检索结果-内蒙古大学图书馆

猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

中国畜牧兽医 2024年第7期51卷 3056-3066页

作者：欧云文潘琴汪洋代军飞任绍科张洋翟佳佳张杰开江县动物疫病预防控制中心达州636250 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室秦皇岛066004

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段... 详细信息

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

关键词：猪圆环病毒3型(PCV3) Cap蛋白截短表达 ELISA

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鸭源A型鹦鹉热衣原体的分离鉴定

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中国人兽共患病学报 2024年第9期40卷 823-828页

作者：李兆才刘萍李赟辉张淮瑜肖乾刘春国周继章中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 山东信得科技股份有限公司集团检测中心青岛266100 兰州大学动物医学与生物安全学院兰州730000

目的对疑似鹦鹉热衣原体感染鸭进行检测、病原分离培养和基因型鉴定。方法从山东某鸭场采集病鸭肺脏,进行衣原体荧光PCR检测;将阳性样本匀浆和无菌处理后,接种L929细胞,连续传代培养,通过Giemsa染色和电子显微镜观察细胞内衣原体包涵体... 详细信息

目的对疑似鹦鹉热衣原体感染鸭进行检测、病原分离培养和基因型鉴定。方法从山东某鸭场采集病鸭肺脏,进行衣原体荧光PCR检测;将阳性样本匀浆和无菌处理后,接种L929细胞,连续传代培养,通过Giemsa染色和电子显微镜观察细胞内衣原体包涵体的形成;提取分离株DNA并测序,分析16S rRNA、16-23S IGS和ompA基因序列进行种属鉴定和基因分型。结果成功分离到1株鸭源鹦鹉热衣原体,基因型鉴定为A型。结论鸭源A型鹦鹉热衣原体的分离鉴定扩大了对A型菌株感染宿主范围的认识,为其生物学特性、致病性和防控技术及公共卫生等相关研究提供基础资料。

关键词：鹦鹉热衣原体细胞培养基因分型鸭

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猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA检测方法的建立和初步应用

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中国兽医科学 2024年第10期54卷 1302-1308页

作者：王婉莹石正旺罗俊聪廖焕程冯露郑海学田宏蔺国珍西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)Ig A抗体,以PEDV重组S蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的小鼠抗猪Ig A单克隆抗体为检测抗体,建立并优化了PEDV Ig A抗体的ELISA检测方法,并评估了其特异性、敏感性、重复性及临床样品检测性能。结果显... 详细信息

为检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)Ig A抗体,以PEDV重组S蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的小鼠抗猪Ig A单克隆抗体为检测抗体,建立并优化了PEDV Ig A抗体的ELISA检测方法,并评估了其特异性、敏感性、重复性及临床样品检测性能。结果显示:该方法抗原最佳包被质量浓度为2μg/m L,酶标抗体的最佳工作浓度为1:25000,血清最佳稀释度为1:50;与猪伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、塞内卡病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应;灵敏度为1:800;批内、批间变异系数均小于10%;与IDEXX商品化试剂盒的检测结果具有高度一致性。结果证明,本研究中建立的PEDV Ig A抗体检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,适用于猪流行性腹泻的临床诊断与防控、流行病学调查以及免疫效果评估。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S蛋白 IgA抗体 ELISA

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KLHL家族蛋白的研究进展

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中国兽医科学 2024年第10期54卷 1385-1390页

作者：陈创伟张伟吕岳芹黄梦瑶孙琬珈周嘉慧李敏曹伟军郑海学杨帆中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

本文从Kelch-like(KLHL)家族蛋白的结构特点出发,围绕其在天然免疫、肿瘤等疾病方面的作用展开叙述,旨在为KLHL家族蛋白功能的研究和肿瘤等疾病的预防和治疗提供思路。

关键词： KLHL 结构与功能天然免疫疾病肿瘤

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腐败梭菌α毒素蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

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中国兽医科学 2024年第10期54卷 1309-1317页

作者：马清龙赵佳慧王武斌李学瑞孙雨李斌储岳峰新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 青海省动物疫病预防控制中心青海西宁810001

