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生物技术通报 2025年第1期41卷 39-48页

作者：尹号尤留超韩瑞高鹏程付磊储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具,而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一,传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题,而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白(SSAP)表现出了远超内... 详细信息

基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具,而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一,传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题,而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白(SSAP)表现出了远超内源性重组途径的基因组编辑效率,该蛋白具有单链DNA结合活性、介导基因组定向重组的特点,使其成为目前极具潜力的基因组编辑工具。本文主要对同源重组基本原理、噬菌体源SSAP介导的同源重组途径的基本元件、重组机制模型以及应用策略展开概述,旨在为进一步解析单链DNA退火蛋白介导的同源重组过程提供帮助,为研究更多细菌基因功能、致病机制以及开发工程菌株提供技术支撑,也为缺乏基因编辑方法的细菌提供技术参考。

关键词：细菌单链DNA退火蛋白同源重组机制应用

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赤羽病病毒N蛋白原核表达及单克隆抗体的制备

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生物工程学报 2024年第5期40卷 1548-1558页

作者：林永玉石正旺罗俊聪朱昱茜席韬周静张帆石鑫泰王川田宏甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enz... 详细信息

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞。经3次亚克隆筛选得到两株特异性针对AKAV N蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2C9与5E9。通过ELISA、免疫印迹(Western blotting)、间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)对其进行鉴定。结果显示,成功筛选到特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体。IFA发现其与AKAV N蛋白具有良好的反应性,亚型鉴定试剂盒鉴定2C9 mAb重链为IgG2b型,轻链为κ链;5E9 mAb重链为IgG1型,轻链为κ链;ELISA检测效价均为1:4 096 000。本研究成功制备了两株特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体,为赤羽病诊断方法的开发、疾病的防控以及AKAV N蛋白功能的研究奠定了基础。

关键词：赤羽病病毒 N蛋白原核表达单克隆抗体

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结核分枝杆菌调控树突状细胞抗原提呈的分子机制研究进展

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微生物学报 2025年第5期65卷 1905-1917页

作者：马慧宋银娟马玲储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州甘肃省疾病预防控制中心甘肃兰州

结核病是一种古老且严重危害全球人类和动物健康的人兽共患病,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是引起结核病的主要病原体。树突状细胞(dendritic cell,DC)作为连接机体固有免疫应答和适应性免疫应答的桥梁,凭借其强大的... 详细信息

结核病是一种古老且严重危害全球人类和动物健康的人兽共患病,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是引起结核病的主要病原体。树突状细胞(dendritic cell,DC)作为连接机体固有免疫应答和适应性免疫应答的桥梁,凭借其强大的抗原提呈功能激活宿主适应性免疫反应,以抵御病原体的进一步感染,在控制Mtb感染中发挥重要作用。近年来,越来越多的研究表明Mtb可通过调控DC分化和成熟、干扰吞噬作用和自噬过程、抑制抗原提呈相关分子的表达等多种策略逃避宿主免疫杀伤,从而引起持续性感染。本文就目前Mtb调控DC抗原提呈分子机制的研究进展进行梳理,以期为进一步深入研究Mtb-DC互作机制及结核病防控策略提供参考。

关键词：结核分枝杆菌树突状细胞抗原提呈分子机制

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偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒制备及免疫原性评价

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生物工程学报 2024年第12期40卷 4509-4520页

作者：张越茹毅郝荣增杨洋赵陇和李亚军杨锐卢炳州郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒p30蛋白的纳米颗粒抗原,并对其免疫原性进行评价,为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供实验基础。首先,将编码p30蛋白和SpyTag标签的基因序列融合后插入pCold-I载体,得到pCold-p30质粒。将编码SpyCatche... 详细信息

