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微生物学报 2024年第5期64卷 1469-1482页

作者：冯雅茹周梦婷张瑜瑜张格高鹏程冉多良许健储岳峰李斌新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 新疆草食动物新药研究与创制重点实验室新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

致病性支原体具有入侵宿主细胞的能力,这是其发挥致病作用的关键。介导支原体入侵宿主细胞的自身功能蛋白可能是一种潜在的药物或疫苗靶标。【目的】克隆表达牛支原体(Mycoplasma bovis)MBOVPG45_0564基因编码蛋白(命名为LRR5蛋白),并... 详细信息

致病性支原体具有入侵宿主细胞的能力,这是其发挥致病作用的关键。介导支原体入侵宿主细胞的自身功能蛋白可能是一种潜在的药物或疫苗靶标。【目的】克隆表达牛支原体(Mycoplasma bovis)MBOVPG45_0564基因编码蛋白(命名为LRR5蛋白),并探究其在***入侵宿主细胞过程中的作用。【方法】利用NCBI数据库对MBOVPG45_0564基因进行同源性分析,用Discovery Studio Client系统对LRR5蛋白进行蛋白结构预测;原核表达LRR5蛋白并制备其小鼠多克隆抗体,利用免疫电镜对LRR5蛋白进行亚细胞定位;通过平板计数、激光共聚焦显微镜观察LRR5抗体封闭后***对胎牛肺(embryonic bovine lung,EBL)细胞入侵率的变化;将LRR5蛋白偶联至荧光微球表面后,以激光共聚焦显微镜及高内涵活细胞成像系统观察微球进入EBL细胞情况。【结果】MBOVPG45_0564基因在牛支原体属中为保守基因,其编码蛋白LRR5为膜相关蛋白,空间构象呈典型的月牙状,多个重复的亮氨酸基序以超螺旋方式组装并形成螺线管蛋白质结构单元。LRR5抗体封闭后,***对EBL细胞的入侵率显著降低(P<0.05),荧光微球偶联LRR5蛋白后,荧光微球可成功进入EBL细胞。【结论】MBOVPG45_0564基因编码的LRR5蛋白定位在***膜上,在***入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。

关键词：牛支原体 MBOVPG45_0564基因入侵蛋白表达生物学功能

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口蹄疫病毒热驯化及生物学特性分析

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病毒学报 2023年第6期39卷 1670-1676页

作者：刘仲元张振兴张韵卢渊录孙世琪郭慧琛董虎宋建领中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是一种全球性的、感染偶蹄动物的传染病。病毒衣壳对温度,pH敏感,容易在疫苗生产及储存过程中裂解为免疫原性较低的五聚体,影响疫苗的质量。口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)对热敏感... 详细信息

口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是一种全球性的、感染偶蹄动物的传染病。病毒衣壳对温度,pH敏感,容易在疫苗生产及储存过程中裂解为免疫原性较低的五聚体,影响疫苗的质量。口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)对热敏感的机制研究对于疫苗抗原稳定性意义重大。本文通过循环热应激驯化方式诱导基因突变向耐热性发展,经噬斑纯化获得了驯化毒株M3,M9和M10。通过多序列比对分析发现驯化毒株P1区发生氨基酸突变,一步生长曲线表明驯化毒株氨基酸突变基本不影响病毒的复制,而驯化毒株相比野生型毒株衣壳耐热性有显著提高。驯化毒株M10单一位点突变(A1013T)增强衣壳稳定性,表明A1013T位点对于O型FMDV毒株衣壳耐热性的重要性,但机制仍待后期进一步阐明。该研究将为制备耐热性的FMD疫苗提供了理论依据。

关键词：口蹄疫病毒热筛选热稳定性氨基酸突变

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多糖修饰脂质纳米颗粒递药系统的研究进展

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生物工程学报 2024年第12期40卷 4339-4350页

作者：麻玉清柳海云王晓强孙世琪郭慧琛中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 兰州交通大学化学化工学院甘肃兰州730070 兰州交通大学生物与制药工程学院甘肃兰州730070