为建立绵羊腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法,将腐败梭菌α毒素基因进行密码子优化后,通过基因合成连接到pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-α。将重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)p LysS感受态细菌,用IPTG诱导重组α毒素蛋白... 详细信息

为建立绵羊腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法,将腐败梭菌α毒素基因进行密码子优化后,通过基因合成连接到pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-α。将重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)p LysS感受态细菌,用IPTG诱导重组α毒素蛋白表达并纯化表达蛋白,切除表达蛋白携带的GST标签后,得到重组腐败梭菌α毒素蛋白。以腐败梭菌α毒素蛋白为包被抗原,建立腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法。结果表明,腐败梭菌α毒素蛋白以200 ng/孔,绵羊血清稀释度为1∶200,封闭液为10 g/L BSA,家兔抗山羊HRP酶标二抗稀释度为1︰8000,避光显色20 min为最佳的ELISA条件。检测50份阴性血清,计算平均值(x^(-))、标准差(s),依据(x^(-)+2s)确定建立的腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法的阴阳性临界值为0.244。检测血清敏感度为1︰6400;批内、批间重复性试验结果显示,该方法的变异系数均小于10%;特异性试验结果显示,该方法与绵羊B型产气荚膜梭菌、C型产气荚膜梭菌、绵羊布鲁菌、鼠伤寒沙门菌及羊痘病毒阳性血清均无交叉反应。用建立的间接ELISA和商品化腐败梭菌α试剂盒分别检测100份临床血清样本,结果表明这2种方法的阳性符合率为94.87%,阴性符合率为81.97%,总符合率为87.00%。对三联四防疫苗免疫绵羊血清的检测结果表明,本方法的检测结果能够更好地反映出接种疫苗后免疫绵羊血清中抗α毒素抗体的消长情况。该检测方法具有很好的敏感性、重复性和特异性,适用于腐败梭菌感染临床血清样品的检测和腐败梭菌疫苗免疫效果的评价。

关键词：腐败梭菌 α毒素原核表达间接ELISA

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CRISPR/Cas9介导的KLHL34基因敲除细胞系的建立及其应用

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中国兽医科学 2023年第7期53卷 851-857页

作者：冉乾东杨帆张伟曹伟军郑海学蔺国珍西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室、国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730000

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KLHL34基因敲除的猪肾细胞系(PK-15),初步探究KLHL34对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,为开展KLHL34功能研究和KLHL34调控病毒复制的分子机制提供试验材料。设计2条针对猪KLHL34基因的单向导RNA(single gui... 详细信息

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KLHL34基因敲除的猪肾细胞系(PK-15),初步探究KLHL34对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,为开展KLHL34功能研究和KLHL34调控病毒复制的分子机制提供试验材料。设计2条针对猪KLHL34基因的单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),分别构建至载体PX459中;将PX459-KLHL34-sgRNA重组质粒转染PK-15细胞,经嘌呤霉素加压筛选、有限稀释法亚克隆挑取单克隆细胞,测序及Western-blot分析鉴定KLHL34基因的敲除情况。用FMDV感染鉴定后的KLHL34基因敲除细胞,利用间接免疫荧光试验、Western-blot、RT-qPCR和TCID50方法综合评价敲除KLHL34基因后对FMDV复制的影响。结果显示,敲除细胞中KLHL34基因发生了碱基缺失突变且引起了目的基因的移码,同时,敲除细胞中均未检测到KLHL34蛋白表达,表明成功构建了KLHL34基因敲除的PK-15细胞系;测定比较了FMDV在KLHL34基因敲除细胞系与对照细胞中的mRNA转录水平、病毒蛋白表达水平及病毒滴度,表明KLHL34基因敲除后显著促进了FMDV的复制。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了敲除KLHL34基因的PK-15细胞系,首次证实KLHL34在抗FMDV复制过程中发挥着重要作用,为后续研究KLHL34调控FMDV复制的机制奠定了基础。

