检索结果-内蒙古大学图书馆

甘肃农业大学学报 2007年第3期42卷 12-16页

作者：易华山侯顺利胡永浩独军政刘萍王光华高闪电常惠芸甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 兰州军区疾病预防控制中心甘肃兰州730020 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

对甘肃H9N2亚型的A/Chicken/GanSu/2/99(A/CK/GS/2/99)株PA基因进行了克隆、测序及分子进化分析.结果表明:该病毒PA基因开放阅读框由2 151个碱基组成,编码716个氨基酸;其与A/Quail/HongKong/NT28/99(H9N2)株和A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)株的核苷酸同源性分别为98.4%和98.5%,氨基酸同源性分别为98.7%和98.7%;与A/HongKong/156/97(H5N1)和A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)的核苷酸同源性分别为89.0%和87.8%,氨基酸同源性分别为为93.9%和94.3%.

关键词：禽流感病毒(H9N2株) PA基因克隆序列分析

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牦牛和双峰驼重组朊蛋白的原核细胞表达

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中国兽医科学 2006年第1期36卷 1-6页

作者：吴润陈豪泰刘湘涛谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室

应用重组DNA技术构建了牦牛和双峰驼重组朊蛋白的4个表达载体，即pGEX-BoPrP（23～242）、pGEX—BoPrP（100～242）、pGEX—CaPrP（25～241）和pGEX—CaPrP（93～241），经转化*** BL21（DE3），成功地获得了重组菌*** BoPrP（23～242）、*** BoPrP（100～242）、*** CaPrP（25～241）和*** CaPrP（93～241），分别可表达大小约为50．2、41．7、49．9和42．4ku的融合蛋白。各重组菌经1．0mmol／L的IPTG于37℃诱导5～6h可产生占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。免疫印迹分析表明，除融合蛋白GST—BoPrP（100～242）外，GST—BoPrP（23～242）、GST—CaPrP（25～241）和GST—CaPrP（93～241）均可与抗牛单克隆抗体4C11反应，显示中国黄牛PrP^c与牦牛和双峰驼PrP^c具有共同的抗原成分。

关键词：朊粒牦牛双峰驼原核细胞表达

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含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3′非编码区的克隆及其特征分析

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中国兽医科学 2006年第1期36卷 7-12页

作者：郑海学刘湘涛尚佑军吴锦艳冯霞白兴文田宏孙世琪尹双辉郭建宏刘在新谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt... 详细信息

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较,结果显示,HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%。同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。

关键词：猪水泡病病毒 3’NTR poly(A) 二级结构柯萨奇病毒B5

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口蹄疫病毒P1+2A基因在BHK–21细胞中的表达

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中国病毒学 2006年第5期21卷 454-457页

作者：龚真莉刘湘涛田宏吴锦艳代兴国尚佑军陈国栋中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室甘肃兰州730046

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDVP1+2A基因片段在BHK... 详细信息

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDVP1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口蹄疫阳性血清所识别而且具有良好的生物学活性。这一结果的取得,为进一步研制新型口蹄疫基因工疫苗及其配套诊断试剂奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 P1+2A基因表达载体pQE-Trisystem BHK-21细胞转染

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猪瘟病毒结构蛋白E^(rns)在***中的高效表达及纯化

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中国病毒学 2006年第1期21卷 75-77页

作者：尹双辉刘湘涛韩雪清尚佑军孙士琪中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室甘肃兰州730046

The Erns gene was amplified by RT-nPCR from C-strain of Classical swine fever virus(CSFV).Then the Erns gene was cloned into pGEX6P-1 *** expression products were analysed by SDS-PAGE and Western blotting *** inclusion bodies were recovered from bacterial lysate by centrifugation and washed with buffer,and then dissolved in denaturing *** protein was refolded by dilution *** protein reacted strongly with the positive serum of CSFV,which indicated that the protein has immunogenic.

关键词：猪瘟病毒 E^ms gene 蛋白表达

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口蹄疫病毒VP1基因在番茄中的表达及转基因番茄对豚鼠诱导免疫保护

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微生物学报 2006年第5期46卷 796-801页

作者：潘丽张永光王永录王宝琴谢庆阁方玉珍王文秀蒋守田王炜孙元吕建亮刘力宽中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR检测目的基因的整合与转录,ELISA筛选约40%的卡那抗性植株... 详细信息

构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR检测目的基因的整合与转录,ELISA筛选约40%的卡那抗性植株阳性,分别提取两株ELISA和Western blot检测阳性的转基因番茄叶片蛋白与弗氏佐剂乳化,于0、15、30d经肌肉途径免疫豚鼠,第三次免疫后28d用100ID50的同源强毒攻击,根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行转基因植物疫苗免疫原性的评估。结果表明,双元表达载体pBin438/VP1构建正确,PCR、RT-PCR结果证实口蹄疫病毒VP1基因已整合到番茄基因组并在转录水平表达,ELISA和Western blot检测重组蛋白能够与FMDV阳性血清反应。转基因番茄第三次免疫豚鼠后21d血清效价最高可达1∶64,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80%和40%,证明转基因番茄表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性。

关键词：口蹄疫病毒 VP1基因转基因番茄豚鼠免疫原性

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偶蹄动物朊蛋白基因变异性和其系统发生关系分析

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中国农业科学 2006年第6期39卷 1253-1263页

