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生物工程学报 2024年第5期40卷 1536-1547页

作者：陈娇王亚娟陈志华茹毅郑海学裴晶晶中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046 兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050

本研究旨在制备抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)单克隆抗体,以分析在转染和感染过程中NS1蛋白的表达和分布情况,并评估其在免疫沉淀反应中的应用价值。将NS1基因片段构建... 详细信息

本研究旨在制备抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)单克隆抗体,以分析在转染和感染过程中NS1蛋白的表达和分布情况,并评估其在免疫沉淀反应中的应用价值。将NS1基因片段构建至原核表达质粒,经大肠杆菌表达、亲和层析纯化后得到NS1蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠后,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技术筛选能稳定分泌NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并将该单抗用于间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)与免疫印迹(Western blotting)检测,分析RSV NS1在过表达细胞和病毒感染细胞中的表达与分布情况,评估该单抗在免疫沉淀反应中的应用价值。结果发现,RSV NS1蛋白在大肠杆菌中成功表达及纯化,免疫小鼠后,获得了一株特异性强、反应性好的RSV NS1单抗,其亚型为IgG1,且抗体效价可达1:15360000;使用该单抗鉴定出RSV NS1蛋白在转染和感染细胞中正常表达,IFA结果表明,NS1主要分布在细胞质与细胞核;并验证该单抗在免疫沉淀反应中作为捕获抗体能够特异性结合细胞中表达的NS1蛋白。本研究经原核表达系统成功获得RSV NS1蛋白,成功制备出抗RSV NS1单抗,该抗体能特异性识别NS1蛋白,可被应用于免疫沉淀方法,为NS1蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：呼吸道合胞病毒 NS1蛋白原核表达单克隆抗体免疫沉淀

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猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗的制备及发酵工艺研究

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中国兽医科学 2024年第10期54卷 1351-1358页

作者：王运航吕熙段梦迪魏甜李毅张雅雅陈相杨郭慧琛孙世琪白满元敬晓棋榆林学院生命科学学院陕西榆林719000 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

为制备猪圆环病毒2d型(PCV2d)病毒样颗粒(VLPs)疫苗并对其免疫效果进行评价。本研究采用原核表达系统表达PCV2d Cap蛋白,并对其发酵工艺条件进行了优化,去除His-SUMO标签使其体外自组装形成VLPs,通过SDS-PAGE和Western-blot进行验证,采... 详细信息

为制备猪圆环病毒2d型(PCV2d)病毒样颗粒(VLPs)疫苗并对其免疫效果进行评价。本研究采用原核表达系统表达PCV2d Cap蛋白,并对其发酵工艺条件进行了优化,去除His-SUMO标签使其体外自组装形成VLPs,通过SDS-PAGE和Western-blot进行验证,采用透射电镜和纳米粒度仪进行表征,将验证正确的VLPs免疫小鼠,测定其抗体水平和细胞因子水平。结果显示,在0.5 mmol/L IPTG、N源补料速率为12%时,蛋白表达量最高,利用透射电镜、纳米粒度仪进行表征鉴定,发现PCV2d可自组装形成VLPs,粒子直径约为20~25 nm。PCV2d VLPs与ISA 201佐剂混合免疫小鼠,特异性抗体滴度达到1∶512以上,中和抗体滴度达到1∶32以上,IL-4和IFN-γ细胞因子水平均可达到80 pg/m L,且明显高于PBS组。综上所述,本研究利用原核表达系统构建表达并成功获得PCV2d VLPs,且可以诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫,这为猪圆环病毒2d型疫苗及猪圆环病毒多价疫苗的研制奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2d型病毒样颗粒大肠杆菌表达系统发酵工艺

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DNA损伤修复酶OGG1/MTH1抑制剂对非洲猪瘟病毒复制的影响

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生物工程学报 2024年第7期40卷 2136-2149页

作者：张小强樊洁杨吉飞付竞生吴梦丽邵程祥关贵全殷宏刘志杰牛庆丽中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家非洲猪瘟区域实验室(兰州) 甘肃兰州730046 扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 西北民族大学基础医学院甘肃兰州730030

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种动物疫病。2018年传入我国后迅速波及国内多个省份,给我国养猪业带来了巨大的冲击。由于对ASFV致病机制了解有限,导致ASF疫苗及抗病毒药... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种动物疫病。2018年传入我国后迅速波及国内多个省份,给我国养猪业带来了巨大的冲击。由于对ASFV致病机制了解有限,导致ASF疫苗及抗病毒药物的研发遇到了极大挑战。本课题组前期研究发现,ASFV感染能引起宿主细胞内的氧化损伤应答,并且DNA氧化损伤修复酶在ASFV的感染中发挥重要作用,因此本研究采用RNA干扰、RT-q PCR、Western blotting、红细胞吸附(hemadsorption,HAD)、流式细胞技术等生物学方法,验证8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1)/8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶1(8-oxoguanine nucleoside triphos-phatase,MTH1)小分子抑制剂对ASFV复制的影响,以评估靶向DNA氧化损伤修复酶的抗ASFV感染效果。本研究为抗非洲猪瘟药物的研发提供了借鉴及参考。

