检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2024年第9期55卷 4226-4231页

作者：冯露田宏郑海学石正旺罗俊聪张晓阳尉娟娟周静廖焕程王婉莹西北民族大学生命科学与工程学院兰州730000 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000

建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件... 详细信息

建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。结果显示:建立的ERA检测ASFV方法特异性强与其它病原无交叉反应;CV均小于10%,具有良好的重复性;对阳性样品拷贝数的检测下限为85 copies·μL^(-1);与世界动物卫生组织(WOAH)非洲猪瘟qPCR诊断方法对比,Kappa值为0.961,具有高度一致性。本研究建立的基于ERA检测ASFV方法可以用于ASFV的现场快速检测。

关键词：非洲猪瘟病毒 ERA 核酸检测等温扩增

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嵌合流行毒株G-H环基因重组口蹄疫病毒的拯救及其免疫原性分析

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畜牧兽医学报 2024年第11期55卷 5222-5229页

作者：李平花黄书伦张克强刘锋孙普李冬包慧芳曹轶梅白兴文马雪青李坤袁红刘在新卢曾军中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

为了研究能有效免疫防控当前流行的O型3个拓扑型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的疫苗候选株,本研究利用FMDV反向遗传操作技术,通过基因替换,构建同时含当前流行的O型三个拓扑型病毒株结构蛋白基因的重组全长克隆,转染... 详细信息

为了研究能有效免疫防控当前流行的O型3个拓扑型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的疫苗候选株,本研究利用FMDV反向遗传操作技术,通过基因替换,构建同时含当前流行的O型三个拓扑型病毒株结构蛋白基因的重组全长克隆,转染表达T7RNA聚合酶的细胞后拯救重组FMDV,分析结构蛋白基因的重构对病毒生物学特性的影响;拯救病毒制备灭活疫苗,免疫猪和牛,用体外中和试验初步研究其作为O型FMD疫苗候选株的潜力。结果表明FMD流行毒株结构蛋白VP1 G-H环基因的替换没有明显影响重组病毒的噬斑表型和复制能力,但不同FMDV G-H环抗原表位对猪诱导机体产生交叉中和抗体水平影响较大,对牛诱导机体产生交叉中和抗体的影响较小,表明FMDV G-H抗原表位是猪免疫优势的表位。本研究为未来FMDV疫苗的设计提供了重要参考。

关键词： G-H环重组口蹄疫病毒拯救免疫原性分析

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非洲猪瘟病毒D1133 L蛋白单克隆抗体抑制其复制

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畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 854-859页

作者：闫文倩侯景杨金柯郝雨杨行史喜绢张大俊别鑫恬陈国辉陈玲玲何路赵美玉赵思越郑海学张克山中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT... 详细信息

旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。

关键词：非洲猪瘟病毒 D1133 L蛋白单克隆抗体

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O型口蹄疫病毒样颗粒磷酸钙仿生矿化的工艺优化

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中国兽医科学 2025年

作者：尉嘉锡王翱飞张铭洋郭伟刘瑞鹏郭慧琛孙世琪周静静曾小英兰州交通大学生物与制药工程学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

磷酸钙仿生矿化可以有效提高口蹄疫病毒样颗粒（FMD VLPs）疫苗的热稳定性并增强其免疫原性，为将磷酸钙矿化FMD VLPs推向工业生产，本研究在原有矿化工艺基础上进行了反应体系的优化，主要包括离子种类及浓度、反应体系温度、反应转速... 详细信息

