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中国畜牧兽医 2015年第4期42卷 816-822页

作者：单兴娜杨彬柳纪省张韵杨勃兰喜中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室草食动物疫病重点开放实验室兰州730046 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

为获得猪札幌病毒病毒基因组连接蛋白(viral protein genome-linked,VPg),本试验以中国西北地区猪札幌病毒CH430株RNA为模板,通过RT-PCR扩增VPg基因,将其克隆至pMD19-T Simple Vector,双酶切及基因测序鉴定后,再亚克隆至pET-30a中构建... 详细信息

为获得猪札幌病毒病毒基因组连接蛋白(viral protein genome-linked,VPg),本试验以中国西北地区猪札幌病毒CH430株RNA为模板,通过RT-PCR扩增VPg基因,将其克隆至pMD19-T Simple Vector,双酶切及基因测序鉴定后,再亚克隆至pET-30a中构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。将纯化的目的蛋白免疫家兔得到超免疫血清。结果显示,获得的VPg基因全长为339bp,编码113个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,重组菌在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导表达6h时重组蛋白表达量最高,表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在,大小为22ku,与预期结果相符。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白与超免疫血清具有良好的反应原性。超免疫血清ELISA效价可达1∶12 800,且具有良好的特异性。本试验获得的超免疫血清为研究猪札幌病毒非结构蛋白VPg的结构与功能奠定了基础。

关键词：猪札幌病毒病毒基因组连接蛋白(VPg) 原核表达纯化

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屎肠球菌新序列型ST989菌株的分离鉴定及多重耐药性分析

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中国畜牧兽医 2015年第5期42卷 1274-1282页

作者：张芬芬李学瑞杨建设西北师范大学生命科学学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室兰州730046

试验从青海民和县某羊场致病性感染半月龄羔羊中分离出革兰氏阳性菌，感染羔羊临床症状有精神萎靡，采食减少，发病1～2h后死亡。两只濒死羔羊剖检结果发现，其中一只出现肝脏肿大及肝包膜脱落，其余脏器无明显病理变化；另一只各脏器... 详细信息

试验从青海民和县某羊场致病性感染半月龄羔羊中分离出革兰氏阳性菌，感染羔羊临床症状有精神萎靡，采食减少，发病1～2h后死亡。两只濒死羔羊剖检结果发现，其中一只出现肝脏肿大及肝包膜脱落，其余脏器无明显病理变化；另一只各脏器均未发现病理变化。分离病料，革兰氏染色发现，从病料中分离到的细菌均为革兰氏阳性球菌。对分离菌株进行Tuf基因PCR扩增。BLASTn比对结果显示与屎肠球菌AUS0085核苷酸序列相似性为99．8％，据此初步确定这些菌株为屎肠球菌。药敏试验结果表明，这些菌株可分为两类，第1类对p内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、喹诺酮类、利福霉素类抗生素及林可霉素和克林霉素耐药，对氯霉素和万古霉素敏感；第2类对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、利福霉素类抗生素耐药，对红霉素和罗红霉素中度耐药，但对克拉霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、氯霉素和万古霉素敏感。对第1类耐药性代表菌株lby1和第2类耐药性代表菌株lbg3进行多位点序列分析（MLsT），结果发现这些菌株为一个屎肠球菌的新序列型，为ST989。系统进化树结果显示屎肠球菌lbg3与屎肠球菌ST468亲缘关系最近，致病力试验结果表明屎肠球菌lby1和lbg3均具有致病性。

关键词：羔羊致死性感染多重耐药屎肠球菌致病性

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miR-275在长角血蜱不同发育阶段及组织中表达的动态变化

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中国兽医科学 2014年第10期44卷 1014-1021页

作者：王芳芳罗金袁小松谢俊仁田占成王素艳郭锦霞刘光远中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

根据本实验室建立的高通量测序数据库中长角血蜱miR-275的成熟体序列信息,设计出特异性茎环引物及PCR扩增引物,同时以长角血蜱β-actin基因(GenBank登录号:AY254898)为内参基因,绘制标准曲线,计算长角血蜱miR-275的标准拷贝数,采用Graph... 详细信息