本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒p30蛋白的纳米颗粒抗原,并对其免疫原性进行评价,为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供实验基础。首先,将编码p30蛋白和SpyTag标签的基因序列融合后插入pCold-I载体,得到pCold-p30质粒。将编码SpyCatcher与铁蛋白的基因序列融合后插入pET-28a(+)载体得到pET-F-np质粒,并分别在大肠杆菌中诱导表达。然后,将亲和层析纯化后的p30蛋白与铁蛋白在体外偶联结合,用分子筛纯化后得到偶联p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒F-p30,利用粒径仪、透射电镜观察形态结构。将F-p30纳米颗粒蛋白免疫小鼠,评估其体液和细胞免疫应答。结果表明,本研究成功制备出偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒,颗粒结构约20nm。F-p30在体外能被小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)高效摄取,与p30蛋白相比,F-p30纳米颗粒免疫小鼠诱导产生更高水平的特异性抗体和细胞因子,更有利于刺激淋巴结滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell,T_(FH))、生发中心B细胞(germinal center B cell,GCB)和脾脏CD4^(+)及CD8^(+)T淋巴细胞的增殖。综上,本研究成功制备了偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒,能显著增强p30蛋白的免疫原性,为非洲猪瘟疫苗的研究奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟 p30蛋白铁蛋白纳米颗粒免疫原性

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三种表达口蹄疫病毒抗原蛋白的DNA质粒及其mRNA在不同细胞系中表达效率分析

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生物工程学报 2025年

作者：江丽馨柳海云刘一凡麻玉清孙世琪郑泽中郭慧琛华南农业大学兽医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

口蹄疫是目前全球范围内最重要的动物传染病之一，所有偶蹄动物均易感。疫苗免疫是口蹄疫防控的首要选择。mRNA疫苗可以在体外快速设计合成和大规模生产，且能够诱导高效的保护性免疫应答，具有开发速度快、易制备、生物安全风险低等优... 详细信息

口蹄疫是目前全球范围内最重要的动物传染病之一，所有偶蹄动物均易感。疫苗免疫是口蹄疫防控的首要选择。mRNA疫苗可以在体外快速设计合成和大规模生产，且能够诱导高效的保护性免疫应答，具有开发速度快、易制备、生物安全风险低等优点。其中，非编码区的设计是增强mRNA疫苗表达和效力的关键。为了获取获得高效的FMD mRNA疫苗，本研究体外合成了3种具有不同非编码区的口蹄疫P12A3C DNA与对应的mRNA，通过比较其在不同时间点和细胞系中的表达量差异，发现mRNA P12A3C-UTR3表达量优异且普适性最好。本研究为口蹄疫mRNA疫苗的研制奠定了基础，也为高效mRNA的序列设计提供了理论依据。

关键词：口蹄疫病毒非复制型mRNA 非编码区蛋白表达

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非洲猪瘟病毒R298L基因缺失毒株的构建及其致病性与免疫原性评价

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中国兽医科学 2025年第3期55卷 285-290页

作者：范许许李伟伟朱兆宇裴丹诗王一卓何路李熙忠任青峰郑海学朱紫祥中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为了探究非洲猪瘟病毒(ASFV)R298L基因的功能,解析ASFV的致病机制,为基因缺失减毒疫苗的研发提供候选毒株,首先利用同源重组技术构建R298L基因缺失的非洲猪瘟病毒株ASFV-ΔR298L,随后通过动物实验在猪体内比较ASFV-ΔR298L与亲本毒株ASF... 详细信息

为了探究非洲猪瘟病毒(ASFV)R298L基因的功能,解析ASFV的致病机制,为基因缺失减毒疫苗的研发提供候选毒株,首先利用同源重组技术构建R298L基因缺失的非洲猪瘟病毒株ASFV-ΔR298L,随后通过动物实验在猪体内比较ASFV-ΔR298L与亲本毒株ASFV CN/GS/2018致病性和免疫应答水平的差异。结果表明,感染亲本毒株的动物发热严重,在感染后13 d内全部死亡,解剖学观察显示多器官发生严重的病变,而感染ASFV-ΔR298L重组病毒的动物发热水平显著下降,在观察期内全部存活,组织器官未发生病变,并且在后期产生较高水平的中和抗体。以上数据为解析R298L病毒蛋白的功能和阐明非洲猪瘟病毒的致病机制提供了理论依据,为基因缺失候选疫苗的研制提供了参考。

关键词：非洲猪瘟病毒 R298L基因缺失毒株致病性免疫保护

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羊痘病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制与初步应用

