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中国兽医科学 2024年第1期54卷 1-11页

作者：唐静马旭升石正旺代军飞叶得河王萌马永华郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

探索非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统,筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌上调。首先,利用生物信息学分析C84L的结构信息,通过实时... 详细信息

探索非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统,筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌上调。首先,利用生物信息学分析C84L的结构信息,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)确定C84L蛋白在ASFV感染后的表达时序,细胞内定位;同时,用荧光素酶活性检测和蛋白免疫印迹(Western-blot)确定C84L蛋白参与调控p65的磷酸化以及IL-1β的成熟和细胞焦亡;然后,用碘化丙啶(PI)染色观察C84L蛋白诱导细胞的死亡情况;最后,使用qPCR和酶联免疫吸附试验检测C84L蛋白对IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录和分泌的影响。结果显示:C84L为亲水性蛋白,与沙门菌效应蛋白Sif A具有同源性;ASFV感染原代猪肺泡巨噬细胞4 h后,C84L m RNA表达水平逐渐上调,后续持续表达,第8小时达到顶峰;而且IFA结果显示,C84L蛋白在细胞质和细胞核中均有定位。荧光素酶和Western-blot结果显示,C84L促进p65的磷酸化并激活NF-κB启动子的活化。PI染色结果显示,C84L真核质粒转染细胞后诱导细胞死亡,Western-blot结果也显示C84L诱导Caspase-1成熟以及膜孔蛋白N-GSDMD (GSDMD剪切后的N端片段)剪切。将C84L真核质粒转染细胞后,IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录水平呈剂量依赖性升高;与转录水平相似,C84L表达诱导IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平上调。结论:ASFV C84L蛋白通过激活NF-κB以及NLRP3炎症小体诱导IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子表达水平上调以及细胞焦亡的发生。

关键词：非洲猪瘟病毒细胞因子 C84L NF-κB NLRP3

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非洲猪瘟病毒DP71L蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

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中国兽医科学 2024年第9期54卷 1216-1223页

作者：李志煜马旭升马永华郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV)DP71L蛋白的生物学功能,根据非洲猪瘟病毒ASFVCN/GS/2018DP71L基因序列设计特异性引物,通过扩增DP71L基因并克隆到原核表达载体pET28a(+)后转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,通过SDS-PAGE、Western-blot进行... 详细信息

为深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV)DP71L蛋白的生物学功能,根据非洲猪瘟病毒ASFVCN/GS/2018DP71L基因序列设计特异性引物,通过扩增DP71L基因并克隆到原核表达载体pET28a(+)后转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,通过SDS-PAGE、Western-blot进行鉴定,并以纯化出的重组DP71L蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA测定多克隆抗体效价,Western-blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,重组DP71L蛋白以可溶物和包涵体两种形式表达;间接ELISA测得多克隆抗体血清效价为1∶64000;Western-blot结果显示,该抗体能特异性识别DP71L蛋白。结论:成功地表达了DP71L重组蛋白,制备了多克隆抗体,为深入研究DP71L蛋白生物学功能奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟 DP71L蛋白原核表达多克隆抗体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型类NADC30毒株感染模型的建立

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中国兽医科学 2024年第9期54卷 1169-1174页

作者：王金龙崔占鼎张婧尤婷杜晓华卢曾军甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30流行毒株的感染模型。选择田间分离的类NADC30毒株PRRSV/GSWW/2018作为攻毒毒株,采用滴鼻、肌肉注射和皮下注射这3种方式进行感染,攻毒剂量为接种细胞培养病毒液2 m L/头(10~6TCID5... 详细信息