根据本实验室建立的高通量测序数据库中长角血蜱miR-275的成熟体序列信息,设计出特异性茎环引物及PCR扩增引物,同时以长角血蜱β-actin基因(GenBank登录号:AY254898)为内参基因,绘制标准曲线,计算长角血蜱miR-275的标准拷贝数,采用GraphPad Prism 5软件分析miR-275在长角血蜱不同发育时期及不同组织中的表达情况。结果显示,长角血蜱miR-275和β-actin标准曲线的回归系数均大于0.99,熔解曲线峰值单一,Ct值的变异率均小于5%,表明引物特异性好,标准曲线重复性和稳定性高。用real-time PCR方法对miR-275在长角血蜱卵的不同发育时期、蜱不同发育阶段及不同组织中的表达情况进行分析。结果显示,miR-275在长角血蜱卵发育到第16天的拷贝数最大,为(13.07±1.63)×106 copies/μL,是表达量最低的第5天的43.57倍;在饱血成蜱中拷贝数最多,为(18.95±1.55)×106 copies/μL,是饥饿成蜱的236.88倍;长角血蜱卵巢中拷贝数是最高的,为(15.29±3.59)×106 copies/μL,是表皮表达量的10.47倍。结果表明,miR-275在长角血蜱卵的发育、细胞增殖、组织分化等过程中可能起到了至关重要的作用。

关键词：长角血蜱 microRNA 荧光定量PCR 标准曲线

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猪源札幌病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性检测

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中国兽医科学 2014年第12期44卷 1273-1278页

作者：杨勃兰喜杨彬柳纪省单兴娜刘伟王恩丽张韵马小军甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

为获得猪源札幌病毒(SaV)衣壳蛋白(VP1),以SaV CH430株的RNA为模板,采用RT-PCR扩增VP1基因;将其克隆到原核表达载体pET-30a中,并将成功构建的原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果显示,获得的VP1基因全长为1 635bp... 详细信息

为获得猪源札幌病毒(SaV)衣壳蛋白(VP1),以SaV CH430株的RNA为模板,采用RT-PCR扩增VP1基因;将其克隆到原核表达载体pET-30a中,并将成功构建的原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果显示,获得的VP1基因全长为1 635bp,编码545个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,目的条带大小为63ku,与预期结果相符。重组菌在37℃、IPTG终浓度为0.8mmol/L、诱导表达6h时重组蛋白的表达量达到最大值,表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在。将纯化的VP1重组蛋白免疫家兔,得到了超免疫血清。Western-blot分析表明,该重组蛋白与超免疫血清具有良好的反应原性。上述试验结果为深入研究VP1蛋白的功能和研制ELISA诊断试剂盒奠定了基础。

关键词：猪札幌病毒衣壳蛋白原核表达

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猪沙波病毒CH430株p70基因克隆与生物信息学分析

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华北农学报 2014年第3期29卷 46-51页

作者：刘伟王恩丽柳纪省杨彬兰喜中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

利用RT-PCR方法从猪沙波病毒CH430株中克隆出非结构蛋白p70基因并测序,结果显示,p70基因全长1 995 nt,编码665个氨基酸,经同源性比对及遗传进化树分析表明,CH430株为基因Ⅲ型沙波病毒毒株。生物信息学分析显示该蛋白理论等电点(pI)为5.... 详细信息

利用RT-PCR方法从猪沙波病毒CH430株中克隆出非结构蛋白p70基因并测序,结果显示,p70基因全长1 995 nt,编码665个氨基酸,经同源性比对及遗传进化树分析表明,CH430株为基因Ⅲ型沙波病毒毒株。生物信息学分析显示该蛋白理论等电点(pI)为5.96,理论分子质量为72 876.6 u;其序列上共发现25个磷酸化位点,分别为Ser(6)、Thr(13)、Tyr(6),而蛋白的磷酸化与信号传导有关,预测该蛋白为一重要的信号传导分子;无信号肽和跨膜区;该蛋白含有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和RdRp功能域;胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶功能域核心结构为1个由7个β折叠形成柱状结构和1个由1个α螺旋和7个β折叠扭曲平行形成1个不完全的桶状结构共同组成,RdRp功能域核心结构为1个具有3个子结构域空间结构,该结构与右手掌在形态上非常相似,而3个子结构域也被认为是手指、手掌和拇指。

关键词：猪沙波病毒非结构蛋白p70 克隆生物信息学分析

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血红扇头蜱卵黄原蛋白基因的克隆及生物学特性分析

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中国兽医科学 2014年第10期44卷 991-996页

