检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2023年第2期54卷 706-714页

作者：张婷冯涛杨金柯郝雨杨行张大俊史喜绢闫文倩陈玲玲刘湘涛郑海学张克山中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

前期研究初步表明非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L基因对ASFV复制至关重要,本研究拟进一步探究D1133L在ASFV复制中的作用。利用同源重组技术结合大肠杆菌lac阻遏操作系统实现条件性敲除D1133L基因,以pUC118为骨架重组转移载体ASFVΔi130... 详细信息

前期研究初步表明非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L基因对ASFV复制至关重要,本研究拟进一步探究D1133L在ASFV复制中的作用。利用同源重组技术结合大肠杆菌lac阻遏操作系统实现条件性敲除D1133L基因,以pUC118为骨架重组转移载体ASFVΔi130,将重组转移载体转染骨髓源巨噬细胞(BMDMs),以ASFV CN/GS/2018为亲本毒株感染BMDM,在β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在的条件下,经绿色荧光和PCR鉴定,获得条件性敲除D1133L重组毒株vD1133Li。利用荧光显微镜观察该重组毒株与亲本毒株在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中的复制差异,利用qPCR技术比较重组病毒与亲本毒株的复制差异,分析vD1133Li在无IPTG情况下回补D1133L蛋白后与在IPTG诱导情况下的复制差异。结果显示:本研究成功构建了条件性敲除D1133L的ASFV重组病毒vD1133Li,重组毒株不表达D1133L,在IPTG诱导下复制能力显著低于亲本毒株;在稳定表达D1133L的MA-104细胞系中,vD1133Li复制能力恢复。综上所述,D1133L基因对于ASFV复制至关重要,试验结果为进一步研究D1133L在ASFV致病中的机制及针对D1133L靶向药物研发提供了研究基础。

关键词：非洲猪瘟病毒条件性D1133L基因缺失重组病毒增殖特性

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阿瑞吡坦在体外对PAMs内非洲猪瘟病毒复制的抑制作用

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中国兽医科学 2022年第10期52卷 1207-1214页

作者：崔卉梅史喜绢张大俊杨行杨博杨金柯郝雨陈玲玲闫文倩刘湘涛郑海学张克山中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业农村部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

阿瑞吡坦具有抗肿瘤和抗HIV-1活性。为了探究与非洲猪瘟病毒(ASFV)D1133L亲和力较高的阿瑞吡坦是否具有抗ASFV作用,利用MTT方法测定阿瑞吡坦对PAMs细胞的毒性,然后将荧光蛋白重组ASFV感染PAMs细胞后观察荧光变化和TCID_(50)、同时用RT-q... 详细信息

阿瑞吡坦具有抗肿瘤和抗HIV-1活性。为了探究与非洲猪瘟病毒(ASFV)D1133L亲和力较高的阿瑞吡坦是否具有抗ASFV作用,利用MTT方法测定阿瑞吡坦对PAMs细胞的毒性,然后将荧光蛋白重组ASFV感染PAMs细胞后观察荧光变化和TCID_(50)、同时用RT-qPCR和Western-blot分析阿瑞吡坦对ASFV复制及D1133L、P30和P72转录和翻译的影响。结果表明,当DMSO处理PAMs时,细胞存活率未达到100%,对PAMs细胞具有一定毒性;当浓度为20和40μmol/L的阿瑞吡坦处理PAMs后,PAMs细胞存活率均接近100%,当浓度为80μmol/L的阿瑞吡坦处理PAMs时,细胞存活率达到70%以上:当阿瑞吡坦处理感染荧光蛋白重组ASFV的PAMs细胞后,ASFV的荧光值、基因组拷贝数和TCID_(50)被显著降低,ASFV D1133L、P30和P72转录和翻译被显著抑制。结论:阿瑞吡坦在体外对PAMs细胞的毒性较小,通过靶向ASFV编码的D1133L蛋白显著抑制ASFV的体外复制,对ASFVP30和P72的转录和翻译也具有抑制作用。