关键词：非洲猪瘟抗病毒药物碱基切除修复 8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1) 8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶1(MTH1)

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激活标志物CD69蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2025年

作者：徐娜张芷盈杜星南于黛辉郑海学陈霞伍国强兰州理工大学生命科学与工程学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室华南农业大学兽医学院

为了评估原核表达的猪源CD69蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值，以pET-32a(+)为原核表达载体，猪源CD69基因为目的基因，构建重组质粒pET-32a-CD69，针对大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达；通过变性、复性等方法成功纯化蛋白... 详细信息

为了评估原核表达的猪源CD69蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值，以pET-32a(+)为原核表达载体，猪源CD69基因为目的基因，构建重组质粒pET-32a-CD69，针对大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达；通过变性、复性等方法成功纯化蛋白后，将纯化的CD69蛋白与佐剂按1∶1的比例混合，多次免疫雄性BALB/c小鼠制备多克隆抗体，并用免疫印迹试验(Western-blot)与酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)进行鉴定。结果表明，重组的CD69以包涵体形式表达，分子质量约为35 kDa；通过ELISA测定鼠源多克隆抗体效价，结果显示效价达到1∶64 000以上；Western-blot结果表明，该多克隆抗体表现出良好的反应性和特异性。激活标志物CD69蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备，为今后我国猪产业的发展与猪相关疾病检测提供了帮助。

关键词： CD69基因原核表达蛋白纯化多克隆抗体

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口蹄疫病毒Asia1型猪源中和抗体的筛选与抗原表位鉴定

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畜牧兽医学报 2024年第11期55卷 5211-5221页

作者：董开恒黄书伦李凤娟李坤刘果张强包慧芳李洪炫卢曾军张小丽甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州大学动物医学与生物安全学院国家口蹄疫参考实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流... 详细信息

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流式细胞术分选免疫猪PBMCs中的抗原特异性B细胞,通过巢式PCR扩增单个B细胞IgG抗体重链与轻链可变区基因序列,分别构建IgG抗体重链与轻链表达质粒,将其共转染CHO-S细胞进行抗体表达;通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验(VNT)验证抗体反应性和中和活性,利用免疫印迹、中和抗体逃逸突变株筛选鉴定中和抗体所识别的抗原表位类型和抗原表位关键氨基酸。结果显示:获得了5株反应性良好的Asia1型FMDV特异性抗体,其中PD3和PD7为中和抗体,两株中和抗体识别相同表位,关键氨基酸为VP2蛋白72位残基(D)。本研究首次获得Asia1型FMDV特异性猪源中和抗体,鉴定VP272D是中和表位的关键氨基酸,进一步丰富了Asia1型FMDV抗原位点信息,为FMDV Asia1型分子疫苗和新诊断检测技术研究的奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 Asia1型猪源单克隆抗体抗原表位

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O型口蹄疫病毒3D突变毒株的构建及其生物学特性分析

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中国兽医科学 2025年

作者：朱兆宇范许许裴丹诗王一卓何路李熙忠任青峰郑海学李伟伟郜原甘肃农业大学生命科学技术学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室河南农业大学动物医学院

本研究利用反向遗传技术构建O型口蹄疫病毒（FMDV）3D蛋白突变毒株rFMDV-M403A，并分析了其生物学特征。结果表明，重组病毒在传代过程中氨基酸能稳定突变；病毒滴度显示，突变毒株生长速度较野生毒株有所降低，重组病毒毒力显著低于野... 详细信息

本研究利用反向遗传技术构建O型口蹄疫病毒（FMDV）3D蛋白突变毒株rFMDV-M403A，并分析了其生物学特征。结果表明，重组病毒在传代过程中氨基酸能稳定突变；病毒滴度显示，突变毒株生长速度较野生毒株有所降低，重组病毒毒力显著低于野生毒株；乳鼠感染试验结果显示，突变毒株会使乳鼠存活率提高，肝中病毒载量和组织病变显著降低。该研究对口蹄疫病毒致病机理的认识及制定防控措施具有重要意义，同时，也为后续开发口蹄疫基因工程疫苗奠定了坚实的理论基础。

关键词： O型口蹄疫病毒反向遗传操作 3D蛋白突变生物学特性

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EphA2基因敲除和过表达BHK-21细胞系的构建及其对口蹄疫病毒复制的影响

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中国兽医科学 2025年

作者：李熙忠范许许朱兆宇裴丹诗王一卓何路任青峰郑海学李伟伟郜原甘肃农业大学生命科学与技术学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室河南农业大学动物医学院

