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猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因新缺失模式（1+1+111+1+19）的序列特征分析

中国动物传染病学报 2024年

作者：焦守德张婧马雪青李平花王健卢曾军王富强孙普中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心中农威特生物科技股份有限公司

基因高度突变和重组致使猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）新型毒株不断增加，应对其持续监测。掌握最新流行PRRSV毒株的遗传演变特点，可为我国PRRS的防控提供分子流行病学数据参考。本研究利用RT-PCR方法和测序技术，获取甘肃地区猪群... 详细信息

基因高度突变和重组致使猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）新型毒株不断增加，应对其持续监测。掌握最新流行PRRSV毒株的遗传演变特点，可为我国PRRS的防控提供分子流行病学数据参考。本研究利用RT-PCR方法和测序技术，获取甘肃地区猪群中最新流行的一株PRRSV全基因组序列，通过MEGA、RDP4和Simplot软件对其进行基因序列分析，基于其ORF5基因、NSP2基因和全长基因构建系统发育树并进行基因全长重组分析，对比ORF5和NSP2基因编码氨基酸的变异特点。成功测定PRRSVGSQY12-2023株全基因组序列，长15 032个核苷酸，基于ORF5基因的系统发育分析揭示其属于NADC30-like（L1C-like）毒株的L1C-D分支，其NSP2蛋白出现了新型缺失模式（1+1+111+1+19），重组分析发现该毒株可能由NADC30株和JXA1株分别为潜在主要和潜在次要亲本重组演化而来。本研究首次发现甘肃地区猪群中流行L1C-D-like PRRSV，并报道了其NSP2基因的新型缺失模式，这为PRRSVs的基因多样性和遗传演化研究提供了新的见解。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 L1C-like猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP2基因缺失模式遗传变异

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METTL3表达水平对口蹄疫病毒复制的影响

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中国兽医科学 2024年第8期54卷 1010-1018页

作者：张继燕李伟伟范许许曹雪静朱兆宇裴丹诗王一卓何路李熙忠任青峰张伟王川郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730000 河南农业大学动物医学院河南郑州450046 甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070

利用CRISPR/Cas9系统构建了METTL3基因敲除细胞系(BHK-21),随后用口蹄疫病毒(FMDV)分别感染野生型和METTL3敲除BHK-21细胞,通过q PCR、Western-blot和TCID50方法检测FMDV在上述2株细胞中的复制情况。结果表明,敲除METTL3显著抑制FMDV的... 详细信息

利用CRISPR/Cas9系统构建了METTL3基因敲除细胞系(BHK-21),随后用口蹄疫病毒(FMDV)分别感染野生型和METTL3敲除BHK-21细胞,通过q PCR、Western-blot和TCID50方法检测FMDV在上述2株细胞中的复制情况。结果表明,敲除METTL3显著抑制FMDV的复制。为了进一步验证METTL3的表型功能,利用慢病毒包装系统构建METTL3稳定表达细胞系。用FMDV分别感染野生型和METTL3过表达BHK-21细胞,通过q PCR和TCID50试验测定FMDV在这2株细胞中的复制情况。结果显示,过量表达METTL3促进FMDV的复制。此外,激光共聚焦显微镜试验显示,FMDV感染BHK-21细胞后,METTL3从细胞核迁移至细胞质,其细胞定位的改变表明METTL3可能参与调控FMDV基因组的转录过程。本研究中成功构建了METTL3基因敲除和过表达的BHK-21细胞系,首次发现该分子正向调控FMDV的复制。上述实验结果为进一步开展METTL3在宿主细胞中调控FMDV复制的机制研究奠定了可靠的数据基础。

关键词： METTL3 m6A修饰口蹄疫病毒

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单细胞转录组学技术及其在寄生虫研究中的应用进展

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畜牧兽医学报 2024年第10期55卷 4290-4301页

作者：周蜓蜓李立吴燕涛逯文颖付宝权殷宏贾万忠闫鸿斌中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家动物包虫病专业实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业农村部动物病原生物学重点实验室农业农村部反刍动物重大疫病防控重点实验室(西部)兰州730000 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

单细胞转录组代表了某一时刻单个细胞内所有mRNA总表达量,其表达量反映该细胞的总体特征。通过单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术对单个细胞的全部RNA进行逆转录、扩增和测序,测序结果中包含的大量信息有可... 详细信息

单细胞转录组代表了某一时刻单个细胞内所有mRNA总表达量,其表达量反映该细胞的总体特征。通过单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术对单个细胞的全部RNA进行逆转录、扩增和测序,测序结果中包含的大量信息有可能重塑对发育生物学、基因调控以及健康和疾病中细胞异质性的理解。随着科学技术的不断发展,测序技术也在不断进步,scRNA-seq全方位、高通量以及高分辨率的特点可构建更细致、全面和精准的单细胞图谱。本文综述了常用scRNA-seq方法及其数据分析主要流程和单细胞转录组学技术在寄生虫学与寄生虫病领域研究中的应用,以期为该领域相关研究提供参考资料。

