检索结果-内蒙古大学图书馆

为建立一种快速、简便、灵敏检测Asia1型口蹄疫病毒的胶体金免疫层析方法(GICA)。本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体,将该标记物与羊抗豚鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membrane)上,作为检测带和质控带。经条件优化,组装成检测Asia1型口蹄疫的诊断试纸条。用该试纸条分别对A、O、C和Asia1型口蹄疫病毒抗原以及猪水泡病病毒抗原等87份样品进行了检测,发现该试纸条不与口蹄疫病毒A、O、C型以及猪水泡病病毒抗原发生反应,特异性良好。用该试纸条对口蹄疫细胞毒(TCID50为6.25)的10倍系列稀释液进行了检测,最低可以检测到大约10?4。该试纸条与其他传统诊断方法的符合率为98.8%。初步实验确定该试纸条在4oC下可保存3个月、37oC和室温下大概可保存1周左右。该试纸条是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对现场检测具有一定实用价值。

关键词： Asia1型FMDV 单克隆抗体胶体金免疫层析法

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口蹄疫病毒泛亚型O／CHINA／99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

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病毒学报 2009年第1期25卷 58-62页

作者：吕建亮张永光王永录潘丽刘力宽方玉珍蒋守田张维德中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利... 详细信息

设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录,转录产物RNA用脂质体转入BHK-21细胞传代培养,可观察到典型的FMDV致细胞病变效应;拯救病毒接种2日龄乳鼠后,可出现典型的临床症状,并于16～48h内死亡。以上结果表明,O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建成功,并从构建的全长cDNA拯救出了口蹄疫病毒。

关键词：口蹄疫病毒全长cDNA 反向遗传学

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通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装FMDV空衣壳结构

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中国农业科学 2009年第3期42卷 1069-1077页

作者：曹轶梅卢曾军孙甲川孙普郭建宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室

【目的】口蹄疫病毒(FMDV)对酸很敏感,当pH值低于7时,二十面体对称的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。而昆虫细胞培养基的正常pH值在6.3左右,很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装天然的FMDV空衣壳结构。本研究旨在通过耐酸性改造... 详细信息

【目的】口蹄疫病毒(FMDV)对酸很敏感,当pH值低于7时,二十面体对称的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。而昆虫细胞培养基的正常pH值在6.3左右,很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装天然的FMDV空衣壳结构。本研究旨在通过耐酸性改造,应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中组装产生AsiaⅠ型FMDV空衣壳结构。【方法】应用定点突变技术改变VP3上的H140和H143为亮氨酸,以提高空衣壳对酸的耐受性。将改造和未改造的P12A基因和3C基因插入带双启动子的杆状病毒转移载体pFastBacTM Dual中,通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒,转染Sf9细胞,获得两株表达FMDV全衣壳蛋白的重组杆状病毒BacmP12A3C和BacP12A3C。重组杆状病毒经增殖后感染High FiveTM细胞,进行目的蛋白的表达。【结果】通过Western blotting检测表明目的基因均获得表达,且衣壳蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。双抗体夹心ELISA和免疫荧光检测结果表明表达蛋白主要集中在细胞膜上,且具有很好的抗原性。通过电镜观察到P12A基因改造的重组杆状病毒在昆虫细胞内产生了直径为25～30nm的空衣壳结构,而P12A基因未改造的重组杆状病毒观察到很多直径小得多的结构。【结论】本研究首次用电子显微镜在昆虫细胞中观察到FMDV完整的空衣壳结构,为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。

关键词： FMDV 耐酸性改造昆虫细胞组装空衣壳结构

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AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达与免疫活性分析

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畜牧兽医学报 2009年第1期40卷 83-88页

作者：曹轶梅孙甲川卢曾军孙普郭建宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室兰州730046

将AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白P12A基因插入到带有蜂毒溶血肽信号序列的杆状病毒转移载体pMel-Bac中,构建重组转移载体pMel-P12A。然后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。以感染复数(MOI)10的... 详细信息

将AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白P12A基因插入到带有蜂毒溶血肽信号序列的杆状病毒转移载体pMel-Bac中,构建重组转移载体pMel-P12A。然后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。以感染复数(MOI)10的重组病毒感染Sf9细胞,72 h后收获细胞,经Western blotting、间接免疫荧光检测,结果表明P12A基因在昆虫细胞中获得表达,相对分子质量约82 ku,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV阳性血清所识别。免疫荧光检测表明表达蛋白主要集中在细胞膜部分。夹心ELISA检测结果表明一部分表达蛋白分泌至培养基中,而有一部分蛋白仍在细胞中未能分泌。表达蛋白加入等量佐剂乳化后免疫豚鼠,间接ELISA检测结果表明豚鼠免疫后15 d即产生了特异性FMDV抗体。本研究为空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究进行了有益的探索。

关键词： FMDV 衣壳蛋白基因P12A 杆状病毒 Sf9细胞表达

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FMDV非结构蛋白2C主要表位区与3AB基因的组合表达与活性分析

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生物工程学报 2009年第1期25卷 10-15页

作者：张小丽田美娜卢曾军付元芳马小军刘在新谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

近年的研究表明,口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面具有潜在的价值,为了建立敏感性更高的鉴别诊断方法,将截取了2C蛋白N-端和C-端的主要B细胞表位区和完整3AB蛋白基因组合后,进行了原核表达,... 详细信息

近年的研究表明,口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面具有潜在的价值,为了建立敏感性更高的鉴别诊断方法,将截取了2C蛋白N-端和C-端的主要B细胞表位区和完整3AB蛋白基因组合后,进行了原核表达,得到了分子量约为47.6kD的目的蛋白2C′3AB。通过Westernblotting分析证明,表达产物能被FMDV感染动物阳性血清识别,具有很好的反应性。以通过电泳纯化的目的蛋白作抗原进行间接ELISA检测不同来源的动物血清,结果表明,该抗原仅与感染动物血清具有很好的反应活性,而与健康动物与免疫动物血清无反应,说明重组蛋白2C′3AB可作为区分灭活疫苗免疫动物与感染动物的鉴别诊断抗原。用2C′3AB和3ABC为抗原进行间接ELISA,对比检测田间血清样品,结果显示2C′3AB-ELISA敏感性比3ABC-ELISA高。说明以重组蛋白2C′3AB作为鉴别诊断抗原,能进一步提高对临界值血清的检出率,这对区分灭活疫苗免疫动物与FMDV隐性感染动物与带毒动物具有非常重要的意义。

关键词： FMDV 非结构蛋白 2C’3 AB 原核表达活性分析

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副猪嗜血杆菌对部分常用实验动物的致病性试验

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畜牧兽医学报 2009年第1期40卷 138-141页

作者：高鹏程储岳峰赵萍贺英逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室兰州730046

为筛选对副猪嗜血杆菌易感的实验动物，对部分常用的不同品种、不同品系实验动物进行了副猪嗜血杆菌致病性试验。用副猪嗜血杆菌血清型5型标准株（Strain Nagasaki）培养物，以2×10^8-2×10^10CFU的接种量，通过腹腔感染SPF级... 详细信息

为筛选对副猪嗜血杆菌易感的实验动物，对部分常用的不同品种、不同品系实验动物进行了副猪嗜血杆菌致病性试验。用副猪嗜血杆菌血清型5型标准株（Strain Nagasaki）培养物，以2×10^8-2×10^10CFU的接种量，通过腹腔感染SPF级小鼠、大鼠、金黄地鼠、豚鼠以及清洁级豚鼠和兔。结果当接种量达到2×10^9CFU时，SPF豚鼠、清洁级豚鼠和SPF昆明小鼠出现死亡，在死亡豚鼠观察到典型的副猪嗜血杆菌病病理变化，而在死亡小鼠未见。其它各实验动物在上述剂量范围内均未发病或死亡，感染7d后剖检也未见任何异常。对死亡豚鼠和小鼠的各个组织器官进行副猪嗜血杆菌分离，结果在豚鼠的大脑、心血、肺、肝和腹水中分离到了副猪嗜血杆菌。提示豚鼠对副猪嗜血杆菌易感，可以做为建立副猪嗜血杆菌感染动物模型的候选实验动物。