本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30流行毒株的感染模型。选择田间分离的类NADC30毒株PRRSV/GSWW/2018作为攻毒毒株,采用滴鼻、肌肉注射和皮下注射这3种方式进行感染,攻毒剂量为接种细胞培养病毒液2 m L/头(10~6TCID50/m L),每组3头猪。攻毒后采集血液、鼻拭子、肛拭子检测病毒血症与排毒情况,每天检测体温变化,记录增重与发病死亡情况,死亡猪及时进行剖检,观察肺组织病变情况,根据以上指标评价感染模型是否建立成功。结果显示,滴鼻与肌肉注射组在感染后第24小时出现发热症状,持续约1周时间;感染后第48小时病毒血症达峰值、并持续至死亡;滴鼻与肌肉注射攻毒组猪的体重下降,并表现出明显的临床症状与排毒现象,滴鼻组、肌肉注射组均100%死亡,皮下注射组与未感染对照组均表现正常。上述结果表明,PRRSV/GSWW/2018株通过肌肉注射或滴鼻方式均可成功感染仔猪,并表现出明显的临床症状,且有很强的致病性,表明感染模型建立成功,这为后续抗病毒药物筛选或疫苗研发奠定了良好基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型类NADC30毒株感染模型

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敲除LTA4H基因的PK-15细胞系构建及其对口蹄疫病毒复制的影响

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微生物学报 2024年第3期64卷 733-744页

作者：王家丽蒲秀瑛杨帆邵文华黄梦瑶曹伟军郑海学张伟兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建白三烯A4水解酶(leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney-15,PK-15),探究LTA4H对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)复制的影响,为开展LTA4H功能研究及调控病毒复制机制研究提供理论依据。【方法】设计2条针对猪LTA4H基因的引导RNA(small guide RNA,sgRNA),分别构建至载体pX459-puro-MCS中;将CRISPR重组质粒转染PK-15细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选,并通过有限稀释法筛选单克隆细胞,之后通过Western blotting和测序检测LTA4H基因的敲除,获得LTA4H基因功能缺失细胞系。使用Western blotting、RT-qPCR及病毒滴度测定等方法检测敲除LTA4H基因后对FMDV复制及相关蛋白的表达情况。【结果】获得的单克隆敲除细胞系与野生型细胞相比,能够显著抑制FMDV复制。【结论】本研究成功构建了LTA4H基因敲除的PK-15细胞系,证明LTA4H对FMDV的复制具有促进作用,研究结果为后续LTA4H功能研究提供理论依据。

关键词： CRISPR/Cas9 白三烯A4水解酶细胞系口蹄疫病毒

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动物棘球绦虫检测技术的研究进展

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中国兽医科学 2023年第8期53卷 1040-1046页

作者：张欢王萌贾万忠闫鸿斌付宝权张念章中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室、甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730000

棘球蚴病是一种由棘球绦虫幼虫引起的人兽共患寄生虫病,广泛流行于我国中部和西部牧区,严重制约畜牧业经济发展,威胁农牧民生命健康。开发灵敏、适用于早期诊断的棘球绦虫检测方法,对于净化环境中棘球绦虫虫卵和消除带虫中间宿主具有重... 详细信息

棘球蚴病是一种由棘球绦虫幼虫引起的人兽共患寄生虫病,广泛流行于我国中部和西部牧区,严重制约畜牧业经济发展,威胁农牧民生命健康。开发灵敏、适用于早期诊断的棘球绦虫检测方法,对于净化环境中棘球绦虫虫卵和消除带虫中间宿主具有重要意义。本文综述了棘球绦虫分子检测和血清学检测的研究进展,对各种检测技术的应用进行比较和总结,以期为开发棘球绦虫新型检测方法提供帮助。

关键词：棘球绦虫病原学检测免疫学检测

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非洲猪瘟病毒及其免疫调控分子机制

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中国兽医杂志 2023年第5期59卷 1-7页

作者：张坤鹏杨发誉张丹阳郑海学朱紫祥中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室口蹄疫国家参考实验室甘肃兰州730046 兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730000

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种以高热和出血为特征的急性传染病,世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物疾病,我国也将其列为一类动物疫病。由于ASFV的环境稳定性以及能借助中间宿主软蜱和不易感宿主野猪进行传... 详细信息