关键词：单细胞测序转录组数据分析寄生虫病

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非洲马瘟病毒VP2蛋白的截短表达及免疫原性分析

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中国兽医科学 2024年第8期54卷 1087-1095页

作者：王轩莹范亚亚户鑫兵徐婧张鸿歌田占成苟惠天郑玉姝关贵全罗建勋殷宏独军政中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 河南科技学院动物科技学院河南新乡453003 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

为评价非洲马瘟病毒(AHSV)VP2截短蛋白的免疫原性,以人工合成的含有AHSV S2的全长基因为模板,分别构建重组表达质粒p RSF-S2-502(编码1~502 aa)和p RSF-S2-1056(编码503~1056 aa),分别将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。... 详细信息

为评价非洲马瘟病毒(AHSV)VP2截短蛋白的免疫原性,以人工合成的含有AHSV S2的全长基因为模板,分别构建重组表达质粒p RSF-S2-502(编码1~502 aa)和p RSF-S2-1056(编码503~1056 aa),分别将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。将纯化后的重组蛋白免疫小鼠后,采用间接ELISA测定小鼠血清中特异性抗体水平,用流式细胞术检测小鼠脾T细胞亚群、CD4^(+)和CD8^(+)T细胞表达IFN-γ的水平。结果显示,与PBS对照组相比,各免疫组小鼠血清中特异性抗体水平均显著升高,脾内CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞水平均显著升高;免疫组小鼠脾CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞表达IFN-γ的水平均升高。结果表明,重组AHSV VP2截短蛋白对小鼠具有较好的免疫原性,为进一步研究VP2蛋白生物学功能及非洲马瘟病毒亚单位疫苗奠定了理论基础。

关键词：非洲马瘟病毒 VP2蛋白截短表达免疫原性

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宿主蛋白RPSA在非洲猪瘟病毒复制过程中的作用研究

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中国兽医科学 2024年第9期54卷 1149-1156页

作者：邵程祥张忠辉孙华林赵亚茹杨吉飞关贵全殷宏武军元牛庆丽塔里木大学动物科学与技术学院新疆阿拉尔843300 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家非洲猪瘟区域实验室甘肃兰州730046 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

本研究旨在探究宿主RPSA蛋白对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)复制的影响,以及病毒蛋白B602L与RPSA之间的相互作用。利用RPSA重组质粒pcDNA3.1-Flag-RPSA转染293T细胞,通过免疫荧光检测B602L和RPSA蛋白的亚细胞定位,通... 详细信息

本研究旨在探究宿主RPSA蛋白对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)复制的影响,以及病毒蛋白B602L与RPSA之间的相互作用。利用RPSA重组质粒pcDNA3.1-Flag-RPSA转染293T细胞,通过免疫荧光检测B602L和RPSA蛋白的亚细胞定位,通过免疫共沉淀(Co-IP)验证它们之间的相互关系。通过荧光定量PCR和Western-blot分析ASFV感染IPAM细胞在不同时间点RPSA的表达差异。此外,通过在IPAM细胞中过表达或干扰RPSA的表达,分析RPSA对ASFV复制的影响。研究结果表明,ASFV感染IPAM细胞后,RPSA蛋白的表达随时间延长而逐渐增加,表明RPSA蛋白可能在病毒感染中发挥作用。通过过表达RPSA可抑制病毒复制,而干扰RPSA则导致病毒复制增强,进一步表明RPSA在ASFV复制过程中发挥重要作用。最后,Co-IP和亚细胞定位结果证明病毒蛋白B602L与宿主蛋白RPSA之间存在相互作用。综上所述,本研究揭示了宿主蛋白RPSA在ASFV复制过程中的作用,为进一步研究病毒与宿主之间的相互作用机制奠定了基础,也有助于深入了解ASFV的感染机制为疾病控制提供新的线索。

关键词：非洲猪瘟病毒 B602L RPSA 相互作用

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2020—2023年甘肃猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因遗传变异分析

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中国兽医科学 2024年第11期54卷 1482-1490页

作者：焦守德张婧李平花王健韩庆彦张雨星魏达礼王方洲白兴文卢曾军马雪青孙普中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046 甘肃省动物疫病预防控制中心甘肃兰州730046 甘肃农业大学甘肃兰州730070

为了了解甘肃地区猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及遗传变异情况,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对2020-2023年收集的猪组织样品进行PRRSV ORF5、NSP2和ORF3基因扩增并测序,通过MEGA软件构建遗传进化树进行遗传变异分... 详细信息

