检索结果-内蒙古大学图书馆

生物学杂志 2012年第5期29卷 6-10页

作者：侯相民田宏尚佑军田永强刘湘涛兰州交通大学化学与生物工程学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

将猪瘟病毒不同抗原表位基因串联构成重组基因BT21,化学合成后克隆至pMD18-T载体中,然后再将BT21串联基因片段插入原核表达载体pGEX-6P-1。经酶切和测序鉴定后,构建的重组质粒pGEX-BT21转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,表达产... 详细信息

将猪瘟病毒不同抗原表位基因串联构成重组基因BT21,化学合成后克隆至pMD18-T载体中,然后再将BT21串联基因片段插入原核表达载体pGEX-6P-1。经酶切和测序鉴定后,构建的重组质粒pGEX-BT21转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法纯化目的蛋白和Western blot分析其免疫学活性。结果表明:融合蛋白GST-BT21以可溶形式表达,分子量约为33kDa,与预期大小相符,纯化的重组蛋白可被猪瘟病毒阳性血清所识别,具有良好的免疫学活性。从而为进一步研究该融合蛋白的免疫特性和功能奠定了基础。

关键词：猪瘟病毒 E2结构糖蛋白多表位抗原抗原活性

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口蹄疫病毒非结构蛋白3AB的原核表达及应用(英文)

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生物工程学报 2011年第2期27卷 180-184页

作者：邵军军常惠芸林彤丛国正独军政高闪电中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

旨在建立一种检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的敏感、特异的ELISA方法。克隆、表达了口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因,原核表达的重组蛋白经亲和层析法纯化及Western blotting鉴定后作为包被抗原,建立检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的3AB间接... 详细信息

旨在建立一种检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的敏感、特异的ELISA方法。克隆、表达了口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因,原核表达的重组蛋白经亲和层析法纯化及Western blotting鉴定后作为包被抗原,建立检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的3AB间接ELISA方法,通过与商品化试剂盒3ABC-ELISA的比对试验对其进行评价。结果显示,重组蛋白3AB以包涵体形式表达;能与口蹄疫病毒感染血清发生特异性反应,而不能与疫苗免疫动物血清发生反应;在检测田间样品时,与3ABC-ELISA具有同样的特异性和敏感性(P>0.05)。因此,认为重组蛋白3AB是一种十分有用的分子标记物,能有效区分口蹄疫病毒感染动物和疫苗免疫动物。

关键词：口蹄疫病毒蛋白反转录聚合酶链反应(RT-PCR) 酶联免疫反应(ELISA)

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逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达

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畜牧兽医学报 2011年第4期42卷 527-532页

作者：吴锦艳田宏郑海学陈妍靳野尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞... 详细信息

本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性。用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性。结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱。免疫荧光检测发现所表达的T7RNAP蛋白具有良好的反应原性。本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具。

关键词： T7RNA聚合酶基因逆转录病毒载体 PK15细胞 SK6细胞稳定表达

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猪O型口蹄疫基因工程疫苗候选株的构建及其免疫原性分析

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畜牧兽医学报 2011年第11期42卷 1562-1569页

作者：李平花白兴文孙普李冬卢曾军包慧芳曹轶梅付元芳陈应理谢宝霞殷宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染... 详细信息

近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,构建了含VP3(58位)和VP1(43、48、137、139、140、141和142位)氨基酸改造的全长克隆。线性化的全长cDNA和T7RNA聚合酶质粒共转染BHK细胞后获得拯救病毒。RT-PCR和乳鼠致病性试验表明拯救病毒遗传稳定,具有与亲本病毒相似的致病性。用拯救的基因工程病毒灭活疫苗免疫猪28d后分别用中国谱系、泛亚谱系和缅甸98谱系猪源毒的流行毒攻击,结果均获得了完全保护(16/16)。O/HN/93灭活疫苗免疫猪能完全保护泛亚谱系和缅甸98谱系猪源病毒的攻击(16/16),但不能完全保护(12/16)中国谱系猪源病毒的攻击。结果表明基因工程病毒制备的灭活疫苗提高了对中国型猪源谱系病毒的免疫保护,拓展了抗原谱,是具有良好开发前景的疫苗候选株。