关键词：非洲猪瘟阿瑞吡坦抗病毒药物抑制作用

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组织蛋白酶S抑制塞内卡病毒在IBRS-2细胞中的复制

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微生物学报 2021年第10期61卷 3305-3314页

作者：史喜绢张婷杨博申超超张大俊陈学辉崔卉梅袁兴国赵登率张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

【目的】本研究旨在探究猪源组织蛋白酶S(cathepsinS,CTSS)对塞内卡病毒(SenecaValley virus,SVV)复制的影响。【方法】SVV感染IBRS-2细胞,采用RT-qPCR在转录水平探究SVV感染对内源性CTSS表达的调控;采用ELISA测定SVV感染对CTSS酶活性... 详细信息

【目的】本研究旨在探究猪源组织蛋白酶S(cathepsinS,CTSS)对塞内卡病毒(SenecaValley virus,SVV)复制的影响。【方法】SVV感染IBRS-2细胞,采用RT-qPCR在转录水平探究SVV感染对内源性CTSS表达的调控;采用ELISA测定SVV感染对CTSS酶活性的影响;通过Western blotting(WB)和RT-qPCR检测过表达CTSS对SVV复制及SVV诱导的抗病毒细胞因子的调控作用;合成针对CTSS的特异性siRNA,利用WB和RT-qPCR检测siRNA对CTSS的干扰效果以及CTSS被干扰后对SVV复制的影响。【结果】结果表明SVV感染IBRS-2细胞能显著上调内源性CTSS表达并增强CTSS酶活性;过表达CTSS能显著抑制SVV在IBRS-2细胞中的复制,同时促进宿主抗病毒细胞因子的表达;siRNA-2947下调内源性CTSS表达进而促进SVV复制。【结论】CTSS通过增强宿主抗病毒细胞因子上调表达而抑制SVV复制,本研究为进一步深入探究宿主CTSS在抗SVV免疫应答中的作用及机制提供参考依据。

关键词：组织蛋白酶S 塞内卡病毒 IBRS-2细胞抗病毒功能

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小反刍兽疫病毒Nigeria75/1疫苗毒及其N蛋白对山羊PBMCs免疫效应的影响

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病毒学报 2021年第5期37卷 1135-1147页

作者：周岩岩吴锦艳李玲霞刘丹周建华曹小安刘永生刘湘涛尚佑军中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

小反刍兽疫(PPR)是羊、骆驼等小反刍动物的一种急性、烈性、接触性A类传染病,发病率和致死率极高。目前,PPR在全球仍呈现区域性流行和多地散发势态。为探讨PPRV及N蛋白体外诱导山羊外周血单个核细胞(PBMCs)在不同时间对PBMCs免疫应答效... 详细信息

小反刍兽疫(PPR)是羊、骆驼等小反刍动物的一种急性、烈性、接触性A类传染病,发病率和致死率极高。目前,PPR在全球仍呈现区域性流行和多地散发势态。为探讨PPRV及N蛋白体外诱导山羊外周血单个核细胞(PBMCs)在不同时间对PBMCs免疫应答效应的影响。本研究将PPRV Nigeria75/1疫苗毒(1 MOI)、重组N蛋白(10μg/mL)和RPMI 1640(阴性对照)体外刺激PBMCs 48h、72h、96 h。采用CCK⁃8法检测PBMCs细胞增殖情况;qRT⁃PCR及ELISA检测炎症因子包括IL⁃1β、IL⁃6、IL⁃10、TNF⁃α和IFN⁃γ的mRNA表达水平及分泌情况;流式细胞术检测T细胞CD4+和CD8+的表达、及单核来源树突状细胞(DCs)表面分子CD40、CD86、CD80的表达、以及检测PPRV感染PBMCs引起的细胞凋亡。研究发现:与对照组相比,PPRV能够抑制PBMCs的体外增殖,显著促进炎症因子IL⁃1β、IL⁃6、IL⁃10、TNF⁃α、IFN⁃γ的表达(P<0.05)。并且PPRV感染PBMCs产生细胞凋亡,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞表达。另外PPRV体外刺激DCs,CD40、CD86、CD80的表达显著升高(P<0.05),提示PPRV具有刺激DCs细胞成熟与分化的功能。进一步研究发现PPRV N蛋白体外刺激PBMCs能引起与PPRV作用相同的免疫效应。本研究表明PPRV Nigeria75/1疫苗毒体外感染PBMCs主要引起炎症反应与细胞凋亡、促进单核来源DCs成熟与分化,并且N蛋白参与PPRV引起的各项免疫功能。