为了了解甘肃地区猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及遗传变异情况,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对2020-2023年收集的猪组织样品进行PRRSV ORF5、NSP2和ORF3基因扩增并测序,通过MEGA软件构建遗传进化树进行遗传变异分析。结果显示,共检测了52份猪临床样品,PRRSV核酸阳性率为61.5%(32/52),成功获得了32条ORF5、15条NSP2和14条ORF3基因序列。ORF5基因遗传进化分析表明,2020—2023年甘肃地区猪群中PRRSV流行毒株中存在美洲型1.5谱系(4株)、1.8谱系(24株)、5.1谱系(2株)、8.7谱系(2株);NSP2基因遗传进化分析表明,获得的15条NSP2序列均为1.8谱系;ORF3基因遗传进化分析表明,获得的14条ORF3序列包括1.5谱系(2株)、1.8谱系(11株)、3.5谱系(1株)。基因核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为ORF582.3%~99.7%、NSP285.9%~90.0%和ORF389.8%~95.7%;基因编码氨基酸序列与参考毒株的同源性分别为ORF579.6%~99.0%、NSP283.4%~87.7%和ORF385.1%~94.5%。ORF5基因编码的GP5蛋白的信号肽区、高变区、细胞表位区等区域均存在不同程度的变异,其中5株毒株的第33位氨基酸出现了缺失;15株NSP2蛋白氨基酸序列的缺失模式与NADC30株一致。上述结果表明,当前甘肃地区猪群中PRRSV呈现以1.8谱系毒株为优势的美洲型多谱系共循环流行,这对甘肃地区防控PRRSV提供了重要的流行病学数据。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5 NSP2 ORF3 遗传变异

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STING agonist 22免疫增强剂配伍ASFV P30蛋白对猪免疫效果的评价

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中国兽医科学 2024年第9期54卷 1137-1148页

作者：彭勤曹伟军杨帆刘华南茹毅朱紫祥郑海学张桂红华南农业大学兽医学院广东广州510642 广东省人畜共患病防控重点实验室广东广州510642 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

本试验旨在探究STING agonist 22为候选免疫增强剂,配伍ASFV P30靶标蛋白开展对猪的免疫效果评价,为非洲猪瘟亚单位疫苗免疫增强剂的筛选提供前期实验依据。选取本实验室原核表达ASFV免疫原性较高的P30结构蛋白作为靶标抗原,并结合STING... 详细信息

本试验旨在探究STING agonist 22为候选免疫增强剂,配伍ASFV P30靶标蛋白开展对猪的免疫效果评价,为非洲猪瘟亚单位疫苗免疫增强剂的筛选提供前期实验依据。选取本实验室原核表达ASFV免疫原性较高的P30结构蛋白作为靶标抗原,并结合STINGagonist 22免疫增强剂与ISA201VG佐剂配伍ASFV P30蛋白2次免疫试验猪,比较STING agonist 22免疫增强剂诱导细胞免疫、体液免疫和抗原递呈反应的增强作用。结果显示,与单独201VG佐剂配伍相比,增加STING agonist 22免疫增强剂组免疫试验猪可以显著提早P30介导的抗体应答时间,提高B细胞成熟分化相关转录因子的表达水平,促进DCs成熟并增强其抗原递呈。本研究结果表明,STING agonist 22免疫增强剂配伍ASFV P30蛋白可以明显提高猪的细胞免疫、体液免疫反应及诱导更强的抗原递呈,可作为一种ASF亚单位疫苗的免疫增强剂。

关键词：非洲猪瘟病毒 STING agonist 22 免疫增强剂树突状细胞

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骆驼FGF21蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

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中国兽医科学 2024年第8期54卷 1079-1086页

作者：杨宇轩袁红焦云娟王涛高洁李坤李平花孙普卢曾军白兴文郜原甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省病原生物学基础学科研究中心动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730000

本研究旨在为深入研究骆驼成纤维细胞生长因子21(FGF21)调节糖脂代谢的作用机制提供蛋白和抗体材料。在NCBI数据库中检索骆驼FGF21基因序列(XM_010996368.2),删除信号肽区段后合成携带His标签的FGF21全长基因,通过Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切... 详细信息

本研究旨在为深入研究骆驼成纤维细胞生长因子21(FGF21)调节糖脂代谢的作用机制提供蛋白和抗体材料。在NCBI数据库中检索骆驼FGF21基因序列(XM_010996368.2),删除信号肽区段后合成携带His标签的FGF21全长基因,通过Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切位点嵌入p ET-28a(+)表达载体,获得重组表达质粒p ET-28a(+)-FGF21-His,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行重组蛋白FGF21的表达,通过镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。将重组蛋白FGF21与弗氏佐剂混合乳化后免疫新西兰大白兔,制备家兔源多克隆抗血清,利用protein A亲和层析纯化柱纯化多克隆抗体,利用SDS-PAGE技术分析纯化多克隆抗体的纯度,利用Western-blot和间接ELSIA方法验证纯化多克隆抗体的反应性。结果表明,成功表达并纯化出骆驼重组蛋白FGF21,以其免疫家兔后制备并纯化出抗FGF21的特异性多克隆抗体。本研究为建立ELISA方法检测骆驼FGF21蛋白提供了材料,为阐明FGF21在骆驼糖脂代谢中的功能机制奠定了基础。