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畜牧兽医学报 2025年

作者：何印娣石正旺石鑫泰陈婕廖焕程张帆罗俊聪朱昱茜席韬李帅鹏王川田宏郑海学甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

旨在建立一种快速、简便、特异、灵敏的羊痘病毒抗体的通用型胶体金检测方法。通过原核表达、纯化获得羊痘病毒122重组蛋白，并制备122蛋白多克隆抗体。将122蛋白与胶体金偶联，作为金标抗原，再将122蛋白及兔多克隆抗体包被在硝酸纤维... 详细信息

旨在建立一种快速、简便、特异、灵敏的羊痘病毒抗体的通用型胶体金检测方法。通过原核表达、纯化获得羊痘病毒122重组蛋白，并制备122蛋白多克隆抗体。将122蛋白与胶体金偶联，作为金标抗原，再将122蛋白及兔多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜（NC）上，分别作为检测线（T线）和质控线（C线），经条件优化，研制成检测羊痘病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条。结果表明，成功获得122重组蛋白，大小约为32 ku，胶体金试纸条可在12 min特异性检测到羊痘病毒抗体；与其他常见家畜疫病病原阳性血清无交叉反应；检测SPPV、LSDV和GTPV阳性血清的灵敏度分别为1:64、1:128和1:128，与市售羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒（效价1:128、1:256和1:256）的敏感性相当；对130份临床血清样品的检测与商品化试剂盒检测结果进行比较，两者的kappa值为0.93，为高度一致。本研究成功研制了羊痘病毒抗体通用型胶体金免疫层析试纸条，具有较高的敏感性和特异性，且具有成本低、检测快速、操作简便、结果容易判断等特点，对羊痘现场检测具有实际应用价值。

关键词：羊痘病毒 122蛋白多克隆抗体胶体金试纸条

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基于天蚕素D的新型抗病毒多肽对猪繁殖呼吸综合征病毒的抑制作用

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生物工程学报 2025年

作者：臧浩月彭婕郭慧琛孙世琪曾巧英周静静甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

由猪繁殖呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）引发的猪繁殖呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）是目前危害养猪业的主要疾病之一。本研究旨在设计优化天然抗菌肽，筛选具有显著抑制PRRSV活性的抗病毒多肽，为PRRS防控制剂的研发提供新思路。将天蚕素D（cecropin D， CD）为母肽，通过氨基酸替换策略设计了CD-2、CD-3、CD-4这3个衍生物，利用固相合成技术合成CD及其衍生物，并使用质谱（mass spectrometry， MS）和反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography， RP-HPLC）进行多肽的序列鉴定、纯化和纯度分析。通过圆二色谱研究多肽二级结构，使用CellTiter 96?AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(CellTiter 96?AQueous one solution cell proliferation assay， MTS)测定多肽细胞毒性。通过蛋白免疫印迹（Western blotting， WB）、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR）以及间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay， IFA）研究多肽对PRRSV的抗病毒活性及作用阶段。MS以及RP-HPLC结果表明，CD及其衍生物被成功合成，且纯度高达95%。圆二色谱分析结果显示，CD衍生物在细胞膜模拟环境中表现出更稳定且丰富的α螺旋结构。MTS结果表明，所有被测多肽在100 μg/mL的工作浓度下的细胞毒性可忽略。多肽抗PRRSV的作用阶段试验结果显示，衍生多肽在病毒侵入阶段的抗病毒活性较母肽显著增强，说明通过引入赖氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，增强了衍生肽的疏水作用和正电荷，进而增强了衍生多肽在侵入阶段的抗PRRSV活性。以上结果为抗病毒多肽的应用及结构优化提供了理论基础，可为PRRSV的防控提供新的思路。

关键词：抗菌肽抗病毒活性阳离子氨基酸疏水性氨基酸猪繁殖呼吸综合征病毒

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口蹄疫病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达与鉴定

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南京农业大学学报 2025年

作者：李志要尹双辉郭慧琛鲍恩东南京农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

[目的]预防和控制严重影响畜牧业发展的口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）灭活苗在其病毒增殖生产过程中依然存在病毒泄露风险，研发具有与病毒粒子结构相似，且不含有核酸的病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）... 详细信息