关键词：小反刍兽疫病毒 N蛋白外周血单个核细胞免疫效应

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非洲猪瘟病毒感染致母猪卵巢组织损伤的病理学观察

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中国兽医科学 2022年第4期52卷 507-515页

作者：陈学辉杨博张大俊史喜绢申超超赵登率杨金柯崔卉梅张婷袁兴国郝雨闫文倩杜晓华张克山郑海学刘湘涛甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业农村部畜禽病毒学重点开放实验室国家非洲猪瘟区域实验室甘肃兰州730046

为明确非洲猪瘟病毒(ASFV)感染对母猪卵巢组织的损伤作用,本研究分离了健康母猪卵巢中原代颗粒细胞(GCs),采集了ASFV感染的母猪卵巢组织。采用荧光定量PCR方法检测ASFV的复制情况以及感染ASFV的卵巢组织中炎症相关因子的转录情况;利用... 详细信息

为明确非洲猪瘟病毒(ASFV)感染对母猪卵巢组织的损伤作用,本研究分离了健康母猪卵巢中原代颗粒细胞(GCs),采集了ASFV感染的母猪卵巢组织。采用荧光定量PCR方法检测ASFV的复制情况以及感染ASFV的卵巢组织中炎症相关因子的转录情况;利用苏木精-伊红(HE)染色和免疫组织化学(IHC)技术分析感染后的卵巢组织病理变化和促卵泡刺激素受体(FSHR)及促黄体激素受体(LHR)的免疫组化情况。结果显示,ASFV能感染GCs且大量复制,与对照组相比,ASFV感染卵巢组织中炎症相关因子转录水平显著升高,卵巢黄体和卵巢组织间质大面积淤血,淋巴细胞浸润,黄体细胞空泡化变性;卵泡内坏死细胞周围有少量巨噬细胞浸润。ASFV感染导致FSHR和LHR转录水平显著降低,IHC结果显示,ASFV感染引起卵巢中FSHR及LHR阳性细胞密度显著降低。本试验结果为研究ASFV感染引起母猪生殖系统病变及其繁殖障碍提供了参考,积累了数据。

关键词：非洲猪瘟病毒母猪感染卵巢病理损伤

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A型塞内卡病毒激活炎症因子表达及诱导细胞焦亡

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中国兽医科学 2022年第5期52卷 586-594页

作者：李媛媛马旭升 Mohiuddin 郑海学刘湘涛马永华甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业农村部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

初步探索A型塞内卡病毒(SVA)感染3D4/21细胞后引起细胞因子的变化,以及诱导细胞焦亡的分子机制。用SVA感染3D4/21细胞,不同时间点分别检测IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、GM-CSF、IL-10、IFN-γ、CXCL10细胞因子mRNA的表达水平和相关炎... 详细信息