脂质纳米颗粒递送系统是目前最具有应用前景的药物载体之一,其生物相容性好、无免疫原性且载药效率高。然而,未修饰的脂质纳米颗粒仍存在稳定性差、易水解和易被快速清除的问题。为了克服上述缺点,研究人员对脂质纳米颗粒进行了一系列... 详细信息

脂质纳米颗粒递送系统是目前最具有应用前景的药物载体之一,其生物相容性好、无免疫原性且载药效率高。然而,未修饰的脂质纳米颗粒仍存在稳定性差、易水解和易被快速清除的问题。为了克服上述缺点,研究人员对脂质纳米颗粒进行了一系列的修饰,包括多肽修饰、抗体修饰、配体修饰、核酸适配体修饰、多糖修饰等。其中,多糖作为一类天然聚合物,修饰脂质纳米颗粒后表现出良好的生物相容性,而且还具有靶向目标器官和低毒性等优势。多糖修饰后的脂质纳米颗粒具有在临床治疗中发挥重要作用的潜力。本文综述了多糖修饰脂质纳米颗粒的制备及应用,为进一步研究与开发新型脂质纳米颗粒提供了参考。

关键词：递药系统脂质纳米颗粒多糖修饰脂质纳米颗粒制备多糖应用

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非洲猪瘟病毒跨细胞膜内化过程研究进展

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中国兽医杂志 2023年第5期59卷 8-11页

作者：杨发誉王一张石磊郑海学朱紫祥动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730000 中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃兰州730000

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪、野猪等引起的急性、烈性、出血性传染病,致死率可达100%。ASFV是一种二十面体具备囊膜结构的DNA病毒,其内化过程具备囊膜病毒的特征。本文从ASFV膜蛋白及其功能的角度,总结了膜蛋白参与... 详细信息

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪、野猪等引起的急性、烈性、出血性传染病,致死率可达100%。ASFV是一种二十面体具备囊膜结构的DNA病毒,其内化过程具备囊膜病毒的特征。本文从ASFV膜蛋白及其功能的角度,总结了膜蛋白参与跨膜和内化的过程,旨在加深对ASFV跨膜和内化的认知,对ASF的防控具有积极作用。

关键词：非洲猪瘟病毒囊膜病毒膜融合跨膜膜蛋白

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干扰素刺激基因IFIT1抑制蓝舌病病毒的复制

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病毒学报 2023年第6期39卷 1660-1669页

作者：张国芮康棣王轩莹田占成高闪电关贵全常惠芸薛慧文殷宏独军政中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃农业大学动物医学院兰州730070 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

为了研究干扰素刺激基因1(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1,IFIT1)在蓝舌病病毒1型(Bluetongue virus serotype 1,BTV1)感染复制过程中的作用,首先利用实时定量PCR检测到BTV1感染绵羊睾丸细胞后IFIT1基因的转录水平明显升高,利用RT-PCR方法扩增获得羊IFIT1基因,测序后进行生物信息学分析,将其克隆到质粒载体pcDNA3.1/(+)上,构建重组表达质粒pcDNA3.1-OV-IFIT1,将其转染BHK-21细胞,观察到IFIT1基因在细胞内的成功表达,然后利用BTV1感染质粒pcDNA3.1-OV-IFIT1转染的细胞,从病毒的mRNA转录、蛋白表达和病毒滴度的变化评价IFIT1对BTV1复制的影响。结果显示,IFIT1在细胞中的过表达可显著抑制BTV1复制,相反,敲低IFIT1的表达可促进BTV1的复制。本研究首次报道了干扰素刺激基因IFIT1在BTV1感染复制过程中的作用,这将有助于揭示BTV1和宿主细胞IFIT1的相互作用机制,同时也为抗病毒药物研发提供了理论指导。

关键词： IFIT1 蓝舌病病毒病毒复制抗病毒免疫

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分子伴侣TF促进塞内卡病毒VP2蛋白在大肠杆菌表达

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农业生物技术学报 2023年第9期31卷 1944-1955页