关键词：猪口蹄疫基因工程病毒构建免疫原性分析

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母源抗体对猪口蹄疫疫苗免疫应答的影响

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中国兽医学报 2011年第1期31卷 45-48页

作者：高世杰窦永喜程爱华王永录邓光明才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室甘肃兰州730046

用液相阻断ELISA(Liquid phase blocking ELISA,LPB-ELISA)和正向间接血凝(Indirect hemagglutination test,IHAT)2种血清学试验方法对规模化饲养猪群仔猪的口蹄疫母源抗体、母源抗体的传递途径、消长规律、母/仔代特异抗体相关性及母... 详细信息

用液相阻断ELISA(Liquid phase blocking ELISA,LPB-ELISA)和正向间接血凝(Indirect hemagglutination test,IHAT)2种血清学试验方法对规模化饲养猪群仔猪的口蹄疫母源抗体、母源抗体的传递途径、消长规律、母/仔代特异抗体相关性及母源抗体对口蹄疫疫苗免疫的影响进行了研究和分析。结果表明,2种血清学方法均没有从未吸吮初乳的新生仔猪中检出特异抗体;在吸吮初乳后的仔猪血清中可检出特异性抗体,并于10日龄左右抗体效价升至峰值,而后随着日龄的增加,特异性抗体的效价呈明显的线性下降,母源抗体半衰期约为10～20d,至45～60日龄母源抗体效价降至不完全保护带(lgX<1.8)或更低;仔猪母源抗体水平与母体特异抗体水平呈正相关。通过对不同日龄仔猪接种口蹄疫疫苗后抗体水平检测发现,仔猪体内较高水平的母源抗体对疫苗免疫应答具有明显或一定的负面影响。

关键词：仔猪口蹄疫母源抗体免疫应答疫苗

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核糖体展示口蹄疫单链抗体库的构建

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中国生物工程杂志 2011年第7期31卷 98-103页

作者：杨双马军武周广青林密冯霞刘涛代鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室兰州730046

目的:构建库容量大、多样性好的核糖体展示口蹄疫单链抗体(scFv)库。方法:分离口蹄疫病毒免疫的兔脾细胞,提取总RNA,用RT-PCR扩增兔抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因,同时扩增作为间隔区的兔抗体Ck基因;采用重叠延伸PCR(简... 详细信息

目的:构建库容量大、多样性好的核糖体展示口蹄疫单链抗体(scFv)库。方法:分离口蹄疫病毒免疫的兔脾细胞,提取总RNA,用RT-PCR扩增兔抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因,同时扩增作为间隔区的兔抗体Ck基因;采用重叠延伸PCR(简称SOE-PCR)技术连接VH-VL基因,同时引入T7启动子和核糖体结合位点序列,体外构建核糖体展示scFv库模板,连接pMD18-T载体转化*** DH5α大肠杆菌,挑取阳性克隆测序以鉴定scFv组装。结果:成功构建了库容量达8.21×1013的兔源口蹄疫核糖体展示scFv库。结论:构建的大容量兔源性口蹄疫核糖体展示抗体库可以成为进一步筛选特异性口蹄疫单链抗体的实验平台,为开发诊断性口蹄疫单链抗体奠定了很好的实验基础。

关键词：核糖体展示技术重叠延伸PCR 单链抗体库口蹄疫病毒

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固有免疫学的研究进展及其对研制新型免疫佐剂的启示

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中国生物工程杂志 2011年第3期31卷 87-90页

作者：孙英军张艳吴琼郑海学张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

近年来,亚单位疫苗、DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗不断涌现,这些疫苗纯度高、特异性强。但其分子小,免疫原性较差,难以诱导机体产生有效的免疫应答,需添加佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答。免疫学的研究阐明了... 详细信息