作者：吴润陈怀涛谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所/农业部畜禽病毒学重点实验室甘肃农业大学动物医学院

目的为明了偶蹄动物PrP基因的结构特征及其变异与结构、功能和朊粒病传染种间屏障的关系以及系统发生关系;方法利用DNAstar和Clustalx程序及treev32软件进行了22种偶蹄动物的43个完整PrP基因序列的同源性分析、多重排比和进化树构建;结... 详细信息

目的为明了偶蹄动物PrP基因的结构特征及其变异与结构、功能和朊粒病传染种间屏障的关系以及系统发生关系;方法利用DNAstar和Clustalx程序及treev32软件进行了22种偶蹄动物的43个完整PrP基因序列的同源性分析、多重排比和进化树构建;结果不同种属偶蹄动物的PrP基因完整ORF大小有所差异,范围为768～795bp,可编码255～264个氨基酸的朊蛋白。核苷酸和氨基酸序列的同源性,偶蹄动物间≥88.6%和≥93.3%,反刍动物间≥95.4%和≥96.5%。共发现40个点突变和2个突变区。在N-端柔韧无序“尾”区(25～135)以八肽重复缺失为主,球形结构域区(136～241)以点突变为主,点突变主要簇聚在S1β-折叠前的柔韧无规卷曲区的C-端部分和HCα-螺旋内。氨基酸104～135区和球形结构域区存在有8个高突变位点。已知PrP肽基元和功能位点如芳烃回文序列基元、2个N-连接糖基化位点、2个苏氨酸磷酸化位点、1个酪氨酸硫化位点、形成二硫键的2个半胱氨酸以及GPI锚锚着点丝氨酸为偶蹄动物所共有,各种间变异体的各结构模式非常一致。进化关系分析,可将偶蹄动物PrP基因区分为3大类,反刍动物PrP基因分为3小类。令人意外的是,2个双峰驼PrP基因的进化关系与牛属动物基因同源。结论偶蹄动物的PrP基因是一个保守基因,氨基酸104～135区和球形结构域区内的8个高突变位点可能是影响分子间相互作用、形成朊粒病传染种间屏障的主要位点,物种间各氨基酸变异并不影响PrP的主要结构和功能。

关键词：偶蹄动物朊蛋白基因结构特征分子进化结构与功能的关系种间屏障

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细菌内同源重组法制备FMDV聚蛋白编码基因重组腺病毒

引用

微生物学报 2006年第2期46卷 223-226页

作者：张兴旺王勤柳纪省殷相平李志勇中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046 兰州大学生命科学学院兰州730000

采用PCR方法从重组质粒pMD18_T/PP中扩增出FMDV的聚蛋白(PP)编码基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒rpAd_CMV/PP;将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体通过在大肠杆菌内质粒间同源重组获得重组腺病毒质粒rpAd/PP。将腺... 详细信息

采用PCR方法从重组质粒pMD18_T/PP中扩增出FMDV的聚蛋白(PP)编码基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒rpAd_CMV/PP;将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体通过在大肠杆菌内质粒间同源重组获得重组腺病毒质粒rpAd/PP。将腺病毒载体线性化后用脂质体介导转染293细胞从而获得含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒。通过倒置显微镜观测,可见明显的细胞病变,利用荧光显微镜可观测到报告基因绿色荧光蛋白的表达,并在电镜下观察到FMDV的空衣壳。结果证明已成功获得了含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒rAd/PP,并成功表达组装FMDV空衣壳,为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。

关键词： FMDV 聚蛋白编码基因同源重组重组腺病毒空衣壳

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口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

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中国兽医科学 2006年第7期36卷 515-518页

作者：龚真莉刘湘涛尚佑军田宏吴锦艳尹双辉陈国栋中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了... 详细信息

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。

关键词：口蹄疫病毒 VP1基因基因克隆表达

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口蹄疫病毒亚洲I型YNBS/58株P12A-3C转基因植物双元表达载体的构建

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中国人兽共患病学报 2006年第11期22卷 1059-1061,1064页

作者：王炜张永光王永录方玉珍潘丽蒋守田刘力宽孙元吕建亮智晓莹黄振华中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

目的双元载体是目前转基因植物工程普遍应用的载体,本文将口蹄疫病毒P12A基因、3C基因串联,构建植物表达载体pBin-438P12A-3C。方法为便于实验操作,本试验采用先将基因片段P12A、3C构建到一个中间质粒pcDNA3.1(+)的策略,构建成pcDNA3.1(... 详细信息

目的双元载体是目前转基因植物工程普遍应用的载体,本文将口蹄疫病毒P12A基因、3C基因串联,构建植物表达载体pBin-438P12A-3C。方法为便于实验操作,本试验采用先将基因片段P12A、3C构建到一个中间质粒pcDNA3.1(+)的策略,构建成pcDNA3.1(+)-P12A-3C。结果通过对构建好的pBin438-P12A-3C(Mini-Ti)重组质粒进行PCR鉴定和序列测定,证明中间表达载体构建成功。结论通过三亲杂交法将重组质粒载体pBin438-P12A-3C导入到农杆菌GV3101,通过抗性筛选、PCR鉴定和序列测定,证明构建成功,与农杆菌中的help-Ti质粒共同组成植物双元表达载体,为以后的植物转化奠定基础。

关键词：口蹄疫病毒转基因植物表达载体农杆菌

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