作者：杨锐茹毅郝荣增李亚军杨洋任蕊芳卢炳州毛玉涵张越郑海学张勇赵兴绪甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院/动物疫病防控全国重点实验室中农威特生物科技股份有限公司

A型塞内卡病毒（Senecavirus A, SVA）是一种新近流行的小RNA病毒，严重危害着全球养猪业的健康发展。SVA病毒结构蛋白2（viral structural protein 2, VP2）在诱导机体免疫应答中发挥了重要的作用。为制备可溶性的SVA结构蛋白VP2，并... 详细信息

A型塞内卡病毒（Senecavirus A, SVA）是一种新近流行的小RNA病毒，严重危害着全球养猪业的健康发展。SVA病毒结构蛋白2（viral structural protein 2, VP2）在诱导机体免疫应答中发挥了重要的作用。为制备可溶性的SVA结构蛋白VP2，并系统分析其免疫原性，本研究首先以SVA/CH-FJ-2017毒株基因序列为基础，构建SVA-VP2蛋白重组表达质粒pET28a-SVA-VP2。然后将pET28a-SVA-VP2重组质粒与分子伴侣pTf16质粒共同转入大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）感受态细胞，利用分子伴侣TF（trigger factor）在原核表达系统中促进蛋白可溶性表达的特性，诱导表达可溶性的SVA-VP2重组蛋白。纯化目标蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定后，免疫BALB/c小鼠（Mus musculus），通过间接ELISA检测血清抗体水平，病毒中和试验测定中和抗体滴度，流式细胞术检测分析脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群，以及脾脏淋巴细胞增殖及细胞因子产生的情况。结果表明，利用分子伴侣TF16成功制备了可溶性的VP2重组蛋白，并且VP2重组蛋白能够与SVA阳性血清发生特异性免疫反应，免疫组小鼠的血清抗体效价可达1∶32 000，中和抗体水平可达1∶128，免疫组小鼠脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞百分比含量极显著高于对照组（P<0.001），干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）、白细胞介素-2（interleukin-2, IL-2）、IL-4和IL-10等细胞因子表达水平极显著高于对照组（P<0.001）。本研究成功利用分子伴侣TF共表达制备了可溶性的重组VP2蛋白，且重组VP2蛋白在体内、外试验中均具有良好的免疫原性，能够引发机体产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，为SVA亚单位疫苗和诊断制剂的研制提供了实验材料和理论依据。

关键词： A型塞内卡病毒(SVA) 病毒结构蛋白2(VP2) 原核表达分子伴侣可溶性表达免疫原性

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稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

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畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1159-1169页

作者：荆扬王玉淼李洋常辉马志倩李志伟肖书奇中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 塔里木大学动物科学与技术学院阿拉尔843300

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该... 详细信息

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒过表达细胞系 ORF6基因 M蛋白 MARC-145细胞

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猪流行性腹泻疫苗研究进展

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中国畜牧兽医 2024年第11期51卷 5004-5013页

作者：张洋欧云文马春霞任绍科潘琴邓书明翟佳佳杨山山开江县动物疫病预防控制中心达州636250 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 达州中医药职业学院达州635000

近年来,随着中国养猪事业的高速发展,猪流行性腹泻(PED)已成为猪群的重要传染病,PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的,以腹泻、呕吐、脱水为特征的急性病毒性传染病。PED主要通过呼吸道和消化道传播,哺乳仔猪最易感,死亡率可高达100%,... 详细信息

