检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 854-859页

作者：闫文倩侯景杨金柯郝雨杨行史喜绢张大俊别鑫恬陈国辉陈玲玲何路赵美玉赵思越郑海学张克山中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT... 详细信息

旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。

关键词：非洲猪瘟病毒 D1133 L蛋白单克隆抗体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒GS15株NSP2蛋白多位点缺失病毒的拯救与体外生长特性分析

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微生物学报 2024年第7期64卷 2307-2322页

作者：张兴民张婧孙普李娇阳崔占鼎李国秀王健李平花袁红李坤曹轶梅付元芳李冬赵志荀曾巧英卢曾军甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

【目的】本实验室前期在高致病性毒株PRRSV/GSWW/2015的感染性克隆上,拯救获得了非结构蛋白(non-structural protein 2,NSP2)第519-565位和第628-747位氨基酸双缺失的工程病毒(r GS15-?2)。本研究旨在在双缺失病毒的感染性克隆上,构建... 详细信息

【目的】本实验室前期在高致病性毒株PRRSV/GSWW/2015的感染性克隆上,拯救获得了非结构蛋白(non-structural protein 2,NSP2)第519-565位和第628-747位氨基酸双缺失的工程病毒(r GS15-?2)。本研究旨在在双缺失病毒的感染性克隆上,构建拯救获得NSP2三个位点缺失的工程病毒。【方法】在前期双缺失病毒感染性克隆的基础上,利用融合PCR方法分别构建缺失NSP2第323-364位和第372-433位优势抗原表位的两个3个位点缺失的重组质粒。经脂质体介导,转染Marc-145细胞拯救病毒,通过电子显微镜观察、免疫荧光实验、测定病毒滴度、绘制生长曲线等方法对缺失病毒的生长特性进行分析。【结果】成功获得拯救病毒r GS15-?3-1和r GS15-?3-2。电子显微镜下可以观察到直径大小为50-80 nm的病毒粒子;免疫荧光实验检测表明,拯救病毒与亲本病毒GS15一致,都能检测到PRRSV N蛋白表达;缺失区域RT-PCR扩增鉴定,拯救病毒传至40代缺失标记稳定存在;r GS15-△3-1与r GS15-△3-2病毒滴度分别为2.00×10^(6.0)TCID_(50)/m L和2.25×10^(5.8)TCID50/m L,与亲本病毒相比病毒滴度差异显著(P<0.05);生长曲线分析表明拯救病毒复制水平低于亲本病毒达到最高滴度的培养时间比亲本病毒延迟24 h。【结论】本研究通过对PRRSV基因2型非结构蛋白NSP2多位点缺失病毒的体外生长特性分析,为研制新型PRRSV标记疫苗奠定了基础,也为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供新的策略。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆非结构蛋白2(NSP2) 缺失标记生长特性

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使用优化的信号肽和密码子在Expi293F细胞中高表达重链抗体可变区抗体

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生物工程学报 2024年第11期40卷 4219-4227页

作者：谭书桢董虎潘颂佳穆素雨陈永杰张韵孙世琪郭慧琛中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

重链抗体可变区抗体(variable domain of heavy-chain antibody,VHH)已被广泛用于药物治疗、诊断和研究。大肠杆菌是生产VHH最常用的表达系统,但可能会导致VHH的生物活性降低。哺乳动物细胞是目前最理想的VHH表达宿主之一。本研究通过优... 详细信息

重链抗体可变区抗体(variable domain of heavy-chain antibody,VHH)已被广泛用于药物治疗、诊断和研究。大肠杆菌是生产VHH最常用的表达系统,但可能会导致VHH的生物活性降低。哺乳动物细胞是目前最理想的VHH表达宿主之一。本研究通过优化VHH的信号肽(signal peptide,SP)和密码子,以期提高VHH在Expi293F细胞中的产量。VHH1-Fc被用于筛选SP,通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)筛选出的SP IFN-α2分泌效果最佳;通过提高基因的GC3和GC含量,VHH1的产量提高了约1倍,且对VHH1与A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的结合活性无明显影响;其他5种重组VHHs分别连接SP IFN-α2并进行密码子优化,其平均产量大于191.6mg/L。此外,这些VHHs在培养上清中具有高纯度和高回收率的优点。本研究证实SP IFN-α2和密码子优化可以在Expi293F细胞高效表达VHH,为VHH的大规模生产提供了参考。

