检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2025年第4期55卷 435-440页

作者：郑东东冯涛郝荣增杨彪晏子龙齐晓兰郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

本研究旨在探究宿主蛋白HERC4对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术在PK15细胞中构建了HERC4基因敲除细胞系,通过DNA测序和蛋白免疫印迹试验证明构建的基因敲除细胞系成功,然后在BHK21细胞中转染不同剂量的HERC4蛋白... 详细信息

本研究旨在探究宿主蛋白HERC4对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术在PK15细胞中构建了HERC4基因敲除细胞系,通过DNA测序和蛋白免疫印迹试验证明构建的基因敲除细胞系成功,然后在BHK21细胞中转染不同剂量的HERC4蛋白表达质粒,制备了HERC4基因过表达细胞,随后在HERC4基因敲除细胞和过表达细胞中,分别利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量和病毒滴度测定方法检测了HERC4蛋白对FMDV复制的影响,结果表明,HERC4蛋白对FMDV复制有影响,敲除可以抑制病毒复制,过表达可以促进病毒复制。该研究结果为后续开展HERC4蛋白调控FMDV复制机制研究奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒宿主蛋白HERC4 基因敲除基因过表达

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猪瘟与口蹄疫二联疫苗的制备及其免疫效果评价

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中国预防兽医学报 2025年第02期47卷 172-178页

作者：高洁袁红焦云娟李坤李平花杨宇轩黄书伦郭海洋邱酉飞包慧芳孙普李冬刘在新卢曾军白兴文中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室 WOAH/国家口蹄疫参考实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心新疆农业大学动物医学学院

为研制猪瘟（CSF）与口蹄疫（FMD）二联疫苗并评价其免疫效果，本研究采用真核表达系统瞬时表达猪瘟病毒（CSFV）E2蛋白后经AKTA蛋白纯化仪和Hi Trap TALON纯化柱纯化，采用SDS-PAGE检测重组E2蛋白（r E2）的表达与纯化效果，采用wester... 详细信息

为研制猪瘟（CSF）与口蹄疫（FMD）二联疫苗并评价其免疫效果，本研究采用真核表达系统瞬时表达猪瘟病毒（CSFV）E2蛋白后经AKTA蛋白纯化仪和Hi Trap TALON纯化柱纯化，采用SDS-PAGE检测重组E2蛋白（r E2）的表达与纯化效果，采用western blot检测r E2与His-Tag单克隆抗体（MAb）的反应原性。结果显示，在约50 ku处出现目的蛋白条带，纯化后在约50 ku处出现单一条带。western blot结果显示在50 ku处出现特异性条带。表明，r E2获得了表达且纯化效果较好，反应原性较强。将纯化后的r E2与灭活的口蹄疫病毒（FMDV）O/Tibet/99株混合后经ISA 201佐剂乳化制备二联疫苗，将小鼠分为4组：CSFV E2+FMDV（20μg+1μg）组、CSFV E2（20μg）组、FMDV（1μg）组及PBS阴性对照组。于第1 d和21 d分别将相应疫苗以肌肉注射方式免疫6周龄～8周龄的各组雌性BALB/c小鼠，首免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d采血，利用ELISA检测各组小鼠血清中的抗体水平；利用流式细胞术检测免疫后42 d各组小鼠血液中CD3+/CD4+T淋巴细胞、CD3+/CD8+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的占比；采用ELISA检测免疫后42 d各组小鼠血清中IFN-γ的分泌水平。抗体检测结果显示，与PBS组相比，E2组、FMDV组和E2+FMDV组小鼠产生的针对两种病毒的抗体水平均显著和极显著升高（P<0.05、P<0.01、P<0.0001）;E2+FMDV组与E2组和FMDV组小鼠血清中CSFV和FMDV的抗体水平均无显著差异（P>0.05）。流式细胞术结果显示，E2组、FMDV组和E2+FMDV组小鼠CD3+/CD4+T淋巴细胞、CD3+/CD8+T淋巴细胞及CD19+B淋巴细胞的占比均显著和极显著高于PBS组（P<0.05、P<0.01、P<0.0001）;E2+FMDV组与E2组小鼠上述指标均无显著差异；与FMDV组相比，E2+FMDV组小鼠CD3+/CD4+T淋巴细胞的占比极显著升高（P<0.01），而另外两个指标均无显著差异。ELISA检测结果显示，3个实验组小鼠血清中IFN-γ的分泌水平均显著和极显著高于PBS组（P<0.05、P<0.01）,E2+FMDV组与二者单独免疫组小鼠IFN-γ的分泌水平均无显著差异。上述结果表明，E2+FMDV二联疫苗对小鼠的免疫效果与单独免疫E2亚单位疫苗和FMDV灭活疫苗的免疫效果相当，CSFV E2蛋白与FMDV灭活病毒的联合免疫是可行的。综上，本研究首次制备的CSFV E2+FMDV二联苗可作为防控CSF和FMD的一种潜在候选疫苗，为这两种病毒二联甚至多联疫苗的研制奠定了实验基础。

