检索结果-内蒙古大学图书馆

口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株基因组全长感染性克隆的构建

畜牧兽医学报 2009年第5期40卷 706-711页

作者：李平花白兴文卢曾军孙普郭建宏曹伟军刘湘涛殷宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 甘肃农业大学兰州730070

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3′端覆盖口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBluescriptSK+载体上。利用融合PCR扩增到基因组5′端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp)... 详细信息

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3′端覆盖口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBluescriptSK+载体上。利用融合PCR扩增到基因组5′端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体。最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆。以构建的FMDV Asia1/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒。该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 Asia1/JS/China/2005株全长cDNA 转录物RNA 病毒拯救

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用protein G纯化口蹄疫病毒单克隆抗体的特性分析

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中国人兽共患病学报 2009年第2期25卷 139-142页

作者：宋帅林彤邵军军丛国正独军政高闪电常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

目的为了获得高效价和高纯度的O型口蹄疫病毒单克隆抗体。方法用O型口蹄疫乳鼠毒(LD50=10-8.5)感染免疫小鼠,按有限稀释法和ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株,制备单抗腹水,所收腹水用50%和45%的饱和硫酸铵沉淀,再用proteinG亲和层析柱... 详细信息

目的为了获得高效价和高纯度的O型口蹄疫病毒单克隆抗体。方法用O型口蹄疫乳鼠毒(LD50=10-8.5)感染免疫小鼠,按有限稀释法和ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株,制备单抗腹水,所收腹水用50%和45%的饱和硫酸铵沉淀,再用proteinG亲和层析柱进行亲和层析纯化单体,并用SDS-PAGE和单抗检测方法分析其纯化抗体的纯度和活性。结果经3次亚克隆获得了一株杂交瘤细胞株(10E6),抗体亚类鉴定为IgG2a;SDS-PAGE电泳显示,纯化的抗体纯度较高,只有IgG2a的重链和轻链,而没有其它杂蛋白带;单抗ELISA检测方法显示,纯化的抗体具有良好的活性,其效价为1∶102400,高于腹水效价。结论用proteinG亲和层析法获得了高纯度和高效价的单克隆抗体,将为O型口蹄疫病毒的基础研究和应用研究奠定基础。

关键词： O型口蹄疫病毒单克隆抗体链球菌G蛋白亲和层析

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O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备和鉴定

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中国预防兽医学报 2009年第4期31卷 325-328页

作者：宋帅林彤邵军军丛国正独军政高闪电常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室/国家口蹄疫参考实验室兰州730046

利用O型口蹄疫病毒(FMDV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选和7次亚克隆后获得2株能稳定分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。经间接ELISA检测,2株杂交瘤细胞株(3E1、7E6)的腹水效价分别为1∶25600、1... 详细信息

利用O型口蹄疫病毒(FMDV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选和7次亚克隆后获得2株能稳定分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。经间接ELISA检测,2株杂交瘤细胞株(3E1、7E6)的腹水效价分别为1∶25600、1∶102400。间接免疫荧光试验和特异性试验表明2株McAb可与不同株的O型FMDV反应,而不与其他血清型的FMDV反应。Western blot和叠加试验表明2株单抗可识别O型FMDV结构蛋白VP1上的同一个抗原表位。此特异性McAb的获得将为O型FMDV疫苗的研制和诊断方法的建立奠定基础。

关键词： O型口蹄疫病毒单克隆抗体间接ELISA

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NASBA(依赖核酸序列的扩增)技术及其在病毒检测中的应用

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中国生物工程杂志 2009年第1期29卷 80-85页

作者：高闪电常惠芸丛国正独军政邵军军林彤中国农业科学院兰州兽医研究所国家VI蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

NASBA（nucleic acid sequence—based amplification）即依赖核酸序列的扩增技术，是一种扩增RNA的新技术，是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42％进行，可以在2h左右将模板RNA扩增... 详细信息

NASBA（nucleic acid sequence—based amplification）即依赖核酸序列的扩增技术，是一种扩增RNA的新技术，是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42％进行，可以在2h左右将模板RNA扩增约10卧佗倍，不需特殊的仪器。NASBA已经广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测，就NASBA的技术原理及其在病毒检测中的应用作一综述。

关键词：依赖核酸序列的扩增(NASBA) 恒温扩增病毒检测

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O型口蹄疫病毒各编码基因及其产物变异率的分析

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华北农学报 2009年第1期24卷 60-63页

作者：周建华丛国正常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

将从Genbank中提出的20株O型FMDV的全基因组分割成12个编码区域,即Lab、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。通过方差分析,12个编码序列的相对变异率之间无差异(P>0.05);而这12种编码序列所对应的氨基酸相对突变率之... 详细信息

将从Genbank中提出的20株O型FMDV的全基因组分割成12个编码区域,即Lab、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。通过方差分析,12个编码序列的相对变异率之间无差异(P>0.05);而这12种编码序列所对应的氨基酸相对突变率之间差异显著(P<0.01)。利用Duncan法对这12种氨基酸序列相对突变率进行多重比较,发现3A蛋白的氨基酸相对突变率比其余11种蛋白的差异都显著(P<0.05);VP2、Lpro的氨基酸相对突变率与VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间存在差异(P<0.05);而VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间无差异。结果显示,O型FMDV自身RNA的转录和机体对FMDV施加的免疫压力不是造成FMDV变异的主要原因,而各种病毒产物的功能选择压力才是FMDV分子进化的主要原因。

