛋白表达

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非洲猪瘟病毒R298L基因缺失毒株的构建及其致病性与免疫原性评价

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中国兽医科学 2025年第3期55卷 285-290页

作者：范许许李伟伟朱兆宇裴丹诗王一卓何路李熙忠任青峰郑海学朱紫祥中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为了探究非洲猪瘟病毒(ASFV)R298L基因的功能,解析ASFV的致病机制,为基因缺失减毒疫苗的研发提供候选毒株,首先利用同源重组技术构建R298L基因缺失的非洲猪瘟病毒株ASFV-ΔR298L,随后通过动物实验在猪体内比较ASFV-ΔR298L与亲本毒株ASF... 详细信息

为了探究非洲猪瘟病毒(ASFV)R298L基因的功能,解析ASFV的致病机制,为基因缺失减毒疫苗的研发提供候选毒株,首先利用同源重组技术构建R298L基因缺失的非洲猪瘟病毒株ASFV-ΔR298L,随后通过动物实验在猪体内比较ASFV-ΔR298L与亲本毒株ASFV CN/GS/2018致病性和免疫应答水平的差异。结果表明,感染亲本毒株的动物发热严重,在感染后13 d内全部死亡,解剖学观察显示多器官发生严重的病变,而感染ASFV-ΔR298L重组病毒的动物发热水平显著下降,在观察期内全部存活,组织器官未发生病变,并且在后期产生较高水平的中和抗体。以上数据为解析R298L病毒蛋白的功能和阐明非洲猪瘟病毒的致病机制提供了理论依据,为基因缺失候选疫苗的研制提供了参考。

关键词：非洲猪瘟病毒 R298L基因缺失毒株致病性免疫保护

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非洲猪瘟病毒D1133L蛋白增加宿主波形蛋白磷酸化而促进病毒在猪巨噬细胞中的复制

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微生物学报 2024年第3期64卷 720-732页

作者：陈玲玲张婷郝雨杨金柯史喜绢张大俊杨行赵登率闫文倩别鑫恬陈国辉郑海学乐涛张克山重庆师范大学生命科学学院重庆401331 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin,VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的si RNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。

关键词：非洲猪瘟病毒 D1133L蛋白波形蛋白蛋白互作磷酸化

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铁蛋白纳米颗粒在生物领域的应用

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生物工程学报 2024年

作者：张越茹毅郝荣增李亚军赵陇和杨洋卢炳州刘华南郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃农业大学动物医学院

铁蛋白广泛存在于生物体内，具有存储和转化铁、维持细胞铁代谢平衡的功能。由于铁蛋白可以在体外自组装形成独特的纳米笼状结构且具有特殊的理化性质，在生物医药领域广泛应用。本文简要介绍了铁蛋白的结构和货物装载策略，重点对其在... 详细信息

铁蛋白广泛存在于生物体内，具有存储和转化铁、维持细胞铁代谢平衡的功能。由于铁蛋白可以在体外自组装形成独特的纳米笼状结构且具有特殊的理化性质，在生物医药领域广泛应用。本文简要介绍了铁蛋白的结构和货物装载策略，重点对其在纳米药物、生物成像和纳米颗粒疫苗载体等生物领域应用研究进行综述，旨在为基于铁蛋白纳米颗粒的相关研究提供参考。

关键词：铁蛋白纳米药物生物成像纳米颗粒疫苗

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口蹄疫病毒O型东南亚拓扑型抗原变异研究

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中国农业科学 2024年第15期57卷 3093-3104页

作者：王莉李坤黄书伦李凤娟王省卢曾军刘在新动物疫病防控全国重点实验室/兰州大学动物医学与生物安全学院/中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省病原生物学基础学科研究中心

【目的】O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）不断变异，易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳，疫情零星散发。近年来，O型FMDV中SEA（东南亚）拓扑型流行活跃且不断变异，持续对口蹄疫防疫产生... 详细信息