[目的]预防和控制严重影响畜牧业发展的口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）灭活苗在其病毒增殖生产过程中依然存在病毒泄露风险，研发具有与病毒粒子结构相似，且不含有核酸的病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）、并通过毕赤酵母真核表达系统进行表达，来生产成本更加低廉的理想FMDV VLPs疫苗。[方法]为此，本研究首先将FMDV的VP0、VP3和VP1表达盒插入到同一个pPink-HC质粒上，再电转毕赤酵母以制备FMDV VLPs。[结果]试验结果显示，重组菌经过甲醇诱导后，蛋白免疫印记（Western blot，WB）可以检测到目的蛋白的表达；破碎离心后上清液经过蔗糖梯度离心可以分离得到纯化后的VLPs；通过动态光散射法（Dynamic light scattering，DLS）和透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）检测，可以观察到直径为30 nm的球形颗粒；通过ELISA检测，VLPs呈现出良好反应，这充分表明所制备的VLPs具备抗原性。VLPs经过ELISA检测后具有良好的反应，说明制备的VLPs具有抗原性。[结论]上述结果说明，采用单独表达VP0、VP3和VP1的方式在毕赤酵母中可成功制备FMDV VLPs，这为FMD疫苗的发展及其他小RNA病毒样颗粒的制备提供了实验依据。

关键词：口蹄疫病毒病毒样颗粒真核表达毕赤酵母

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宿主线粒体通道蛋白促进干扰素应答抑制口蹄疫病毒复制的分子机制

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微生物学报 2025年

作者：蔡镇远陈文哲杨发誉魏衍全何继军郑海学包世俊朱紫祥甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

口蹄疫(foot-and-mouth disease， FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus， FMDV)感染偶蹄动物引起的一种烈性动物传染病。FMDV为单股正链无囊膜RNA病毒，具有二十面体对称结构。FMDV入侵宿主会引起宿主的先天性免疫和适应... 详细信息

口蹄疫(foot-and-mouth disease， FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus， FMDV)感染偶蹄动物引起的一种烈性动物传染病。FMDV为单股正链无囊膜RNA病毒，具有二十面体对称结构。FMDV入侵宿主会引起宿主的先天性免疫和适应性免疫，FMDV现已经进化出来多种途径进行免疫逃避。FMDV感染致病机制复杂，参与调控病毒感染复制的宿主因子认知仍然非常有限。宿主线粒体通道蛋白(voltagedependent anion-selective channel 2， VDAC2)是一种线粒体通道蛋白，有关VDAC2对FMDV复制调控的具体机制并不清楚。【目的】确证VDAC2与FMDV间的调控作用，揭示VDAC2抑制FMDV复制的分子机制。【方法】通过间接免疫荧光方法确定VDAC2在细胞内的定位；利用Western blotting以及荧光定量PCR方法检测FMDV对VDAC2蛋白水平以及转录水平的影响;在BHK-21细胞上利用病毒滴度测定过表达VDAC2对FMDV复制的影响；利用qPCR方法检测上调或下调VDAC2后FMDV感染对细胞内IL-1β、ISG15、OAS1、mtDNA和gDNA水平的影响。【结果】结果显示VDAC2亚细胞定位于细胞质中；FMDV感染可以降低VDAC2表达；过表达VDAC2显著抑制FMDV复制，并呈现剂量依赖关系；干扰VDAC2能够促进FMDV复制；过表达VDAC2可增强FMDV诱导的IFN-Ⅰ反应；干扰VDAC2可抑制FMDV诱导的IFN-Ⅰ反应；过表达VDAC2可以促进mtDNA的释放。【结论】本研究表明FMDV感染可以下调VDAC2转录与蛋白表达，因为VDAC2可通过调节mtDNA释放促进IL-1β、ISG15和OAS1等抗病毒因子的表达发挥抗病毒作用。本研究表明FMDV入侵宿主细胞时，宿主细胞可以通过VDAC2增强IFN-Ⅰ反应对病毒复制进行调控，发挥抗病毒作用。

关键词：口蹄疫病毒 VDAC2蛋白 IFN应答

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