关键词：重链抗体可变区抗体信号肽密码子优化表达

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基于杆状病毒-昆虫细胞表达伪狂犬病病毒 gB蛋白及其免疫效果评价

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生物工程学报 2025年

作者：王金王锴张莹谭书桢孙世琪郭慧琛尹双辉牛家强西藏农牧学院动物科学学院农业农村部西藏包虫病防治重点实验室/西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

猪伪狂犬病（Pseudorabies， PR）是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus， PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的传染病，猪是病毒唯一的自然宿主，严重危害养猪业的安全，目前主要通过接种灭活疫苗或基因缺失弱毒疫苗预防。为了开发... 详细信息

猪伪狂犬病（Pseudorabies， PR）是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus， PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的传染病，猪是病毒唯一的自然宿主，严重危害养猪业的安全，目前主要通过接种灭活疫苗或基因缺失弱毒疫苗预防。为了开发安全有效的新型基因工程疫苗，本研究以PRV疫苗株Bartha-K61为参考毒株，利用杆状病毒-昆虫细胞系统表达了gB蛋白，非变性蛋白电泳证实gB蛋白能够形成三聚体结构，将纯化的gB蛋白免疫小鼠，通过攻毒保护试验评价免疫效果。结果显示，gB抗原能够诱导小鼠产生较强的免疫反应，血清中和抗体效价达到1:70；淋巴细胞刺激指数大于1.29，干扰素γ（interferon gamma， IFN-γ）释放水平高于100 pg/mL，免疫后攻毒(200 μL/， 104半数培养感染剂量(median tissue culture infectious dose， TCID50)/mL)临床的保护率达100%。免疫组化、组织病理切片及组织病毒载量检测显示，gB抗原免疫组的病理损伤及病毒载量相对PBS组显著降低。综上所述，本研究获得的gB蛋白免疫可诱导小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答，为研制重组gB蛋白亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：昆虫细胞表达伪狂犬病病毒 gB蛋白小鼠免疫评价

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CpG和poly I:C增强口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫效果的研究

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中国兽医科学 2024年第7期54卷 859-865,I0001页

作者：任丽华罗新董虎谭书桢郭慧琛孙世琪魏彦明滕志东甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

本研究旨在评估CpG和poly I:C对口蹄疫(FMD)病毒样颗粒(VLPs)疫苗的免疫增强效果。以纯化的O型FMDVLPs抗原为基础,使用VLPs-CpG和VLPs-poly I:C刺激小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC),通过流式细胞术分析CD40和CD86在BMDC中的表达水平。进... 详细信息

本研究旨在评估CpG和poly I:C对口蹄疫(FMD)病毒样颗粒(VLPs)疫苗的免疫增强效果。以纯化的O型FMDVLPs抗原为基础,使用VLPs-CpG和VLPs-poly I:C刺激小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC),通过流式细胞术分析CD40和CD86在BMDC中的表达水平。进一步将VLPs、VLPs-CpG和VLPs-poly I:C分别与ISA206乳化制备疫苗,并免疫豚鼠,通过检测特异性抗体、中和抗体、脾淋巴细胞增殖以及攻毒试验评估CpG和poly I:C对VLPs疫苗免疫效果的影响。结果显示,VLPs-CpG组和VLPs-poly I:C组的CD86表达水平高于VLPs组,ISA206佐剂联合poly I:C、CpG均能提高攻毒保护率,而且ISA206联合CpG可以加速特异性抗体及中和抗体反应,提高脾淋巴细胞增殖水平。本研究结果表明,CpG和poly I:C均能增强FMDVLPs疫苗的免疫效果,具有潜在的开发应用价值。