关键词： CRISPR/Cas9 KLHL34基因基因敲除口蹄疫病毒

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一株多谱系重组NADC34-like-PRRSV的分离鉴定及其基因组特征分析

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病毒学报 2024年第5期40卷 1062-1075页

作者：张兴民张婧虞凌雪王健王方洲李娇阳李国秀李冬马雪青白兴文龚真莉卢曾军曾巧英孙普中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046 甘肃农业大学兰州730070 中国农业科学研究院上海兽医研究所上海200441

本研究2021年9月从甘肃规模化猪场采集疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的仔猪肺脏组织和血清,经(Open Reading Frame 5,ORF5)基因分型RT-PCR扩增测序鉴定,阳性样品进行病... 详细信息

本研究2021年9月从甘肃规模化猪场采集疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的仔猪肺脏组织和血清,经(Open Reading Frame 5,ORF5)基因分型RT-PCR扩增测序鉴定,阳性样品进行病毒分离。经间接免疫荧光试验和感染细胞病理电镜切片鉴定分离毒株,采用RTPCR方法对PRRSV分离株进行全基因组序列扩增,利用生物学软件分析其遗传演化特征,同时也对该场107份猪血清样本检测。研究结果显示,ORF5基因分型RT-PCR扩增测序结果表明,该猪场为NADC34-like-PRRSV感染;间接免疫荧光显示能够与PRRSV N蛋白单克隆抗体(SR30)反应,电镜观察到感染细胞中直径大小为50-80 nm病毒粒子,其基因组全长大小为15078 bp,将分离株命名为PRRSV GSJT/9/2021株。分离株与不同谱系代表株VR-2332、JXA1、HuN4、NADC30和NADC34的全长核苷酸序列同源性分别为85.2%、86.4%、86.5%、88.7%和85.9%;ORF5基因序列与代表毒株ORF5基因序列及编码氨基酸序列的相似性分别为83.7%~94.9%与84.6%~95.5%,其中与IA/2014/NADC34毒株的核苷酸和氨基酸同源性较高分别为94.9%和95.5%;基于GSJT/9/2021全基因组和ORF5基因分别构建进化树对分离株进行分型,结果显示GSJT/9/2021的全基因组与类NADC30毒株亲缘关系较近,属于同一个分支,而ORF5基因遗传进化树表明GSJT/9/2021毒株与类NADC34毒株亲缘关系最近;ORF5氨基酸序列分析结果显示,ORF5的变异程度最大,GP5蛋白中4个糖基化位点与国内流行的NADC34毒株相比额外增加一个糖基化位点第57位,在诱骗表位37-45 aa中第38、39位出现独特突变(H38Q,L39F);Nsp2氨基酸序列分析结果显示,Nsp2蛋白存在“111+1+19a”(323-433位、483位、504-522位)缺失模式,与NADC30毒株缺失模式一致;重组分析表明GSJT/9/2021株由NADC30-like PRRSV、HUN4与IA/2014/NADC34之间发生重组变异而来,重组位点分别位于Nsp4、Nsp9、GP2a和M的氨基端。107份血清的PRRSV N蛋白抗体阳性率达98.2%。综上,PRRSV GSJT/9/2021株是1株多谱系重组变异NADC34-like-PRRSV,通过深入解析重组毒株的遗传变异和生长特性,为甘肃地区防控PRRS具有重要的指导意义。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒多谱系重组毒株分离鉴定基因组特征细胞嗜性

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非洲猪瘟病毒I215L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2024年第11期54卷 1473-1481页

作者：杜煜孙茂文曹丽艳孔祥雨李想通张宇王琦郑海学兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 中国农业科学院都市农业研究所四川成都610213

本研究聚焦于非洲猪瘟病毒(ASFV)I215L基因编码的泛素结合酶(UBCv1),对其进行原核系统表达并制备了多克隆抗体。以ASFV CN/GS/2018株为模板,成功扩增I215L基因并插入原核表达载体,形成重组质粒pET28a-I215L。经大量诱导表达后,利用切胶... 详细信息