近年来,亚单位疫苗、DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗不断涌现,这些疫苗纯度高、特异性强。但其分子小,免疫原性较差,难以诱导机体产生有效的免疫应答,需添加佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答。免疫学的研究阐明了固有免疫如何调节适应性免疫。随着固有免疫学的发展和生化技术的提高,开发特异性更强、生物安全性更高的免疫佐剂越来越受到重视。对佐剂的分类、作用机理,固有免疫学的研究进展进行了综述,并就未来发展趋势提出自己的观点,为临床应用和进一步研制高效、低毒的免疫佐剂提供了参考。

关键词：免疫佐剂 TLR 固有免疫疫苗

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山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

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中国兽医科学 2011年第1期41卷 48-52页

作者：赵志荀吴国华颜新敏崔力凡李健朱海霞张强中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转... 详细信息

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30基因的转录水平。结果显示,获得的目的基因片段大小与预期结果相符,该基因与Gen-Bank数据库中RPO30基因序列的同源性为97%。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,转染后第48小时,阳性细胞率达到80.1%;经RT-PCR检测,细胞内有RPO30基因的转录。证实,已成功构建了RPO30基因与EGFP基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。

关键词：山羊痘病毒 RPO30基因增强型绿色荧光蛋白融合表达

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猪圆环病毒2型感染性DNA的构建及病毒拯救

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中国兽医学报 2011年第2期31卷 169-173,188页

作者：杨顺利尹双辉沈小燕尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

用PCR法扩增猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)全长基因组。将全基因组插入到真核生物表达载体PcDNA3.1的多克隆位点中,获得单拷贝重组质粒P-PCV2和串连双拷贝重组质粒p-2PCV2,将所得质粒分别转染无PCV污染的PK-15细胞系,经7次连续传代后,间接免疫... 详细信息

用PCR法扩增猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)全长基因组。将全基因组插入到真核生物表达载体PcDNA3.1的多克隆位点中,获得单拷贝重组质粒P-PCV2和串连双拷贝重组质粒p-2PCV2,将所得质粒分别转染无PCV污染的PK-15细胞系,经7次连续传代后,间接免疫荧光试验显示在细胞中含有病毒抗原。提取mRNA后经RT-PCR检测都有PCV2特异性基因转录。免疫小鼠后,对免疫后不同天数小鼠的血清用ELISA检测,结果到免疫后35 d病毒几乎都能检测到衣壳蛋白特异性抗体,小鼠致死后在其体内也能检测到病毒DNA。结果表明,所构建的2种重组质粒均可表达并在体外组装出有感染性PCV2病毒粒子。为进行PCV2分子特性、疫苗免疫及致病机理研究打下了基础。

关键词：猪圆环病毒2型感染性克隆病毒拯救

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猪繁殖与呼吸综合征检测技术研究进展

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中国生物工程杂志 2011年第4期31卷 124-128页

作者：魏衍全田宏吴锦艳尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

猪繁殖与呼吸综合征是导致猪繁殖障碍疾病的一种重要猪病。其致病机制和自身复制规律至今尚不完全明确,因此无法从根本上清除该病的存在,这就使得对该病的检测显得尤为重要。现从直观的临床诊断、精确的实验室诊断及鉴别诊断等方面对猪... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征是导致猪繁殖障碍疾病的一种重要猪病。其致病机制和自身复制规律至今尚不完全明确,因此无法从根本上清除该病的存在,这就使得对该病的检测显得尤为重要。现从直观的临床诊断、精确的实验室诊断及鉴别诊断等方面对猪繁殖与呼吸综合征检测技术进行了综述,其中对可以最终确诊的实验室检测技术进行了重点介绍,并对猪繁殖与呼吸综合征生物学检测技术进行了总结。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征检测技术

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