关键词：口蹄疫病毒相对变异率方差分析 Duncan法

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一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用

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华北农学报 2009年第6期24卷 46-49页

作者：高闪电常惠芸独军政丛国正邵军军林彤中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

以O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-OVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有PelB信号肽编码序列的VP1 C端编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建了可溶性原核表达载体pET-30a-PelB-VP1C。将VP1全长编码... 详细信息

以O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-OVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有PelB信号肽编码序列的VP1 C端编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建了可溶性原核表达载体pET-30a-PelB-VP1C。将VP1全长编码区替换VP1C,获得重组原核表达载体pET-30a-PelB-VP1。将两种重组质粒分别转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,实现了VP1全长及其C端的可溶性表达,以金属离子螯合层析法分别对表达的VP1及其C端融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在32 ku和20 ku处有单一目的条带,具有较高的纯度。Western blot分析,VP1蛋白及其C端均可与牛O型口蹄疫病毒阳性血清反应。对重组菌株的连续传代实验证实了该可溶性表达载体的遗传稳定性,显示了该可溶性原核表达载体在蛋白可溶性表达中的应用价值。

关键词：口蹄疫病毒原核表达可溶性信号肽

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口蹄疫新型疫苗研究进展

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微生物学通报 2009年第11期36卷 1750-1757页

作者：曹轶梅卢曾军田飞鹏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

口蹄疫(FMD)是一种严重威胁畜牧业发展的重要传染病,目前世界上许多国家和地区都有该病的流行与发生。其控制措施主要是疫苗免疫,虽然传统疫苗在该病的防控中起了重要的作用,但也存在着诸多的缺点。因此研制新型的FMD疫苗是今后的发展... 详细信息

口蹄疫(FMD)是一种严重威胁畜牧业发展的重要传染病,目前世界上许多国家和地区都有该病的流行与发生。其控制措施主要是疫苗免疫,虽然传统疫苗在该病的防控中起了重要的作用,但也存在着诸多的缺点。因此研制新型的FMD疫苗是今后的发展方向。本文结合实验室在FMD新型疫苗研究方面所开展的探索性研究工作,综述了国内外在FMD基因工程弱毒苗或灭活苗、蛋白质和合成肽疫苗、空衣壳疫苗、细胞因子增强型疫苗等研究领域所取得的进展。

关键词：口蹄疫传统疫苗新型疫苗

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猪源口蹄疫病毒China99/S株基因组全长cDNA的构建及其感染性鉴定

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畜牧兽医学报 2009年第2期40卷 213-220页

作者：常艳燕郑海学靳野王光祥尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 广东省农业科学院兽医研究所广州510640

提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmBⅠ/XmaⅠ、XmaⅠ/BamHⅠ、BamHⅠ/NotⅠ、HpaⅠ/KpnⅠ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带... 详细信息

提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmBⅠ/XmaⅠ、XmaⅠ/BamHⅠ、BamHⅠ/NotⅠ、HpaⅠ/KpnⅠ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠcDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pPⅠ-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定。结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾。其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段。将pPⅠFMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应。利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒。

关键词：口蹄疫病毒全长cDNA克隆 Poly(C) 反向遗传学

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PRRSV兰州分离株ORF3和ORF5基因的克隆与序列分析及其杆状病毒表达载体的构建

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中国兽医科学 2009年第3期39卷 189-195页

作者：赵娜田宏吴锦艳祁燕蓉满自萍尚佑军何生虎刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 宁夏大学农学院宁夏银川750021

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中国代表株CH-1a的基因组序列，设计包含完整ORF3、ORF5基因序列的2对特异引物，利用RT-PCR技术扩增PRRSV兰州分离株（Lanzhou株）的ORF3和ORF5基因，并对其进行序列测定，同时与已发表的1... 详细信息

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中国代表株CH-1a的基因组序列，设计包含完整ORF3、ORF5基因序列的2对特异引物，利用RT-PCR技术扩增PRRSV兰州分离株（Lanzhou株）的ORF3和ORF5基因，并对其进行序列测定，同时与已发表的13株PRRSV进行同源性比较。将扩增的PRRSV Lanzhou株ORF3、ORF5基因分别克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHTA上，将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒pFastBacHTA-ORF3、pFastBacHTA-ORF5分别转化到DH10Bac感受态细胞。结果显示，ORF3、ORF5基因长度分别为765bp、603bp，发现核苷酸的同源性分别为88.0％—99.2％、87.3％—99.0％，获得了重组转座子rBacmid-ORF3、rBacmid-ORF5。

关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒 ORF3基因 ORF5基因克隆杆状病毒表达载体

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基因工程抗体研究进展

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生物技术通报 2009年第10期25卷 40-44页

作者：李菁林彤宋帅高闪电邵军军丛国政独军政常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

随着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能,进而开发了新的抗体应用领域,使单克隆抗体技术又向前发展了一步。基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,... 详细信息

随着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能,进而开发了新的抗体应用领域,使单克隆抗体技术又向前发展了一步。基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。

关键词：基因工程抗体人源化抗体小分子抗体核糖体展示

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