关键词：副猪嗜血杆菌实验动物致病性血清型5型标准株

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细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒

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中国农业科学 2009年第2期42卷 688-693页

作者：李平花白兴文卢曾军孙普郭建宏李冬曹伟军陈应理刘湘涛殷宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的... 详细信息

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48h后出现致细胞病变(CPE),第4代10h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力(LD50)差异不显著,具有相似的生物学特征。共转染试验重复多次,均拯救到FMDV病毒。【结论】成功建立了基于质粒为基础的FMDV的体内拯救方法。

关键词：口蹄疫病毒感染性分子克隆病毒拯救 T7RNA聚合酶

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高致病性猪蓝耳病病毒GS/LZh/07株的分离、鉴定及其非结构蛋白Nsp2基因特性分析

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畜牧兽医学报 2009年第3期40卷 438-443页

作者：吴锦艳田宏尚佑军刘湘涛郑海学靳野尹双辉满自萍赵娜蔡承茹蔺芳谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,... 详细信息

将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,发现所扩增到的Nsp2基因有90个核苷酸的缺失。序列比对结果表明:该分离病毒Nsp2基因与经典毒株PRRSV-ch-1a核苷酸同源性为83.0%,氨基酸同源性为72.7%;与高致病性变异毒株NX和SD核苷酸同源性为95.5%,氨基酸同源性为90.9%,可见该毒来源于2006-2007年流行毒株,说明高致病性猪蓝耳病变异病毒已经在甘肃省存在。该毒株的成功分离为高致病性猪蓝耳病流行病学调查分析提供数据,也为预防控制该病积累了资料。Nsp2的特性分析为揭示高致病性猪蓝耳病PRRSV在甘肃省的流行特点提供参考。

关键词：高致病性猪蓝耳病病毒分离鉴定 Nsp2 特性分析

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副猪嗜血杆菌感染豚鼠试验及在其体内的分布

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畜牧兽医学报 2009年第9期40卷 1376-1382页

作者：高鹏程储岳峰赵萍贺英逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室农业部草食动物疫病重点实验室兰州730046

为了评估副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）对豚鼠的毒力以及在豚鼠组织器官的分布,作者采用改进的寇氏法测定了***血清5型标准株对豚鼠的LD50,以1 LD50剂量经鼻腔、气管、肺、腹腔、肌肉和皮下接种感染豚鼠,比较不同途径感染***对... 详细信息

为了评估副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）对豚鼠的毒力以及在豚鼠组织器官的分布,作者采用改进的寇氏法测定了***血清5型标准株对豚鼠的LD50,以1 LD50剂量经鼻腔、气管、肺、腹腔、肌肉和皮下接种感染豚鼠,比较不同途径感染***对豚鼠致病性的差异;以1 LD50剂量气管接种豚鼠,接种后在不同时间取豚鼠的脑、心、肝、肺、脾和肾组织,制作石蜡切片,用免疫组化技术检测***在豚鼠上述组织的分布。结果显示该***血清5型标准株的LD50为1.33×10^9CFU,LD50的95%可信限范围为1.35×10^9-1.30×10^9CFU;感染试验结果显示,气管、肺和腹腔3个接种途径试验组豚鼠出现了4/8、2/8和5/8的死亡;在气管感染豚鼠6 h后,首先在肺脏组织呈现阳性结果,在感染8 h后,上述组织中都出现了阳性结果。结果表明气管、肺、腹腔和肌肉4个途径都可以使***对豚鼠致病,免疫组化检测并结合细菌分离结果表明***感染后能侵染肺、心、肝、脾和肾组织,并能突破血-脑屏障而侵染脑组织。

关键词：副猪嗜血杆菌感染 LD50 免疫组化

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