初步探索A型塞内卡病毒(SVA)感染3D4/21细胞后引起细胞因子的变化,以及诱导细胞焦亡的分子机制。用SVA感染3D4/21细胞,不同时间点分别检测IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、GM-CSF、IL-10、IFN-γ、CXCL10细胞因子mRNA的表达水平和相关炎症因子分泌水平;采用CCK-8检测细胞活力;用乳酸脱氢酶释放试验检测细胞膜的损伤程度;用Western-blot检测目的基因在蛋白水平的表达程度。结果显示:SVA感染细胞后,IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、GM-CSF、IL-10、IFN-γ、CXCL10细胞因子mRNA表达水平均升高,与转录水平相似,SVA能够诱导IL-1β、IL-6、TNF-α以及IL-12分泌水平上调;SVA感染3D4/21细胞后,焦亡相关基因在mRNA水平表达增加,焦亡相关蛋白GSDMD、IL-1β以及Caspase-1被激活;SVA感染细胞后,导致细胞活力下降,细胞膜完整性丧失;转染sh-NLRP3或加入NLRP3抑制剂MCC950,Caspase-1抑制剂VX765,然后感染SVA,发现焦亡相关活性蛋白表达降低。结论:SVA感染3D4/21细胞后引起上述细胞因子表达增加,激活Caspase-1引起的细胞焦亡,且与NLRP3炎症小体途径相关。

关键词： A型塞内卡病毒炎症反应细胞焦亡 NLRP3炎症小体

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非洲猪瘟病毒CP312R蛋白T细胞表位的筛选及抗原性分析

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中国兽医科学 2022年第4期52卷 410-416页

作者：周晓丽毛箬青朱紫祥孙德惠朱昱茜王凌云齐萌郑海学塔里木大学动物科学学院新疆阿拉尔843300 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业农村部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

利用免疫表位数据库(IEDB)预测和筛选非洲猪瘟病毒(ASFV)CP312R蛋白的T细胞表位;通过流式细胞术检测表位肽促进ASFV抗原特异性脾淋巴细胞增殖情况,促进免疫细胞分泌IFN-γ水平及其对T淋巴细胞杀伤作用的影响;通过RT-qPCR技术分析表位肽... 详细信息

利用免疫表位数据库(IEDB)预测和筛选非洲猪瘟病毒(ASFV)CP312R蛋白的T细胞表位;通过流式细胞术检测表位肽促进ASFV抗原特异性脾淋巴细胞增殖情况,促进免疫细胞分泌IFN-γ水平及其对T淋巴细胞杀伤作用的影响;通过RT-qPCR技术分析表位肽对ASFV在骨髓巨噬细胞中复制的影响。结果显示,筛选出2条表位肽PP8和PP9,均可促进ASFV抗原特异性脾淋巴细胞增殖(P<0.05),促进CD8^(+)T细胞分泌IFN-γ的水平(P<0.05)。表位肽PP8不能显著促进CD8^(+)T细胞对ASFV感染的靶细胞的杀伤效率(P>0.05),而表位肽PP9能够显著促进CD8^(+)T细胞对靶细胞的杀伤效率(P<0.01)。2条表位肽均可显著抑制ASFV在骨髓巨噬细胞中的复制(P<0.01)。本研究结果为筛选ASFV保护抗原或表位提供了基础数据。

关键词：非洲猪瘟病毒 T细胞表位筛选蛋白抗原性

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非洲猪瘟病毒D1133L蛋白腺苷三磷酸酶活性的测定

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中国兽医科学 2022年第5期52卷 572-578页

作者：崔卉梅张婷杨博杨金柯赵登率袁兴国陈学辉郝雨闫文倩张克山刘霞郑海学刘湘涛甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业农村部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

为测定非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L蛋白的腺苷三磷酸酶活性,首先原核表达和纯化了D1133L蛋白。然后,利用Kinase-Glo Plus Luminescent Kinase Assay Platform试剂盒优化了反应条件,建立了D1133L蛋白腺苷三磷酸酶活性的测定方法,测定... 详细信息

为测定非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L蛋白的腺苷三磷酸酶活性,首先原核表达和纯化了D1133L蛋白。然后,利用Kinase-Glo Plus Luminescent Kinase Assay Platform试剂盒优化了反应条件,建立了D1133L蛋白腺苷三磷酸酶活性的测定方法,测定了D1133L蛋白腺苷三磷酸酶活性。结果显示,在25μL的反应体系中,当蛋白浓度为1.8μmol/L,Cu^(2+)浓度为10 mmol/L,37℃反应70 min时D1133L蛋白具有最佳腺苷三磷酸酶活性,可水解体系中40.04%的腺苷三磷酸。本结果为进一步明确D1133L功能,揭示其解旋机制和靶向D1133L解旋活性的高通量化学药物筛选奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 D1133L 腺苷三磷酸酶活性测定