磷酸钙仿生矿化可以有效提高口蹄疫病毒样颗粒（FMD VLPs）疫苗的热稳定性并增强其免疫原性，为将磷酸钙矿化FMD VLPs推向工业生产，本研究在原有矿化工艺基础上进行了反应体系的优化，主要包括离子种类及浓度、反应体系温度、反应转速。根据矿化率、矿化产物的形态、粒径等确定以上因素对FMD VLPs磷酸钙仿生矿化的影响。根据试验结果筛选出最佳矿化方案，最佳反应体系为16.7 mmol/L Ca(NO3)2， 0.3 mmol/L NaH2PO4以及1.2 mmol/L Na2HPO4。反应温度可以提高至25 ℃，搅拌转速可以降低至1 500 r/min。最后，对确定好的工艺进行等比放大至100 mL进行验证，结果表明，等比放大反应体系仍能保证良好的矿化效率，形成形态均一的矿化口蹄疫病毒样颗粒。

关键词：口蹄疫病毒样颗粒磷酸钙仿生矿化工艺优化

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猪繁殖与呼吸综合征病毒GS15株NSP2蛋白多位点缺失病毒的拯救与体外生长特性分析

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微生物学报 2024年第7期64卷 2307-2322页

作者：张兴民张婧孙普李娇阳崔占鼎李国秀王健李平花袁红李坤曹轶梅付元芳李冬赵志荀曾巧英卢曾军甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

【目的】本实验室前期在高致病性毒株PRRSV/GSWW/2015的感染性克隆上,拯救获得了非结构蛋白(non-structural protein 2,NSP2)第519-565位和第628-747位氨基酸双缺失的工程病毒(r GS15-?2)。本研究旨在在双缺失病毒的感染性克隆上,构建... 详细信息

【目的】本实验室前期在高致病性毒株PRRSV/GSWW/2015的感染性克隆上,拯救获得了非结构蛋白(non-structural protein 2,NSP2)第519-565位和第628-747位氨基酸双缺失的工程病毒(r GS15-?2)。本研究旨在在双缺失病毒的感染性克隆上,构建拯救获得NSP2三个位点缺失的工程病毒。【方法】在前期双缺失病毒感染性克隆的基础上,利用融合PCR方法分别构建缺失NSP2第323-364位和第372-433位优势抗原表位的两个3个位点缺失的重组质粒。经脂质体介导,转染Marc-145细胞拯救病毒,通过电子显微镜观察、免疫荧光实验、测定病毒滴度、绘制生长曲线等方法对缺失病毒的生长特性进行分析。【结果】成功获得拯救病毒r GS15-?3-1和r GS15-?3-2。电子显微镜下可以观察到直径大小为50-80 nm的病毒粒子;免疫荧光实验检测表明,拯救病毒与亲本病毒GS15一致,都能检测到PRRSV N蛋白表达;缺失区域RT-PCR扩增鉴定,拯救病毒传至40代缺失标记稳定存在;r GS15-△3-1与r GS15-△3-2病毒滴度分别为2.00×10^(6.0)TCID_(50)/m L和2.25×10^(5.8)TCID50/m L,与亲本病毒相比病毒滴度差异显著(P<0.05);生长曲线分析表明拯救病毒复制水平低于亲本病毒达到最高滴度的培养时间比亲本病毒延迟24 h。【结论】本研究通过对PRRSV基因2型非结构蛋白NSP2多位点缺失病毒的体外生长特性分析,为研制新型PRRSV标记疫苗奠定了基础,也为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供新的策略。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆非结构蛋白2(NSP2) 缺失标记生长特性

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使用优化的信号肽和密码子在Expi293F细胞中高表达重链抗体可变区抗体

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生物工程学报 2024年第11期40卷 4219-4227页

作者：谭书桢董虎潘颂佳穆素雨陈永杰张韵孙世琪郭慧琛中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

重链抗体可变区抗体(variable domain of heavy-chain antibody,VHH)已被广泛用于药物治疗、诊断和研究。大肠杆菌是生产VHH最常用的表达系统,但可能会导致VHH的生物活性降低。哺乳动物细胞是目前最理想的VHH表达宿主之一。本研究通过优... 详细信息