关键词：口蹄疫病毒样颗粒 CpG poly I:C 免疫效果

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牛支原体能量耦合因子转运蛋白S组件Mb BioY摄取外源生物素的功能分析

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 282-289页

作者：陈启伟权衡陈胜利刘东慧于永峰李彩玉宫晓炜储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

牛支原体(***)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展***外源生物素摄取的机制研究,将对***防控具有极其重要的意义。通过对*** PG45 Mb BioY(MBOVPG45_0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛选*** PG45 Mb Bio... 详细信息

牛支原体(***)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展***外源生物素摄取的机制研究,将对***防控具有极其重要的意义。通过对*** PG45 Mb BioY(MBOVPG45_0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛选*** PG45 Mb BioY突变株,比较PG45和PG45ΔMb BioY的生物素敏感性,异源构建Mb BioY功能性克隆验证其功能。结果表明,PG45染色体上存在一种崭新的生物素膜转运蛋白,全长996 bp,GC含量30.95%,蛋白长度为332个氨基酸,是由7个跨膜结构域组成的能量偶合因子(ECF)转运蛋白S成分Mb BioY。进一步验证后发现,当***缺失Mb BioY会影响其生长,表现出生物素代谢营养缺陷的表型。通过异源敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655,表明Mb BioY单独存在时,就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株的生理功能。初步证明,Mb BioY编码的是能量偶合因子(ECF)转运蛋白的S成分具有摄取外源生物素的能力,该研究结果将补充细菌生物素代谢调控的多样性和复杂性,为***的有效防控提供独特视角。

关键词：牛支原体能量耦合因子转运体生物素转运

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非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达

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中国兽医科学 2024年第1期54卷 1-11页

作者：唐静马旭升石正旺代军飞叶得河王萌马永华郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

探索非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统,筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌上调。首先,利用生物信息学分析C84L的结构信息,通过实时... 详细信息

探索非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统,筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌上调。首先,利用生物信息学分析C84L的结构信息,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)确定C84L蛋白在ASFV感染后的表达时序,细胞内定位;同时,用荧光素酶活性检测和蛋白免疫印迹(Western-blot)确定C84L蛋白参与调控p65的磷酸化以及IL-1β的成熟和细胞焦亡;然后,用碘化丙啶(PI)染色观察C84L蛋白诱导细胞的死亡情况;最后,使用qPCR和酶联免疫吸附试验检测C84L蛋白对IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录和分泌的影响。结果显示:C84L为亲水性蛋白,与沙门菌效应蛋白Sif A具有同源性;ASFV感染原代猪肺泡巨噬细胞4 h后,C84L m RNA表达水平逐渐上调,后续持续表达,第8小时达到顶峰;而且IFA结果显示,C84L蛋白在细胞质和细胞核中均有定位。荧光素酶和Western-blot结果显示,C84L促进p65的磷酸化并激活NF-κB启动子的活化。PI染色结果显示,C84L真核质粒转染细胞后诱导细胞死亡,Western-blot结果也显示C84L诱导Caspase-1成熟以及膜孔蛋白N-GSDMD (GSDMD剪切后的N端片段)剪切。将C84L真核质粒转染细胞后,IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录水平呈剂量依赖性升高;与转录水平相似,C84L表达诱导IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平上调。结论:ASFV C84L蛋白通过激活NF-κB以及NLRP3炎症小体诱导IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子表达水平上调以及细胞焦亡的发生。

关键词：非洲猪瘟病毒细胞因子 C84L NF-κB NLRP3

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非洲猪瘟病毒DP71L蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

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中国兽医科学 2024年第9期54卷 1216-1223页

作者：李志煜马旭升马永华郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV)DP71L蛋白的生物学功能,根据非洲猪瘟病毒ASFVCN/GS/2018DP71L基因序列设计特异性引物,通过扩增DP71L基因并克隆到原核表达载体pET28a(+)后转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,通过SDS-PAGE、Western-blot进行... 详细信息