关键词：猪瘟 E2蛋白口蹄疫二联疫苗

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CHO细胞表达重组猪干扰素-γ及其抗病毒活性

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生物工程学报 2023年第12期39卷 4784-4795页

作者：王凌云郝荣增杨洋李亚军卢炳州毛玉涵张越龚真莉刘艳红齐萌茹毅郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 塔里木大学动物科学与技术学院新疆阿拉尔843300

为利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovarian,CHO)细胞表达系统制备重组猪干扰素-γ(recombinant porcine interferon gamma,rPoIFN-γ),并分析其体外抗病毒活性,本研究首先构建rPoIFN-γ真核表达质粒pc DNA3.1-PoIFN-γ,转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达,利用亲和层析纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;通过CCK-8实验分析rPoIFN-γ对细胞的毒性,用VSV/PK-15系统检测其抗病毒活性效价;最后分析rPoIFN-γ对塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的抗病毒活性及其对细胞内干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)和细胞因子的诱导作用。结果显示,本研究利用CHO悬浮细胞表达系统成功制备了纯化的rPoIFN-γ,该rPoIFN-γ对细胞无毒性,VSV/PK-15系统检测其活性效价为5.59×10^(7) U/mg;此外,rPoIFN-γ可诱导细胞内多种ISGs和细胞因子的表达,并显著抑制SVA的复制。总之,本研究成功利用CHO表达系统制备了高活性的rPoIFN-γ,并在体外完成其对SVA的抗病毒作用分析,为rPoIFN-γ的功能及抗病毒制剂的研究提供了实验材料和基础。

关键词：猪干扰素-γ 塞内卡病毒A 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白表达与纯化抗病毒活性

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非洲猪瘟病毒及其免疫调控分子机制

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中国兽医杂志 2023年第5期59卷 1-7页

作者：张坤鹏杨发誉张丹阳郑海学朱紫祥中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室口蹄疫国家参考实验室甘肃兰州730046 兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730000

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种以高热和出血为特征的急性传染病,世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物疾病,我国也将其列为一类动物疫病。由于ASFV的环境稳定性以及能借助中间宿主软蜱和不易感宿主野猪进行传... 详细信息

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种以高热和出血为特征的急性传染病,世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物疾病,我国也将其列为一类动物疫病。由于ASFV的环境稳定性以及能借助中间宿主软蜱和不易感宿主野猪进行传播的能力,使其防控具有一定难度。另外,由于缺乏对ASFV庞大的基因组和对应的编码蛋白的了解,其免疫学和疫苗学相关研究也具有一定的挑战。在缺乏具有稳定保护效力的安全疫苗情况下,ASF防控仍以扑杀和生物安全措施为主,这使得在应对ASF的过程中消耗了大量的人力、物力和财力。虽然我国2018年首次暴发ASF疫情后在较短的时间内即控制住了疫情进一步传播,但目前ASF依旧威胁着包括我国在内的全世界养猪行业的发展。本文对ASF的疾病特征、病原学特征和疫苗研发,以及ASFV所引起的天然免疫反应、适应性免疫反应等方面的研究进展进行概述,以期为ASFV的免疫学相关研究和ASF的疫苗研发提供一定的启示。

