检索结果-内蒙古大学图书馆

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2004年第3期22卷 160-163页

作者：骆学农郑亚东窦永喜侯俊琳景志忠才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所畜禽病毒病重点实验室兰州730046

的　从构建的剪切引导序列 (SL)cDNA文库中筛选猪囊尾蚴相关基因。　方法　提取猪囊尾蚴总RNA ,利用SL特异序列和带有噬菌体M13M4的olig(dT)为引物 ,反转录成cDNA ,构建猪囊尾蚴SLcDNA文库。随机筛选并通过酶切、PCR鉴定阳性克隆 ,分析... 详细信息

的　从构建的剪切引导序列 (SL)cDNA文库中筛选猪囊尾蚴相关基因。　方法　提取猪囊尾蚴总RNA ,利用SL特异序列和带有噬菌体M13M4的olig(dT)为引物 ,反转录成cDNA ,构建猪囊尾蚴SLcDNA文库。随机筛选并通过酶切、PCR鉴定阳性克隆 ,分析其同源性。　结果　鉴定出一 3 3 2bp的插入片段 ,含有 2 0 4bp的开放阅读框(ORF)和 3′端 2 0bp的polyA尾巴 ,经核苷酸和氨基酸序列分析 ,所克隆的基因的氨基酸序列与其他真核生物如人、秀丽隐杆线虫、果蝇及拟南芥等的RNA聚合酶亚基基因同源性均高达 71.6%以上。　结论　筛选鉴定的基因推测为猪囊尾蚴RNA聚合酶亚基基因 ,而且在不同物种间很保守。

关键词：猪囊尾蚴 RNA聚合酶亚基基因噬菌体基因文库

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猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建及免疫原基因的筛选与克隆

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畜牧兽医学报 2005年第4期36卷 391-396页

作者：景志忠郭爱疆海岗宗瑞谦才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒病重点开放实验室兰州730046

研究避开庞大的猪带绦虫基因组DNA,以构建六钩蚴发育阶段的cDNA表达文库为策略,利用pSPORT1质粒表达载体首次成功构建了表达文库。经库容量、重组率和代表性测定,库容量达5.0×106,重组率100%,用特异性引物能扩增出六钩蚴发育阶段1... 详细信息

研究避开庞大的猪带绦虫基因组DNA,以构建六钩蚴发育阶段的cDNA表达文库为策略,利用pSPORT1质粒表达载体首次成功构建了表达文库。经库容量、重组率和代表性测定,库容量达5.0×106,重组率100%,用特异性引物能扩增出六钩蚴发育阶段10ku基因、18ku基因和45W基因家族的A型、B型、C型转录本,说明文库质量高,代表性强。应用快速筛选质粒表达文库和克隆免疫原基因的技术,成功地筛选和克隆到TsO1基因,其完整阅读框架(ORF)为393bp。将其登录到GenBank(AY327451),经BLAST分析,证实是猪带绦虫六钩蚴发育阶段的1个新免疫原基因。

关键词：猪带绦虫六钩蚴免疫原 cDNA文库克隆构建 cDNA表达文库基因组DNA 发育阶段质粒表达载体特异性引物 BLAST 基因家族快速筛选库容量代表性重组率转录本

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猪带绦虫六钩蚴免疫原基因的克隆、表达与结构预测

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中国兽医学报 2005年第4期25卷 382-384,387页

作者：景志忠窦永喜蒙学莲吴国华才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒病重点实验室甘肃兰州730046

从猪带绦虫六钩蚴cDNA表达文库中筛选、克隆的Ts01基因,设计表达性引物,亚克隆到pGEX-4T-1表达载体,构建了pGEX-GST-Ts01的融合表达重组载体,转化BL21寄主菌和IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE和Western蛋白分析,表明成功地高效表达了约40000... 详细信息

从猪带绦虫六钩蚴cDNA表达文库中筛选、克隆的Ts01基因,设计表达性引物,亚克隆到pGEX-4T-1表达载体,构建了pGEX-GST-Ts01的融合表达重组载体,转化BL21寄主菌和IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE和Western蛋白分析,表明成功地高效表达了约40000左右的融合蛋白质,与预测的相对分子质量大小一致,表达量达40%左右。表达产物具有免疫学活性,而且呈可溶性,未形成包涵体,这与用蛋白质软件分析的Ts01编码蛋白水溶性相一致。