近年来,随着中国养猪事业的高速发展,猪流行性腹泻(PED)已成为猪群的重要传染病,PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的,以腹泻、呕吐、脱水为特征的急性病毒性传染病。PED主要通过呼吸道和消化道传播,哺乳仔猪最易感,死亡率可高达100%,给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV是单股正链RNA病毒,具有4个主要结构蛋白、16个非结构蛋白和1个辅助蛋白ORF3。自2010年以来,该病毒变异株传播范围不断扩大,流行趋势日益复杂,经典毒株(CV777)相关疫苗已无法提供有效保护。因此,开发更加安全、有效的疫苗已迫在眉睫。灭活疫苗安全性高,但需多次接种且保护效果不佳;弱毒疫苗免疫原性良好,但存在毒力返祖风险;亚单位疫苗不携带病毒其他蛋白结构,使用安全、价格便宜,但其免疫原性差;重组病毒活载体疫苗可诱导产生特异性免疫反应,但安全性不足;重组细菌活载体疫苗能口服刺激机体黏膜免疫,并且载体具有佐剂作用,但其免疫效率不高;转基因植物疫苗安全稳定,但表达量低且研发周期长;核酸疫苗研发周期短、灵活性高,但安全性不高、外源基因易与宿主基因重组。随着相关研究的深入,各类疫苗研究已取得重要研究成果。笔者就PED灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、重组病毒活载体疫苗、重组细菌活载体疫苗、转基因植物疫苗、核酸疫苗进行综述,以期为PED的防治和新型疫苗研发提供参考。

关键词：猪流行性腹泻猪流行性腹泻病毒(PEDV) 流行特点疫苗

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HIF-1α在病原体感染中的作用研究进展

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畜牧兽医学报 2024年第6期55卷 2357-2367页

作者：张正洋宋银娟储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046 农业农村部动物病原生物学重点实验室农业农村部反刍动物重大疫病防控重点实验室(西部) 兰州730046

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞应对缺氧反应的中枢调节因子,稳定的HIF-1α具有多种功能,参与血管生成、代谢调节、细胞自噬及细胞凋亡等多种生物学过程。HIF-1α的稳定性受到多种信号的调节,包括氧气水平、病原体感染以及代谢中间体... 详细信息

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞应对缺氧反应的中枢调节因子,稳定的HIF-1α具有多种功能,参与血管生成、代谢调节、细胞自噬及细胞凋亡等多种生物学过程。HIF-1α的稳定性受到多种信号的调节,包括氧气水平、病原体感染以及代谢中间体等。近年来,越来越多的研究表明,HIF-1α在感染性疾病中起着重要作用。因此,本文就HIF-1α稳定性的调节机制及其在病毒、细菌等病原体感染和相关疾病发生发展中的作用进行讨论和总结,旨在为进一步解析HIF-1α在防御多种病原体感染中的作用和其作为靶向治疗的潜在靶点等相关研究提供参考。

关键词： HIF-1α 稳定性病原体感染作用机制

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口蹄疫病毒Asia1型猪源中和抗体的筛选与抗原表位鉴定

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畜牧兽医学报 2024年第11期55卷 5211-5221页

作者：董开恒黄书伦李凤娟李坤刘果张强包慧芳李洪炫卢曾军张小丽甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州大学动物医学与生物安全学院国家口蹄疫参考实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流... 详细信息

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流式细胞术分选免疫猪PBMCs中的抗原特异性B细胞,通过巢式PCR扩增单个B细胞IgG抗体重链与轻链可变区基因序列,分别构建IgG抗体重链与轻链表达质粒,将其共转染CHO-S细胞进行抗体表达;通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验(VNT)验证抗体反应性和中和活性,利用免疫印迹、中和抗体逃逸突变株筛选鉴定中和抗体所识别的抗原表位类型和抗原表位关键氨基酸。结果显示:获得了5株反应性良好的Asia1型FMDV特异性抗体,其中PD3和PD7为中和抗体,两株中和抗体识别相同表位,关键氨基酸为VP2蛋白72位残基(D)。本研究首次获得Asia1型FMDV特异性猪源中和抗体,鉴定VP272D是中和表位的关键氨基酸,进一步丰富了Asia1型FMDV抗原位点信息,为FMDV Asia1型分子疫苗和新诊断检测技术研究的奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 Asia1型猪源单克隆抗体抗原表位

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