重链抗体可变区抗体(variable domain of heavy-chain antibody,VHH)已被广泛用于药物治疗、诊断和研究。大肠杆菌是生产VHH最常用的表达系统,但可能会导致VHH的生物活性降低。哺乳动物细胞是目前最理想的VHH表达宿主之一。本研究通过优化VHH的信号肽(signal peptide,SP)和密码子,以期提高VHH在Expi293F细胞中的产量。VHH1-Fc被用于筛选SP,通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)筛选出的SP IFN-α2分泌效果最佳;通过提高基因的GC3和GC含量,VHH1的产量提高了约1倍,且对VHH1与A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的结合活性无明显影响;其他5种重组VHHs分别连接SP IFN-α2并进行密码子优化,其平均产量大于191.6mg/L。此外,这些VHHs在培养上清中具有高纯度和高回收率的优点。本研究证实SP IFN-α2和密码子优化可以在Expi293F细胞高效表达VHH,为VHH的大规模生产提供了参考。

关键词：重链抗体可变区抗体信号肽密码子优化表达

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CpG和poly I:C增强口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫效果的研究

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中国兽医科学 2024年第7期54卷 859-865,I0001页

作者：任丽华罗新董虎谭书桢郭慧琛孙世琪魏彦明滕志东甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

本研究旨在评估CpG和poly I:C对口蹄疫(FMD)病毒样颗粒(VLPs)疫苗的免疫增强效果。以纯化的O型FMDVLPs抗原为基础,使用VLPs-CpG和VLPs-poly I:C刺激小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC),通过流式细胞术分析CD40和CD86在BMDC中的表达水平。进... 详细信息

本研究旨在评估CpG和poly I:C对口蹄疫(FMD)病毒样颗粒(VLPs)疫苗的免疫增强效果。以纯化的O型FMDVLPs抗原为基础,使用VLPs-CpG和VLPs-poly I:C刺激小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC),通过流式细胞术分析CD40和CD86在BMDC中的表达水平。进一步将VLPs、VLPs-CpG和VLPs-poly I:C分别与ISA206乳化制备疫苗,并免疫豚鼠,通过检测特异性抗体、中和抗体、脾淋巴细胞增殖以及攻毒试验评估CpG和poly I:C对VLPs疫苗免疫效果的影响。结果显示,VLPs-CpG组和VLPs-poly I:C组的CD86表达水平高于VLPs组,ISA206佐剂联合poly I:C、CpG均能提高攻毒保护率,而且ISA206联合CpG可以加速特异性抗体及中和抗体反应,提高脾淋巴细胞增殖水平。本研究结果表明,CpG和poly I:C均能增强FMDVLPs疫苗的免疫效果,具有潜在的开发应用价值。

关键词：口蹄疫病毒样颗粒 CpG poly I:C 免疫效果

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基于杆状病毒-昆虫细胞表达伪狂犬病病毒 gB蛋白及其免疫效果评价

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生物工程学报 2025年

作者：王金王锴张莹谭书桢孙世琪郭慧琛尹双辉牛家强西藏农牧学院动物科学学院农业农村部西藏包虫病防治重点实验室/西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

猪伪狂犬病（Pseudorabies， PR）是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus， PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的传染病，猪是病毒唯一的自然宿主，严重危害养猪业的安全，目前主要通过接种灭活疫苗或基因缺失弱毒疫苗预防。为了开发... 详细信息

猪伪狂犬病（Pseudorabies， PR）是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus， PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的传染病，猪是病毒唯一的自然宿主，严重危害养猪业的安全，目前主要通过接种灭活疫苗或基因缺失弱毒疫苗预防。为了开发安全有效的新型基因工程疫苗，本研究以PRV疫苗株Bartha-K61为参考毒株，利用杆状病毒-昆虫细胞系统表达了gB蛋白，非变性蛋白电泳证实gB蛋白能够形成三聚体结构，将纯化的gB蛋白免疫小鼠，通过攻毒保护试验评价免疫效果。结果显示，gB抗原能够诱导小鼠产生较强的免疫反应，血清中和抗体效价达到1:70；淋巴细胞刺激指数大于1.29，干扰素γ（interferon gamma， IFN-γ）释放水平高于100 pg/mL，免疫后攻毒(200 μL/， 104半数培养感染剂量(median tissue culture infectious dose， TCID50)/mL)临床的保护率达100%。免疫组化、组织病理切片及组织病毒载量检测显示，gB抗原免疫组的病理损伤及病毒载量相对PBS组显著降低。综上所述，本研究获得的gB蛋白免疫可诱导小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答，为研制重组gB蛋白亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：昆虫细胞表达伪狂犬病病毒 gB蛋白小鼠免疫评价