关键词：猪带绦虫六钩蚴免疫筛选基因克隆融合表达结构预测

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稳定表达T7RNA聚合酶IBRS-2细胞系的建立以及利用该细胞系对SVDV的体内拯救

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生物化学与生物物理进展 2008年第4期35卷 449-456页

作者：郑海学田宏靳野吴锦艳尚佑军刘湘涛谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046 广东省农业科学院兽医研究所广州510640

利用PCR从!溶原性细菌DE3中扩增出T7RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pT7BABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉... 详细信息

利用PCR从!溶原性细菌DE3中扩增出T7RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pT7BABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉素进行传代筛选,形成细胞系IBRST7.对不同代次的IBRST7细胞基因组进行PCR和RT-PCR鉴定,结果表明,T7RNA聚合酶基因在细胞传代过程中能稳定存在,并能表达目的蛋白的mRNA.为了鉴定T7RNA聚合酶在IBRST7细胞内是否具有转录活性,扩增口蹄疫病毒(FMDV)的内部核糖体进入位点(IRES)片段和EGFP基因,定向克隆于原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了T7启动子控制下转录的具有非帽依赖性表达的重组质粒pIERS-EGFP-ET,把该质粒转染IBRST7细胞,能够在紫外显微镜下观察到绿色荧光,说明EGFP得到了表达,表明IBRST7细胞系内的T7RNA聚合酶具有转录活性.然后,利用该细胞系成功拯救出具有感染性的猪水泡病病毒(SVDV),并对其生物学功能进行了鉴定.该细胞系的建立为利用T7RNA聚合酶转录系统体内高效拯救病毒提供了基础.该拯救病毒的策略使RNA拯救简化为一步快速的拯救方法,为进一步探索SVDV病毒致病的分子机制及研制新型SVD疫苗奠定了良好的基础.

关键词： T7RNA聚合酶 IBRST7细胞系假型病毒 SVDV 病毒拯救逆转录病毒载体感染性克隆

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牛朊蛋白(bPrP^C)基因的克隆和序列分析

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畜牧兽医学报 2004年第3期35卷 318-323页

作者：吴润谢庆阁刘湘涛陈豪泰中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室

分别从9头牛(3头牦牛、3头荷斯坦牛和3头秦川黄牛)全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPC)基因,并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的牛PrPC的片段大小为795bp,包含了牛朊蛋白基因的完整编... 详细信息

分别从9头牛(3头牦牛、3头荷斯坦牛和3头秦川黄牛)全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPC)基因,并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的牛PrPC的片段大小为795bp,包含了牛朊蛋白基因的完整编码区序列,为含单一外显子的完整开放阅读框,与国内外报道的已知序列基本相同。本次所报道的牛PrP(bPrPC)基因含6个短而富含G-C的元件,可编码八肽Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln/Arg或九肽Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp/Arg-Gly-Gln。这些bPrPC基因序列相比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别在99.0%～100.0%和99.2%～100.0%之间。在整个18个碱基替换中,多数替换是保守的,为同义突变,仅有5个替换引起氨基酸突变,分别为HN200302的W60R、HN200303的S154N、MN200301的A129V、NN200302的Q234R和NN200303的Q94R突变。发现牦牛朊粒基因在126(A→G)、234(G→A)和678(T→C)位的特征性核苷酸替换,但均为同义码替换。