关键词： FGF21 骆驼原核表达多克隆抗体

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布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株的构建及其生物学特性研究

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中国畜牧兽医 2024年第12期51卷 5128-5137页

作者：张思岚支飞杰丁剑宋银娟郑福英付强储岳峰史慧君许健新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046 新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心乌鲁木齐830000

【目的】构建牛种布鲁氏菌(***)A19株效应蛋白BspE基因缺失株,探究其生长特性及在宿主细胞中的生存、黏附及入侵能力,并观察BspE蛋白的亚细胞定位情况。【方法】以牛种布鲁氏菌A19为研究对象,运用同源重组及SacB反向筛选技术构建布鲁氏... 详细信息

【目的】构建牛种布鲁氏菌(***)A19株效应蛋白BspE基因缺失株,探究其生长特性及在宿主细胞中的生存、黏附及入侵能力,并观察BspE蛋白的亚细胞定位情况。【方法】以牛种布鲁氏菌A19为研究对象,运用同源重组及SacB反向筛选技术构建布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株A19ΔBspE,并通过质粒回补方法构建其回补株A19CΔBspE,比较3种菌株在体外的生长特性;通过平板计数方法分析BspE基因缺失对布鲁氏菌在细胞内的生存及黏附和入侵细胞能力的影响;通过间接免疫荧光试验检测BspE蛋白在RAW264.7细胞中的定位情况。【结果】菌液PCR结果显示,获得大小为2060 bp的特异性条带,成功构建BspE基因缺失株A19ΔBspE;Western blotting结果显示,获得大小约为14.59 ku的BspE-flag条带,成功构建回补株A19CΔBspE。生长曲线结果显示,在相同的培养条件下,A19ΔBspE与牛种布鲁氏菌A19、A19CΔBspE的生长趋势没有显著差异(P>0.05),均在8 h达对数生长期,32 h进入平台期。胞内增殖试验结果显示,在感染48 h内,A19ΔBspE在RAW264.7细胞中的生存能力与牛种布鲁氏菌A19、A19CΔBspE无显著差异(P>0.05)。细菌黏附和入侵试验结果显示,A19ΔBspE黏附和入侵RAW264.7细胞的能力与牛种布鲁氏菌A19、A19CΔBspE没有显著差异(P>0.05)。间接免疫荧光试验结果显示,BspE蛋白主要分布于核周区域。【结论】本研究证实了BspE基因的缺失不影响布鲁氏菌在体外的生长及在RAW264.7细胞中的生存、黏附及入侵能力,且BspE蛋白主要定位在核周区域,为后续研究布鲁氏菌效应蛋白BspE的生物学功能和致病机制奠定基础。

关键词：布鲁氏菌效应蛋白BspE 突变株生物学特性

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抑制宿主脂肪酸合成关键酶活性影响O型口蹄疫病毒的复制

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中国兽医科学 2024年第4期54卷 427-432页

作者：别鑫恬杨行陈国辉史喜绢张大俊赵登率闫文倩陈玲玲何路赵美玉赵思越蔺国珍郑海学张克山王明明西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州州730030 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

为探究宿主脂肪酸合成对O型口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,以猪肾细胞PK-15和IBRS-2细胞为模型,监测脂肪酸合成的关键酶抑制剂对FMDV复制的调控作用;通过CCK-8试剂盒检测抑制剂对细胞的毒性作用,筛选合适的抑制剂预处理浓度;用Western-blo... 详细信息

为探究宿主脂肪酸合成对O型口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,以猪肾细胞PK-15和IBRS-2细胞为模型,监测脂肪酸合成的关键酶抑制剂对FMDV复制的调控作用;通过CCK-8试剂盒检测抑制剂对细胞的毒性作用,筛选合适的抑制剂预处理浓度;用Western-blot和实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测添加外源C75和TOFA对FMDV复制的调控作用。结果显示,和对照组相比,添加脂肪酸合成的关键酶抑制剂C75和TOFA后,口蹄疫病毒蛋白水平和转录水平均显著下调。结论,抑制宿主细胞脂肪酸合成会降低FMDV在宿主细胞中的复制效率,这为进一步深入研究FMDV的致病机制开辟了新的方向。

关键词：口蹄疫病毒脂肪酸合成关键酶抑制影响

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