关键词：非洲猪瘟病毒天然免疫炎症反应细胞凋亡细胞自噬非洲猪瘟疫苗

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口蹄疫病毒Asia1型猪源中和抗体的筛选与抗原表位鉴定

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畜牧兽医学报 2024年第11期55卷 5211-5221页

作者：董开恒黄书伦李凤娟李坤刘果张强包慧芳李洪炫卢曾军张小丽甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州大学动物医学与生物安全学院国家口蹄疫参考实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流... 详细信息

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流式细胞术分选免疫猪PBMCs中的抗原特异性B细胞,通过巢式PCR扩增单个B细胞IgG抗体重链与轻链可变区基因序列,分别构建IgG抗体重链与轻链表达质粒,将其共转染CHO-S细胞进行抗体表达;通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验(VNT)验证抗体反应性和中和活性,利用免疫印迹、中和抗体逃逸突变株筛选鉴定中和抗体所识别的抗原表位类型和抗原表位关键氨基酸。结果显示:获得了5株反应性良好的Asia1型FMDV特异性抗体,其中PD3和PD7为中和抗体,两株中和抗体识别相同表位,关键氨基酸为VP2蛋白72位残基(D)。本研究首次获得Asia1型FMDV特异性猪源中和抗体,鉴定VP272D是中和表位的关键氨基酸,进一步丰富了Asia1型FMDV抗原位点信息,为FMDV Asia1型分子疫苗和新诊断检测技术研究的奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 Asia1型猪源单克隆抗体抗原表位

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CRISPR/Cas9介导的KLHL34基因敲除细胞系的建立及其应用

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中国兽医科学 2023年第7期53卷 851-857页

作者：冉乾东杨帆张伟曹伟军郑海学蔺国珍西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室、国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730000

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KLHL34基因敲除的猪肾细胞系(PK-15),初步探究KLHL34对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,为开展KLHL34功能研究和KLHL34调控病毒复制的分子机制提供试验材料。设计2条针对猪KLHL34基因的单向导RNA(single gui... 详细信息

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KLHL34基因敲除的猪肾细胞系(PK-15),初步探究KLHL34对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,为开展KLHL34功能研究和KLHL34调控病毒复制的分子机制提供试验材料。设计2条针对猪KLHL34基因的单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),分别构建至载体PX459中;将PX459-KLHL34-sgRNA重组质粒转染PK-15细胞,经嘌呤霉素加压筛选、有限稀释法亚克隆挑取单克隆细胞,测序及Western-blot分析鉴定KLHL34基因的敲除情况。用FMDV感染鉴定后的KLHL34基因敲除细胞,利用间接免疫荧光试验、Western-blot、RT-qPCR和TCID50方法综合评价敲除KLHL34基因后对FMDV复制的影响。结果显示,敲除细胞中KLHL34基因发生了碱基缺失突变且引起了目的基因的移码,同时,敲除细胞中均未检测到KLHL34蛋白表达,表明成功构建了KLHL34基因敲除的PK-15细胞系;测定比较了FMDV在KLHL34基因敲除细胞系与对照细胞中的mRNA转录水平、病毒蛋白表达水平及病毒滴度,表明KLHL34基因敲除后显著促进了FMDV的复制。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了敲除KLHL34基因的PK-15细胞系,首次证实KLHL34在抗FMDV复制过程中发挥着重要作用,为后续研究KLHL34调控FMDV复制的机制奠定了基础。

关键词： CRISPR/Cas9 KLHL34基因基因敲除口蹄疫病毒

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Tollip敲除猪肾细胞系的构建

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畜牧兽医学报 2024年第4期55卷 1810-1818页

作者：王家丽杨帆邵文华黄梦瑶曹伟军蒲秀瑛张伟郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730000 兰州理工大学生命科学与工程学院兰州730050 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