构建促红细胞生成素肝细胞受体A2（Erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2）基因敲除和过表达的BHK-21细胞系，探究其对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建EphA2基因敲除的BHK-21细胞系，利用慢病毒感染构建EphA2基因过表达的BHK-21细胞系。经嘌呤霉素筛选及单克隆挑取，成功获得稳定细胞系。随后，以野生型BHK-21细胞为对照，将FMDV分别感染上述细胞系，采用实时荧光定量 PCR、蛋白质免疫印迹等方法检测病毒核酸和蛋白水平。结果表明，EphA2基因敲除后，FMDV在BHK-21细胞中的复制显著受到抑制，病毒核酸和蛋白表达量明显降低；而EphA2基因过表达时，FMDV复制增强。本研究揭示了EphA2基因在FMDV复制过程中具有重要作用，为深入理解FMDV的感染机制及防控策略提供了理论依据。

关键词： CRISPR/Cas9 EphA2 口蹄疫病毒

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非洲猪瘟病毒抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外复制的研究

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中国兽医科学 2023年第11期53卷 1341-1347页

作者：赵登率张大俊史喜绢杨行郑海学刘湘涛张克山中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室、国家非洲猪瘟区域实验室甘肃兰州730046

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)和猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪病毒性传染病,对全球养猪业造成严重危害。随着PRRSV与ASFV的流行,增加了二者混合感染的可能性。前期工作已表明PRRSV在体外可以抑制ASFV复制。然而,ASFV是否影响PRRSV体外复制尚不可知。因此,本研究通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫印迹试验(Western-blot)检测了PRRSV疫苗株JXA1-R和ASFV弱毒株混合感染后PRRSV在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)和猪骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)的复制水平以及CD163的mRNA水平。结果显示,混合感染抑制了PRRSV的复制水平,并降低CD163的mRNA水平。本研究证明ASFV可抑制PRRSV在体外的复制,并抑制CD163的mRNA水平。该结果为PRRSV和ASFV混合感染的防控提供了理论依据。

关键词：非洲猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染抑制

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宿主蛋白VDAC1抑制口蹄疫病毒复制的机制研究

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中国兽医科学 2024年第12期54卷 1563-1568,I0001页

作者：马柯薛巧刘鹏飞朱紫祥李宏斌刘会胜郑海学兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州1730050 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染偶蹄类动物(如猪、牛和羊)而引起的急性、高度传染性疾病。其非结构蛋白3D^(pol)在FMDV复制和致病过程中发挥着重要作用。为探究宿主蛋白与3D^(pol)蛋白的作用机制,本研究... 详细信息

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染偶蹄类动物(如猪、牛和羊)而引起的急性、高度传染性疾病。其非结构蛋白3D^(pol)在FMDV复制和致病过程中发挥着重要作用。为探究宿主蛋白与3D^(pol)蛋白的作用机制,本研究首先利用酵母双杂交和免疫共沉淀试验鉴定出VDAC1与FMDV3D^(pol)相互作用,再运用过表达VDAC1和抑制剂试验发现VDAC1通过自噬途径抑制3D^(pol)蛋白的表达,最后发现下调VDAC1后对FMDV的复制有促进作用,表明VDAC1靶向3D^(pol)蛋白抑制FMDV复制。本研究揭示了宿主蛋白抑制FMDV复制的新机制,本研究为口蹄疫防控提供了新的方向和靶点。

关键词：口蹄疫病毒 3D^(pol) 宿主蛋白VDAC1 自噬

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宿主OAS2蛋白抑制非洲猪瘟病毒体外复制的研究

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中国兽医科学 2024年第5期54卷 577-583页

作者：赵思越史喜绢杨行张大俊赵登率陈国辉陈玲玲闫文倩别鑫恬赵美玉李平郑海学张克山郜原甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为了探究宿主蛋白2′,5′-寡腺苷酸合成酶2(OAS2)与非洲猪瘟病毒(ASFV)复制之间的关系,本研究通过蛋白免疫印迹(Western-blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了ASFV感染对宿主OAS2的调控作用;构建并合成OAS2真核表达质粒以及siRNA干扰... 详细信息

为了探究宿主蛋白2′,5′-寡腺苷酸合成酶2(OAS2)与非洲猪瘟病毒(ASFV)复制之间的关系,本研究通过蛋白免疫印迹(Western-blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了ASFV感染对宿主OAS2的调控作用;构建并合成OAS2真核表达质粒以及siRNA干扰序列,通过RT-qPCR、Western-blot方法探究在MA-104细胞中外源过表达OAS2及在PAMs细胞中下调OAS2表达对ASFV体外复制的影响。结果显示,ASFV感染PAMs细胞后,OAS2的蛋白水平和转录水平皆上调,并且外源过表达OAS2显著抑制了ASFV的复制,下调OAS2表达促进了ASFV的复制。本研究通过对宿主蛋白OAS2进行过表达和敲低,证实了OAS2可以抑制ASFV体外复制,该结果为进一步研究宿主对ASFV的抗病毒免疫研究提供了理论基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 OAS2 天然免疫抑制

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