为深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV)DP71L蛋白的生物学功能,根据非洲猪瘟病毒ASFVCN/GS/2018DP71L基因序列设计特异性引物,通过扩增DP71L基因并克隆到原核表达载体pET28a(+)后转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,通过SDS-PAGE、Western-blot进行鉴定,并以纯化出的重组DP71L蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA测定多克隆抗体效价,Western-blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,重组DP71L蛋白以可溶物和包涵体两种形式表达;间接ELISA测得多克隆抗体血清效价为1∶64000;Western-blot结果显示,该抗体能特异性识别DP71L蛋白。结论:成功地表达了DP71L重组蛋白,制备了多克隆抗体,为深入研究DP71L蛋白生物学功能奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟 DP71L蛋白原核表达多克隆抗体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型类NADC30毒株感染模型的建立

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中国兽医科学 2024年第9期54卷 1169-1174页

作者：王金龙崔占鼎张婧尤婷杜晓华卢曾军甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30流行毒株的感染模型。选择田间分离的类NADC30毒株PRRSV/GSWW/2018作为攻毒毒株,采用滴鼻、肌肉注射和皮下注射这3种方式进行感染,攻毒剂量为接种细胞培养病毒液2 m L/头(10~6TCID5... 详细信息

本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30流行毒株的感染模型。选择田间分离的类NADC30毒株PRRSV/GSWW/2018作为攻毒毒株,采用滴鼻、肌肉注射和皮下注射这3种方式进行感染,攻毒剂量为接种细胞培养病毒液2 m L/头(10~6TCID50/m L),每组3头猪。攻毒后采集血液、鼻拭子、肛拭子检测病毒血症与排毒情况,每天检测体温变化,记录增重与发病死亡情况,死亡猪及时进行剖检,观察肺组织病变情况,根据以上指标评价感染模型是否建立成功。结果显示,滴鼻与肌肉注射组在感染后第24小时出现发热症状,持续约1周时间;感染后第48小时病毒血症达峰值、并持续至死亡;滴鼻与肌肉注射攻毒组猪的体重下降,并表现出明显的临床症状与排毒现象,滴鼻组、肌肉注射组均100%死亡,皮下注射组与未感染对照组均表现正常。上述结果表明,PRRSV/GSWW/2018株通过肌肉注射或滴鼻方式均可成功感染仔猪,并表现出明显的临床症状,且有很强的致病性,表明感染模型建立成功,这为后续抗病毒药物筛选或疫苗研发奠定了良好基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型类NADC30毒株感染模型

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敲除LTA4H基因的PK-15细胞系构建及其对口蹄疫病毒复制的影响

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微生物学报 2024年第3期64卷 733-744页

作者：王家丽蒲秀瑛杨帆邵文华黄梦瑶曹伟军郑海学张伟兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建白三烯A4水解酶(leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney-15,PK-15),探究LTA4H对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)复制的影响,为开展LTA4H功能研究及调控病毒复制机制研究提供理论依据。【方法】设计2条针对猪LTA4H基因的引导RNA(small guide RNA,sgRNA),分别构建至载体pX459-puro-MCS中;将CRISPR重组质粒转染PK-15细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选,并通过有限稀释法筛选单克隆细胞,之后通过Western blotting和测序检测LTA4H基因的敲除,获得LTA4H基因功能缺失细胞系。使用Western blotting、RT-qPCR及病毒滴度测定等方法检测敲除LTA4H基因后对FMDV复制及相关蛋白的表达情况。【结果】获得的单克隆敲除细胞系与野生型细胞相比,能够显著抑制FMDV复制。【结论】本研究成功构建了LTA4H基因敲除的PK-15细胞系,证明LTA4H对FMDV的复制具有促进作用,研究结果为后续LTA4H功能研究提供理论依据。

关键词： CRISPR/Cas9 白三烯A4水解酶细胞系口蹄疫病毒

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