旨在探究Toll作用蛋白(toll-interacting protein, Tollip)对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)增殖的影响,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tollip基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney cell line, PK-15),并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,然后利用CCK-8试剂盒测定Tollip缺失后细胞活力变化,确认敲除细胞与野生细胞无显著差异,用FMDV感染敲除细胞后,采用Western blot、间接免疫荧光、实时荧光定量和病毒滴度测定等方法测定病毒在敲除细胞系中复制情况。结果显示:感染FMDV后,敲除细胞与野生细胞相比,显著促进了病毒的复制。综上,在PK-15细胞上,成功构建Tollip缺失细胞系,且试验表明Tollip的缺失有助于FMDV的复制。研究结果为后续Tollip功能研究及抗病毒机制研究提供理论依据。

关键词： CRISPR/Cas9 Tollip基因细胞系口蹄疫病毒

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METTL3表达水平对口蹄疫病毒复制的影响

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中国兽医科学 2024年第8期54卷 1010-1018页

作者：张继燕李伟伟范许许曹雪静朱兆宇裴丹诗王一卓何路李熙忠任青峰张伟王川郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730000 河南农业大学动物医学院河南郑州450046 甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070

利用CRISPR/Cas9系统构建了METTL3基因敲除细胞系(BHK-21),随后用口蹄疫病毒(FMDV)分别感染野生型和METTL3敲除BHK-21细胞,通过q PCR、Western-blot和TCID50方法检测FMDV在上述2株细胞中的复制情况。结果表明,敲除METTL3显著抑制FMDV的... 详细信息

利用CRISPR/Cas9系统构建了METTL3基因敲除细胞系(BHK-21),随后用口蹄疫病毒(FMDV)分别感染野生型和METTL3敲除BHK-21细胞,通过q PCR、Western-blot和TCID50方法检测FMDV在上述2株细胞中的复制情况。结果表明,敲除METTL3显著抑制FMDV的复制。为了进一步验证METTL3的表型功能,利用慢病毒包装系统构建METTL3稳定表达细胞系。用FMDV分别感染野生型和METTL3过表达BHK-21细胞,通过q PCR和TCID50试验测定FMDV在这2株细胞中的复制情况。结果显示,过量表达METTL3促进FMDV的复制。此外,激光共聚焦显微镜试验显示,FMDV感染BHK-21细胞后,METTL3从细胞核迁移至细胞质,其细胞定位的改变表明METTL3可能参与调控FMDV基因组的转录过程。本研究中成功构建了METTL3基因敲除和过表达的BHK-21细胞系,首次发现该分子正向调控FMDV的复制。上述实验结果为进一步开展METTL3在宿主细胞中调控FMDV复制的机制研究奠定了可靠的数据基础。

关键词： METTL3 m6A修饰口蹄疫病毒

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硫酸乙酰肝素的组成及其对病毒感染的影响

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中国兽医科学 2023年第12期53卷 1475-1479页

作者：黄磊袁红宫晓华包慧芳王利豪王涛高洁李平花孙普李冬陈应理刘在新卢曾军白兴文中国农业科学院兰州兽医研究所农业农村部动物病原生物学重点实验室WOAH/国家口蹄疫参考实验室动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

硫酸乙酰肝素(HS)是一类由多个二糖重复单元组成的线性硫酸化异构多糖,广泛存在于哺乳动物细胞表面和细胞外基质中。HS大分子通过相互作用识别并结合呈正电荷特性的病毒粒子,增强其对宿主细胞的感染能力,因此HS可作为病毒感染靶细胞的... 详细信息

硫酸乙酰肝素(HS)是一类由多个二糖重复单元组成的线性硫酸化异构多糖,广泛存在于哺乳动物细胞表面和细胞外基质中。HS大分子通过相互作用识别并结合呈正电荷特性的病毒粒子,增强其对宿主细胞的感染能力,因此HS可作为病毒感染靶细胞的特异性受体。已有研究证实,HS参与口蹄疫病毒(FMDV)等多种病毒的吸附和入胞过程,在病毒感染中发挥重要作用。本文概述了HS的组成及其对病毒感染的影响,以期为HS的研究提供参考。

关键词：硫酸乙酰肝素受体病毒感染

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