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牛支原体能量耦合因子转运蛋白S组件Mb BioY摄取外源生物素的功能分析

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 282-289页

作者：陈启伟权衡陈胜利刘东慧于永峰李彩玉宫晓炜储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

牛支原体(***)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展***外源生物素摄取的机制研究,将对***防控具有极其重要的意义。通过对*** PG45 Mb BioY(MBOVPG45_0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛选*** PG45 Mb Bio... 详细信息

牛支原体(***)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展***外源生物素摄取的机制研究,将对***防控具有极其重要的意义。通过对*** PG45 Mb BioY(MBOVPG45_0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛选*** PG45 Mb BioY突变株,比较PG45和PG45ΔMb BioY的生物素敏感性,异源构建Mb BioY功能性克隆验证其功能。结果表明,PG45染色体上存在一种崭新的生物素膜转运蛋白,全长996 bp,GC含量30.95%,蛋白长度为332个氨基酸,是由7个跨膜结构域组成的能量偶合因子(ECF)转运蛋白S成分Mb BioY。进一步验证后发现,当***缺失Mb BioY会影响其生长,表现出生物素代谢营养缺陷的表型。通过异源敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655,表明Mb BioY单独存在时,就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株的生理功能。初步证明,Mb BioY编码的是能量偶合因子(ECF)转运蛋白的S成分具有摄取外源生物素的能力,该研究结果将补充细菌生物素代谢调控的多样性和复杂性,为***的有效防控提供独特视角。

关键词：牛支原体能量耦合因子转运体生物素转运

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非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达

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中国兽医科学 2024年第1期54卷 1-11页

作者：唐静马旭升石正旺代军飞叶得河王萌马永华郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

探索非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统,筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌上调。首先,利用生物信息学分析C84L的结构信息,通过实时... 详细信息

探索非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统,筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌上调。首先,利用生物信息学分析C84L的结构信息,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)确定C84L蛋白在ASFV感染后的表达时序,细胞内定位;同时,用荧光素酶活性检测和蛋白免疫印迹(Western-blot)确定C84L蛋白参与调控p65的磷酸化以及IL-1β的成熟和细胞焦亡;然后,用碘化丙啶(PI)染色观察C84L蛋白诱导细胞的死亡情况;最后,使用qPCR和酶联免疫吸附试验检测C84L蛋白对IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录和分泌的影响。结果显示:C84L为亲水性蛋白,与沙门菌效应蛋白Sif A具有同源性;ASFV感染原代猪肺泡巨噬细胞4 h后,C84L m RNA表达水平逐渐上调,后续持续表达,第8小时达到顶峰;而且IFA结果显示,C84L蛋白在细胞质和细胞核中均有定位。荧光素酶和Western-blot结果显示,C84L促进p65的磷酸化并激活NF-κB启动子的活化。PI染色结果显示,C84L真核质粒转染细胞后诱导细胞死亡,Western-blot结果也显示C84L诱导Caspase-1成熟以及膜孔蛋白N-GSDMD (GSDMD剪切后的N端片段)剪切。将C84L真核质粒转染细胞后,IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录水平呈剂量依赖性升高;与转录水平相似,C84L表达诱导IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平上调。结论:ASFV C84L蛋白通过激活NF-κB以及NLRP3炎症小体诱导IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子表达水平上调以及细胞焦亡的发生。

关键词：非洲猪瘟病毒细胞因子 C84L NF-κB NLRP3

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