作者：郭锦霞罗金殷宏罗建勋谢俊仁田占成王素艳王芳芳李奎刘光远中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450000

为研究卵黄原蛋白(Vg)基因对蜱虫卵的生理机制作用,参考GenBank中微小扇头蜱(登录号:EU086096)卵黄原蛋白基因的核苷酸序列,设计特异性引物,PCR扩增血红扇头蜱相关基因,将其克隆至pGEM-T Easy载体,并测序。对获得的阳性克隆进行序列分析... 详细信息

为研究卵黄原蛋白(Vg)基因对蜱虫卵的生理机制作用,参考GenBank中微小扇头蜱(登录号:EU086096)卵黄原蛋白基因的核苷酸序列,设计特异性引物,PCR扩增血红扇头蜱相关基因,将其克隆至pGEM-T Easy载体,并测序。对获得的阳性克隆进行序列分析,选取Vg基因的VWFD功能区设计表达引物,构建重组表达载体pGEX-4T-1-Vg,并进行表达纯化。用Western-blot鉴定表达产物的免疫原性。结果显示,获得的1 218bp的核苷酸序列片段与预期结果一致。系统发生树显示,血红扇头蜱与微小扇头蜱具有较高的同源性,两者之间的同源性高达93%,其次与变异革蜱、希伯来花蜱、肩突硬蜱的同源性分别为85%、78%、62%。序列分析显示,该基因含有1个由221个氨基酸组成的VWFD功能区。该功能区重组融合蛋白的分子质量约为51ku。Western-blot分析表明,该重组蛋白与家兔抗血红扇头蜱全蜱阳性血清、家兔抗长角血蜱全蜱阳性血清、家兔抗残缘璃眼蜱全蜱阳性血清以及家兔抗草原革蜱全蜱阳性血清均出现不同程度的反应活性。结果表明,经表达Vg基因VWFD区域而制备的重组抗原对于不同蜱种血清具有广谱性。

关键词：血红扇头蜱卵黄原蛋白基因克隆生物学特性

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山羊支原体山羊肺炎亚种单克隆抗体的制备及抗体结合抗原表位的筛选

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中国畜牧兽医 2014年第8期41卷 21-24页

作者：郑莹莹骈亚亚储岳峰赵萍贺英简莹娜姜永强逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

本研究旨在制备山羊支原体山羊肺炎亚种(***,Mccp)的单克隆抗体并筛选与抗体结合的抗原表位。试验用甲醛灭活的Mccp免疫BALB/c小鼠,运用传统的细胞融合技术进行融合获得杂交瘤细胞,亚克隆,制备单克隆抗体腹水,采用酶联免疫技术(ELISA)... 详细信息

本研究旨在制备山羊支原体山羊肺炎亚种(***,Mccp)的单克隆抗体并筛选与抗体结合的抗原表位。试验用甲醛灭活的Mccp免疫BALB/c小鼠,运用传统的细胞融合技术进行融合获得杂交瘤细胞,亚克隆,制备单克隆抗体腹水,采用酶联免疫技术(ELISA)和免疫印迹(Western blotting)技术鉴定单克隆抗体的特异性及胶内酶切鉴定与抗体结合的抗原表位。最终成功筛选获得5株单克隆抗体,鉴定到3个与抗体结合的抗原表位,为下一步科学研究提供了初步且可靠的试验基础。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种单克隆抗体抗体结合的抗原表位

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FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒载体的构建

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生物技术进展 2014年第2期4卷 107-112,F0003页

作者：高鹏李志勇柳纪省中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室兰州730046

为研制O型口蹄疫病毒(FMDV)复制缺陷型腺病毒活载体疫苗毒株,通过RT-PCR方法获得了O型FMDV的开放阅读框(ORF)基因,并定向克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建了重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMVORF,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆得到... 详细信息

为研制O型口蹄疫病毒(FMDV)复制缺陷型腺病毒活载体疫苗毒株,通过RT-PCR方法获得了O型FMDV的开放阅读框(ORF)基因,并定向克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建了重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMVORF,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆得到的ORF编码基因序列与原始强毒株O型FMDV的ORF编码基因相似性达99.8%。将含有目的基因的穿梭质粒线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-2共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞中,得到重组腺病毒质粒pAd-ORF,经PCR和酶切鉴定正确。本研究成功获得了含有现代O型疫苗用FMDV毒株的全ORF编码基因的阳性克隆,并成功构建了含有完整编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒及其腺病毒骨架质粒。