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非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

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畜牧兽医学报 2021年第7期52卷 1953-1962页

作者：侯景申超超张大俊杨博史喜绢张婷崔卉梅袁兴国赵登率陈学辉张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业农村部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

旨在通过预测分析和亚细胞定位研究非洲猪瘟病毒(ASFV)D1133L基因结构、亚细胞定位与功能间的关系。作者使用Mega6.0软件绘制了7株不同基因型的D1133L解旋酶和ASFV编码的其他5个解旋酶基因的系统进化树,使用EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL... 详细信息

旨在通过预测分析和亚细胞定位研究非洲猪瘟病毒(ASFV)D1133L基因结构、亚细胞定位与功能间的关系。作者使用Mega6.0软件绘制了7株不同基因型的D1133L解旋酶和ASFV编码的其他5个解旋酶基因的系统进化树,使用EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL软件预测了该基因所编码蛋白序列的二、三级结构;根据GenBank公布的ASFV序列(LR743116.1),合成D1133L基因并构建其重组真核表达质粒pCMV-D1133L,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)验证该基因表达后,将重组质粒转染至PK-15细胞,应用间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)研究了该蛋白的亚细胞定位。结果表明,通过ASFV解旋酶的基因系统进化树,发现5种解旋酶基因均相对保守。D1133L基因全长3402 bp,表达的蛋白为124.63 ku,G+C含量为6.1%,A+T含量为10.6%;二级结构分析表明α螺旋占48.90%,扩展链占13.50%,无规卷曲为33.27%;三级结构分析表明六自由度结构(six degree of freedom,QMQE)为0.20,覆盖率84%,且预测以α螺旋为主的高级结构;通过LOCSVMPSI分析预测,显示D1133L蛋白定位于细胞核内与细胞质内的概率是相同的。WB结果显示pCMV-D1133L质粒正常表达,IFA试验证明ASFV编码的解旋酶D1133L同时分布于细胞核和细胞质。本研究通过对D1133L基因序列、结构功能预测,并通过IFA验证了D1133L亚细胞分布,为进一步揭示D1133L基因功能奠定了一定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒解旋酶 D1133L基因序列分析结构预测亚细胞定位

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灭活的羊口疮病毒抑制口蹄疫病毒在BHK-21细胞中的复制

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中国兽医科学 2022年第4期52卷 403-409页

作者：张大俊王国春史喜绢杨博张婷崔卉梅袁兴国赵登率陈学辉杨金柯郝雨郑海学刘湘涛张克山中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业农村部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 辽宁省现代农业生产基地建设工程中心辽宁沈阳110000

为探究灭活的羊口疮病毒(ORFV)调节宿主免疫应答后对口蹄疫病毒(FMDV)复制的调控作用,本研究通过制备、灭活、纯化ORFV,采用RT-qPCR方法评估并分析在预先使用灭活的ORFV处理的BHK-21细胞中FMDV的复制情况以及细胞因子的变化情况。研究... 详细信息

为探究灭活的羊口疮病毒(ORFV)调节宿主免疫应答后对口蹄疫病毒(FMDV)复制的调控作用,本研究通过制备、灭活、纯化ORFV,采用RT-qPCR方法评估并分析在预先使用灭活的ORFV处理的BHK-21细胞中FMDV的复制情况以及细胞因子的变化情况。研究结果显示,灭活的ORFV上调细胞因子GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-2、IL-6和IL-10的转录水平,显著抑制FMDV在BHK-21细胞中的复制。也就是说,灭活的ORFV通过上调宿主细胞因子的转录进而抑制FMDV复制。这一研究结果为灭活的ORFV作为免疫调节剂提供了依据并为其应用提供了可能性。

关键词：口疮病毒口蹄疫病毒细胞因子 BHK-21细胞

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