本研究聚焦于非洲猪瘟病毒(ASFV)I215L基因编码的泛素结合酶(UBCv1),对其进行原核系统表达并制备了多克隆抗体。以ASFV CN/GS/2018株为模板,成功扩增I215L基因并插入原核表达载体,形成重组质粒pET28a-I215L。经大量诱导表达后,利用切胶方法成功纯化出重组蛋白。将提纯后的I215L蛋白与佐剂混合对动物进行多次免疫,获得鼠/兔抗I215L蛋白的多克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,鼠抗I215L多抗效价达到1∶64000以上,兔抗I215L多抗效价达到1∶512000;间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)结果显示,该多抗具有特异性识别ASFV感染后I215L蛋白的能力,并且显示出良好的效果。本研究在体外表达并纯化了ASFV I215L蛋白,成功获得鼠/兔抗I215L蛋白的多克隆抗体,这为后期ASFV I215L蛋白的结构解析、功能研究及病毒相关致病机制的探索奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 I215L蛋白原核表达多克隆抗体

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云南省食蟹猴与猕猴毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的分子流行病学研究

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中国兽医科学 2024年第2期54卷 233-239页

作者：马平平邹扬牟文杰张月玥刘仲藜张龙陈利仙王帅刘国华湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 昆明亚灵生物科技有限公司云南昆明650500

旨在探究云南省笼养食蟹猴与猕猴毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的感染及基因型分布情况。从云南省昆明市和玉溪市元江县采集到笼养食蟹猴461份和笼养猕猴72份的新鲜粪便样本,采用巢式PCR方法扩增粪便DNA样本,基于毕氏肠微孢子虫核糖体内转... 详细信息

旨在探究云南省笼养食蟹猴与猕猴毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的感染及基因型分布情况。从云南省昆明市和玉溪市元江县采集到笼养食蟹猴461份和笼养猕猴72份的新鲜粪便样本,采用巢式PCR方法扩增粪便DNA样本,基于毕氏肠微孢子虫核糖体内转录间隔区和环孢子虫SSU rRNA基因,分别对2种肠道原虫感染进行检测。结果显示:毕氏肠微孢子虫的总感染率为1.5%(8/533)。通过测序分析鉴定出3种已知毕氏肠微孢子虫基因型:D、TypeⅣ和CM1。此外,环孢子虫的总感染率为0.9%(5/533),序列比对仅发现1种环孢子虫基因型。各年龄组、性别、物种和地区间2种原虫的感染率差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明,云南地区笼养食蟹猴与猕猴存在较低的毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的感染率,该地区存在一定的毕氏肠微孢子虫和环孢子虫传播的潜在风险。本研究结果为我国云南地区笼养食蟹猴与猕猴感染毕氏肠微孢子虫和环孢子虫的防控提供了基础参考资料。

关键词：云南省食蟹猴猕猴毕氏肠微孢子虫环孢子虫

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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Nup155基因敲除的PK-15细胞系

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中国兽医科学 2024年

作者：孙瑜嘉殷娟斌刘瀛李可卿曹轶梅朵红卢曾军赵志荀张强中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心青海大学畜牧兽医科学院

本研究计划使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株，并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sgRNA，与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装；再使用2 μg/mL嘌呤霉素... 详细信息

本研究计划使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株，并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sgRNA，与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装；再使用2 μg/mL嘌呤霉素筛选细胞株；通过RT-qPCR和Western -blot来确认细胞中Nup155基因是否被敲除；最终通过CCK8试验检测Nup155基因敲除对PK-15细胞活性的影响。RT-qPCR及Western -blot结果显示，细胞株Nup155基因的mRNA和蛋白表达水平显著降低；CCK8试验结果显示，部分敲除Nup155基因的PK-15细胞活力下降。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了1株Nup155基因部分敲除的PK-15细胞系，并发现部分敲除Nup155基因会显著影响PK-15细胞活力，为深入研究Nup155基因的功能机制提供了理想的细胞模型。

关键词： PK-15细胞基因敲除 Nup155 慢病毒包装

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