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种以高热和出血为特征的急性传染病,世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物疾病,我国也将其列为一类动物疫病。由于ASFV的环境稳定性以及能借助中间宿主软蜱和不易感宿主野猪进行传播的能力,使其防控具有一定难度。另外,由于缺乏对ASFV庞大的基因组和对应的编码蛋白的了解,其免疫学和疫苗学相关研究也具有一定的挑战。在缺乏具有稳定保护效力的安全疫苗情况下,ASF防控仍以扑杀和生物安全措施为主,这使得在应对ASF的过程中消耗了大量的人力、物力和财力。虽然我国2018年首次暴发ASF疫情后在较短的时间内即控制住了疫情进一步传播,但目前ASF依旧威胁着包括我国在内的全世界养猪行业的发展。本文对ASF的疾病特征、病原学特征和疫苗研发,以及ASFV所引起的天然免疫反应、适应性免疫反应等方面的研究进展进行概述,以期为ASFV的免疫学相关研究和ASF的疫苗研发提供一定的启示。

关键词：非洲猪瘟病毒天然免疫炎症反应细胞凋亡细胞自噬非洲猪瘟疫苗

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牛支原体抗体胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2023年第7期53卷 831-836页

作者：田可昕高鹏程陈胜利郑福英许健付强史慧君储岳峰新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

本试验以牛支原体(Mycoplasma bovis)MilA基因重组蛋白P300为检测靶标抗原包被检测线(T线),山羊抗家兔IgG包被质控线(C线),金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金溶液,以建立牛支原体抗体胶体金免疫层析试纸条检测方法。通过检测牛布氏杆... 详细信息

本试验以牛支原体(Mycoplasma bovis)MilA基因重组蛋白P300为检测靶标抗原包被检测线(T线),山羊抗家兔IgG包被质控线(C线),金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金溶液,以建立牛支原体抗体胶体金免疫层析试纸条检测方法。通过检测牛布氏杆菌、丝状支原体、牛病毒性腹泻病毒、牛巴氏杆菌和口蹄疫病毒5种病原的阳性血清以及实验室保存的牛支原体阳性血清和临床血清,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果显示,该方法检测牛布氏杆菌、丝状支原体、牛病毒性腹泻病毒、牛巴氏杆菌和口蹄疫病毒5种病原的阳性血清均为阴性;对已知牛支原体阳性血清的检测最高稀释梯度可达1∶2 048;对临床血清检测,与ELISA的检测结果符合率为94.04%。结果表明,牛支原体抗体胶体金免疫层析试纸条特异性好、敏感性高。可用于牛支原体感染的快速诊断,尤其适用于现场检测。

关键词：牛支原体 P300重组蛋白胶体金免疫层析

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ASFV毒力蛋白MGF360-9L降解宿主蛋白MATR3促进病毒复制的研究

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中国兽医科学 2023年第5期53卷 537-544页

作者：郝雨杨金柯杨博杨行史喜绢张大俊赵登率闫文倩陈玲玲陈国辉别鑫恬郑海学刘湘涛鲍恩东张克山南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染所引起的一种高度致死的传染性疾病。ASFV多基因家族编码的MGF360-9L已被证实是ASFV重要的毒力蛋白,是ASFV逃逸宿主天然免疫应答的关键之一。... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染所引起的一种高度致死的传染性疾病。ASFV多基因家族编码的MGF360-9L已被证实是ASFV重要的毒力蛋白,是ASFV逃逸宿主天然免疫应答的关键之一。本实验室的前期研究基础表明,宿主细胞核基质蛋白3(Matrin 3,MATR3)可能是MGF360-9L的相互作用蛋白之一,但这种相互作用未经验证。此外,MGF360-9L和MATR3之间是否存在相互调控,对于病毒复制或宿主免疫有何意义尚不可知。因此,本研究首先通过免疫共沉淀(Co-immunprecipitation,Co-IP)验证MGF360-9L与MATR3的相互作用;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western-blot)分析ASFV野生型病毒株(ASFV-WT)、ASFV MGF360-9L缺失毒株(ASFV-ΔMGF360-9L)感染或MGF360-9L过表达对MATR3表达的影响;通过RT-qPCR、Western-blot以及分析ASFV荧光重组毒株复制产生的荧光强度去探究外源过表达MATR3对不同ASFV毒株体外复制的影响。结果,在PK-15细胞中,MGF360-9L与MATR3特异性相互作用并剂量依赖性降解MATR3;在MA-104细胞中,外源过表达MATR3显著抑制ASFV-ΔMGF360-9L体外复制,但不影响ASFV-WT体外复制。本研究证实ASFV毒力蛋白MGF360-9L通过降解宿主限制因子MATR3促进ASFV复制,拓展了MGF60-9L的宿主免疫逃逸途径,为进一步探究ASFV的致病机制奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 MGF360-9L MATR3 蛋白相互作用宿主免疫逃逸