关键词：牛朊蛋白基因克隆序列分析神经变性疾病疯牛病朊病毒

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牦牛和双峰驼重组朊蛋白的原核细胞表达

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中国兽医科学 2006年第1期36卷 1-6页

作者：吴润陈豪泰刘湘涛谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室

应用重组DNA技术构建了牦牛和双峰驼重组朊蛋白的4个表达载体，即pGEX-BoPrP（23～242）、pGEX—BoPrP（100～242）、pGEX—CaPrP（25～241）和pGEX—CaPrP（93～241），经转化*** BL21（DE3），成功地获得了重组菌*** BoPrP（23～242）、*** BoPrP（100～242）、*** CaPrP（25～241）和*** CaPrP（93～241），分别可表达大小约为50．2、41．7、49．9和42．4ku的融合蛋白。各重组菌经1．0mmol／L的IPTG于37℃诱导5～6h可产生占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。免疫印迹分析表明，除融合蛋白GST—BoPrP（100～242）外，GST—BoPrP（23～242）、GST—CaPrP（25～241）和GST—CaPrP（93～241）均可与抗牛单克隆抗体4C11反应，显示中国黄牛PrP^c与牦牛和双峰驼PrP^c具有共同的抗原成分。

关键词：朊粒牦牛双峰驼原核细胞表达

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含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3′非编码区的克隆及其特征分析

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中国兽医科学 2006年第1期36卷 7-12页

作者：郑海学刘湘涛尚佑军吴锦艳冯霞白兴文田宏孙世琪尹双辉郭建宏刘在新谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt... 详细信息

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较,结果显示,HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%。同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。

关键词：猪水泡病病毒 3’NTR poly(A) 二级结构柯萨奇病毒B5

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羊朊蛋白基因的克隆和序列分析

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畜牧兽医学报 2005年第8期36卷 794-799页

作者：吴润谢庆阁刘湘涛陈豪泰中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室

分别从6只羊(3只藏绵羊和3只山羊)全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPC)基因,并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的羊PrP基因片段大小为771bp,包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列,为包... 详细信息

分别从6只羊(3只藏绵羊和3只山羊)全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPC)基因,并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的羊PrP基因片段大小为771bp,包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,其与国外报道的已知序列基本相同。所克隆的羊PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码八肽Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或九肽Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln。这些PrP基因序列相比较,其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别在99.0%~100.0%和98.1%~100.0%之间。共发现17个碱基替换,其中6个为同义码替换、11个为异义突变。异义突变中,除SY200301~SY200303的S240P和MY200301的M112T外,其余均位于PrP氨基酸125~228的C-端球形结构区,分别为MY200301的G129S突变、MY200302的T191R突变、MY200303的G127S突变及SY200302和SY200303的H143R和R211G。6个羊PrP基因均为密码子136、154和171的PrPARQ等位基因。

关键词：藏绵羊山羊朊蛋白基因 DNA克隆序列分析

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用大肠杆菌表达FMDV NSP3ABC鉴别感染与注苗动物ELISA方法的建立

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畜牧兽医学报 2005年第4期36卷 381-386页

作者：曹轶梅卢曾军刘在新谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室兰州730046

用大肠杆菌表达的FMDV NSP3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法。用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准。3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样... 详细信息

用大肠杆菌表达的FMDV NSP3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法。用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准。3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样品效价。当效价小于012为阴性,介于012～013之间为可疑,大于013为阳性。根据此判定标准所测试验感染动物血清都为阳性,敏感性达100%;97.06%疫苗注射动物血清为阴性;98.39%的非免疫健康牛(未感染也未注射疫苗牛)血清为阴性。研究证实感染牛在1年以后仍能检测到3ABC抗体。这说明3ABC-I-ELISA能够鉴别FMDV感染动物和注苗动物,可作为大面积疫情监测的方法应用。

关键词：大肠杆菌表达鉴别间接ELISA方法 FMDV 感染动物判定标准动物血清血清样品疫苗注射注射疫苗方法应用疫情监测阳性敏感性健康牛检测效价抗原后作免疫抗体

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双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

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中国兽医科技 2005年第12期35卷 969-973页

作者：吴润陈豪泰刘湘涛谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白(PrP)基因,并克隆到pMD 18-T载体.序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单... 详细信息

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白(PrP)基因,并克隆到pMD 18-T载体.序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同.4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽(九肽)重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸(除LT200302为23个氨基酸外)的C-端信号肽.4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%～100.0%和94.2%～100.0%.共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变.

关键词：双峰驼朊蛋白基因 DNA克隆序列分析

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