【目的】O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）不断变异，易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳，疫情零星散发。近年来，O型FMDV中SEA（东南亚）拓扑型流行活跃且不断变异，持续对口蹄疫防疫产生压力。系统解析O型FMDV毒株特异性抗原位点以及不同拓扑型毒株的序列差异，明确抗原变异的关键氨基酸，可为FMD抗原分子设计提供依据，为FMD防控提供指导。【方法】利用10株（SEA拓扑型）毒株特异性牛源单克隆中和抗体，对毒株O/GSLX/2010(O/Mya/98谱系)进行抗体压力筛选逃逸突变株，鉴定这10株抗体所识别表位的关键氨基酸。利用牛源多抗血清样本（32份）与逃逸突变毒株进行病毒交叉中和试验，分析SEA拓扑型毒株的免疫优势表位；通过序列比对分析不同拓扑型毒株在该抗原表位上的差异。利用反向遗传技术将差异性抗原表位引入O型FMDV经典疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay拓扑型)，对拯救的点突变毒株测序分析后进行间接免疫荧光试验鉴定，并通过病毒蚀斑测定与一步生长曲线检测病毒的复制动力学。利用SEA拓扑型毒株特异性单克隆中和抗体，通过中和试验分析拯救突变株的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸，评估毒株特异性位点氨基酸的改变对抗原谱的影响。【结果】SEA拓扑型特异性抗原表位主要集中于结构蛋白VP1的B-C/C-D环，属于抗原位点3。10株抗体中多数抗体（8/10）识别的抗原表位在VP1上，其中有6株单抗（A19、B55、B74、C5、F53和F166）识别的关键氨基酸位于VP1 B-C环（T43、K45）及C-D环（P58），另外2株单抗（B66和F41）识别的关键氨基酸位于VP1 C末端。病毒交叉中和试验结果表明，VP1上43位和VP3上131位氨基酸的改变显著降低了牛源多抗血清的抗体效价。对O型FMDV不同谱系毒株（26株）序列进行分析，发现三种拓扑型毒株VP1 B-C/C-D环的28、47、56和58位氨基酸不同。利用反向遗传技术成功将毒株特异性抗原表位引入Cathay拓扑型毒株（O/HN/CHA/93），拯救出6株FMDV的点突变株：POZ-GSLX-M58、POZ-GSLX-M56/58、POZ-GSLX-M28/58、POZ-GSLX-M47/58、POZ-GSLX-M28/58/47和POZ-GSLX-M47/56/58。微量中和试验结果表明，VP1上56/58位对毒株抗原性起到关键作用；然而，进一步增加28位和47位突变会降低抗体B83的中和作用，影响毒株自身的抗原性。因此，VP1上56和58位氨基酸的改变可以扩展SEA拓扑型特异性中和mAbs对O/HN/CHA/93毒株的中和效力与广度。【结论】O型FMDV结构蛋白VP1上56和58位氨基酸是引起SEA拓扑型毒株抗原变异的关键位点，引入这些抗原决定簇可以拓展FMDV O/HN/CHA/93的抗原谱。研究为FMD防控及疫苗设计提供参考。

关键词：口蹄疫病毒毒株特异性中和抗体抗原变异

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基于碳水化合物的佐剂作用机制研究进展

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畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 491-501页

作者：周梦婷宋银娟许健李斌冉多良储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

佐剂是指添加到疫苗中以刺激和增强免疫应答强度或改变免疫应答类型的物质。目前疫苗佐剂种类较多,包括铝佐剂、油乳佐剂和脂质体佐剂等,但临床使用的佐剂很少同时具备高效和低毒两大特点,因此迫切需要一种有效且安全的佐剂。基于碳水... 详细信息

佐剂是指添加到疫苗中以刺激和增强免疫应答强度或改变免疫应答类型的物质。目前疫苗佐剂种类较多,包括铝佐剂、油乳佐剂和脂质体佐剂等,但临床使用的佐剂很少同时具备高效和低毒两大特点,因此迫切需要一种有效且安全的佐剂。基于碳水化合物的佐剂具有良好的生物相容性和易代谢的优点,同时,基于碳水化合物的佐剂种类广泛,且每种都有不同免疫特性,如基于多糖的佐剂可以增强巨噬细胞的吞噬活性及抗原提呈能力等。并且基于碳水化合物的佐剂还可与Toll样受体、C型凝集素受体等多种受体结合发挥上述免疫活性,但其作用机制尚不完全清楚。故本文基于碳水化合物的佐剂作用机制相关研究进展进行总结梳理,以期为相关佐剂的进一步研究提供参考。

关键词：基于碳水化合物的佐剂多糖佐剂作用机制研究进展

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