关键词：口蹄疫病毒开放阅读框腺病毒载体

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亚洲璃眼蜱miR-451与MIF相互关系分析

亚洲璃眼蜱miR-451与MIF相互关系分析

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第五届媒介生物可持续控制国际论坛

作者：罗金陈泽任巧云殷宏罗建勋刘光远中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

目的为研究亚洲璃眼蜱miR-451对其靶基因巨噬细胞游走因子表达水平的影响.方法参考高通量测序获得的亚洲璃眼蜱miR-451序列,设计茎环及PCR引物,扩增获得该蜱种miR-451序列;并通过基因合成获得抑制miR-451的dsRNA序列,用于亚洲璃眼蜱... 详细信息

目的为研究亚洲璃眼蜱miR-451对其靶基因巨噬细胞游走因子表达水平的影响.方法参考高通量测序获得的亚洲璃眼蜱miR-451序列,设计茎环及PCR引物,扩增获得该蜱种miR-451序列;并通过基因合成获得抑制miR-451的dsRNA序列,用于亚洲璃眼蜱饥饿成蜱体内注射.根据亚洲璃眼蜱MIF基因(暂未登录序列),设计特异性MIF基因的实时荧光定量引物,以β-actin基因作为内参,采用SYBR Green mal-timeRT-PCR方法检测注射dsRNA后亚洲璃眼蜱饥饿成蜱不同时间点MIF基因的表达水平,以及miR-451的表达情况.结果通过PCR扩增测序验证miR-451的成熟体序列为AAACCG UUA CCA UUA CUG AGU UU,大小为23bp.注射dsRNA后,实验组MIF基因表达量在6-18h明显低于对照组,24-48h明显高于对照组;48-84h水平一致,90-108两组MIF表达量均有明显升高,且实验组明显早于对照组.注射dsRNA后,实验组miR-451的表达量在0-6h明显升高且高于对照组,6-30h逐渐降低;54h时明显升高,且明显高于对照组,随后降低与对照组水平一致.结论本研究初步探讨了抑制miR-451后其靶基因MIF相对表达量的变化,为进一步研究亚洲璃眼蜱miR-451与MIF基因的相互作用提供参考.证明,miRNA参与基因功能的调控具有一定的功能特异性和时序性.

关键词：亚洲璃眼蜱 microRNA-451 巨噬细胞抑制游走因 MIF

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微小牛蜱饱血雌蜱高毒力昆虫病原真菌菌株的筛选

微小牛蜱饱血雌蜱高毒力昆虫病原真菌菌株的筛选

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第五届媒介生物可持续控制国际论坛

作者：任巧云陈泽罗金孙明关贵全殷宏刘光远罗建勋中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

目的微小牛蜱是动物体表常见的一类体外寄生虫,可通过叮咬侵袭家畜和野生动物,有时也侵袭人,微小牛蜱给畜牧业造成严重经济损失,并且给人类健康和动物生产带来的威胁.随着人们对药物残留和环境污染等问题的关注,加之某些蜱耐药性虫株... 详细信息

目的微小牛蜱是动物体表常见的一类体外寄生虫,可通过叮咬侵袭家畜和野生动物,有时也侵袭人,微小牛蜱给畜牧业造成严重经济损失,并且给人类健康和动物生产带来的威胁.随着人们对药物残留和环境污染等问题的关注,加之某些蜱耐药性虫株的产生,人们越来越重视对蜱的生物防治等绿色防控方法的研究.方法本试验进行了13株白僵菌和7株绿僵菌对微小牛蜱饱血雌蜱的毒力测定,采用体外浸渍法将随机分组的微小牛蜱饱血雌蜱浸入不同浓度的孢子悬液中,浸渍30 s.在28℃、相对湿度85％的条件下放置15 d,每天观察微小牛蜱,每个处理设3个重复,以含0.05 ml/L吐温80的无菌水做对照.结果从中筛选出了4株高毒力菌株：3株白僵菌(BbAT01、***03、***13)和一株绿僵菌(***04),此四株菌在孢子浓度为108个孢子/ml时对蜱的致死率均达到100％.结论此4株真菌菌株可作为微小牛蜱生防制剂的候选菌株,为后续昆虫病原真菌杀蜱制剂的研究及生产应用提供了参考依据.

关键词：微小牛蜱昆虫病原真菌致病性

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