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2018-2023年四川开江县口蹄疫、猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体监测与分析

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动物医学进展 2024年第11期45卷 76-82页

作者：潘琴欧云文任绍科张洋邓书明翟佳佳开江县动物疫病预防控制中心四川达州636250 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

为准确掌握2018-2023年四川开江县猪群中口蹄疫(FMD)、猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的免疫效果,从辖区359个场(点)随机采集猪血清3420份,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行FMD、CSF和PRRS免疫抗体检测。结果显示,FMD、CSF和PRRS... 详细信息

为准确掌握2018-2023年四川开江县猪群中口蹄疫(FMD)、猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的免疫效果,从辖区359个场(点)随机采集猪血清3420份,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行FMD、CSF和PRRS免疫抗体检测。结果显示,FMD、CSF和PRRS场(点)阳性率分别为79.94%、89.97%和67.41%,样品阳性率分别为83.92%、91.96%和76.05%,FMD和CSF免疫抗体阳性率逐年呈波浪式整体上升趋势,PRRS呈逐年下降趋势;在不同区域方面,所有乡镇的FMD和CSF样品阳性率均达到农业农村部规定标准,其中淙城街道的FMD和CSF场(点)阳性率、样品阳性率均最高,灵岩镇PRRS样品阳性率未达到农业农村部规定标准;在场点类型方面,屠宰环节的场(点)阳性率显著低于养殖环节(P<0.05),规模场(存栏量≥500头)的场(点)阳性率、样品阳性率均高于适度规模场(存栏量<500头)和散养户;从不同生长阶段来看,种畜样品阳性率均最高,分别为91.82%、95.33%和87.15%;在不同季节方面,FMD和CSF样品阳性率最高为夏季,分别为90.36%和96.70%,最低为春季。监测结果表明,开江县猪群中FMD、CSF和PRRS的整体免疫效果较好,建立了有效的免疫保护屏障,结果为进一步做好3种主要病毒性疫病的科学防控提供了参考依据。

关键词：口蹄疫猪瘟猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体监测与分析

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不同免疫刺激剂的安全性及免疫增强特性评价

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中国兽医科学 2024年第4期54卷 533-540页

作者：周梦婷宋银娟李娜冯雅茹冉多良李斌储岳峰新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

本研究旨在评价不同免疫刺激剂的安全性及免疫增强特性,为后续亚单位疫苗的制备提供佐剂选择依据。本研究利用不同免疫刺激剂皮下免疫小鼠,免疫两次,间隔1周,最后1次免疫后的第7天处死小鼠,观察小鼠脏器大体病变;利用ELISA方法检测小鼠... 详细信息

本研究旨在评价不同免疫刺激剂的安全性及免疫增强特性,为后续亚单位疫苗的制备提供佐剂选择依据。本研究利用不同免疫刺激剂皮下免疫小鼠,免疫两次,间隔1周,最后1次免疫后的第7天处死小鼠,观察小鼠脏器大体病变;利用ELISA方法检测小鼠血清中细胞因子的变化;取注射部位及主要脏器进行组织病理学观察。研究结果表明,免疫刺激剂壳聚糖和HMT13均引起促炎细胞因子IFN-γ显著增加,HMT13和ISA201会引起大量Ig G的产生;此外,壳聚糖刺激还可引起大量IL-17的分泌。本研究通过观察小鼠主要脏器及注射部位的大体和组织病理学变化以及检测小鼠血清中细胞因子的变化等方法评价了免疫刺激剂Alum、壳聚糖、α-半乳糖基神经酰胺、HMT13、ISA201的安全性及免疫增强特性,为后续亚单位疫苗佐剂的选择提供了数据支持及参考依据。

关键词：免疫刺激剂安全性免疫增强特性

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