检索结果-内蒙古大学图书馆

小反刍兽疫根除计划及其疫苗的最新研究进展

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中国兽医科学 2021年第4期51卷 412-420页

作者：张大俊杨博史喜绢张婷杨金柯崔卉梅赵登率袁兴国郑海学刘湘涛张克山中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

主要介绍了小反刍兽疫国内外控制和根除战略方面的内容以及近年来小反刍兽疫疫苗的最新研究进展,以期为我国小反刍兽疫的净化和根除提供参考。

关键词：小反刍兽疫全球根除计划疫苗控制

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猪源组织蛋白酶S抑制O型口蹄疫病毒在PK-15细胞复制

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畜牧兽医学报 2021年第6期52卷 1652-1661页

作者：史喜绢刘原子张大俊侯景申超超杨博张婷袁兴国任瑞瑞杜晓华张克山郑海学刘湘涛甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

前期研究数据表明组织蛋白酶S(cathepsin S,CTSS)在猪初乳中表达水平显著高于常乳,且CTSS有抑制病毒复制的作用,本研究旨在探究猪源CTSS对O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus serotype O,FMDV-O)复制及对FMDV诱导的抗病毒细胞... 详细信息

前期研究数据表明组织蛋白酶S(cathepsin S,CTSS)在猪初乳中表达水平显著高于常乳,且CTSS有抑制病毒复制的作用,本研究旨在探究猪源CTSS对O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus serotype O,FMDV-O)复制及对FMDV诱导的抗病毒细胞因子的影响。FMDV-O感染PK-15细胞,利用RT-qPCR和Western blot分别在转录和翻译水平探究FMDV-O感染对内源性CTSS表达的影响;使用CTSS活性检测试剂盒测定FMDV-O感染对CTSS酶活性的影响;根据GenBank公布的 CTSS 基因序列(XM_021089893.1)构建CTSS真核表达质粒,利用脂质体方法转染PK-15细胞,通过Western blot检测CTSS表达情况,并在此基础上通过Western blot和RT-qPCR检测过表达CTSS对FMDV-O复制及FMDV-O诱导的抗病毒细胞因子mRNA水平的影响;进一步针对CTSS设计合成3对特异性siRNA,利用Western blot和RT-qPCR检测CTSS和FMDV-O的变化。结果表明,FMDV-O感染PK-15细胞能显著上调猪源CTSS表达并增强CTSS酶活性;过表达CTSS能抑制FMDV-O在 PK-15 细胞中复制,这种抑制作用可能是通过促进FMDV-O诱导的抗病毒细胞因子产生而发挥功能的;干扰序列siRNA-2947下调内源性CTSS表达进而促进FMDV-O的复制。猪源CTSS促进宿主抗病毒细胞因子产生可能是抑制FMDV-O复制的原因之一,本研究为深入探究宿主CTSS在抗FMDV天然免疫应答中的作用及机制提供依据。

关键词：组织蛋白酶S FMDV-O PK-15细胞抗病毒功能

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羊传染性脓疱病毒感染山羊皮肤成纤维上皮细胞差异表达miRNA分析

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畜牧兽医学报 2020年第8期51卷 1932-1938页

作者：张大俊侯景申超超徐国伟孔汉金成伟伟郑海学刘湘涛张克山中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

旨在研究羊传染性脓疱病毒(orf virus,orfv)感染山羊皮肤成纤维细胞(goat skin fibroblasts cell,GSF)对GSF细胞microRNA(miRNA)表达谱影响,探究miRNA在orfv感染过程中的作用及调控机制。分别提取感染和未感染orfv的GSF细胞总RNA,构建mi... 详细信息

旨在研究羊传染性脓疱病毒(orf virus,orfv)感染山羊皮肤成纤维细胞(goat skin fibroblasts cell,GSF)对GSF细胞microRNA(miRNA)表达谱影响,探究miRNA在orfv感染过程中的作用及调控机制。分别提取感染和未感染orfv的GSF细胞总RNA,构建miRNA文库,利用高通量测序技术进行miRNA差异表达分析,对差异表达miRNA靶基因进行预测,并进行GO和KEGG分析,随机选取10个差异miRNA进行RT-qPCR验证。结果显示,orfv感染组和未感染GSF细胞组相比共有678个显著差异表达的miRNA(fold change≥1.5),其中,上调表达miRNA有509个,下调表达miRNA有169个,uniq_miRNA的Venn图分析显示,感染组和对照组共有的miRNA仅占8.21%;GO和KEGG分析显示,差异表达miRNA主要参与脂质代谢、受体及细胞因子信号转导等细胞生物学过程,RT-qPCR验证结果与高通量测序结果一致。本研究结果表明,orfv感染GSF细胞对其编码的miRNA有显著影响,获得大量GSF细胞编码的与orfv感染相关的差异miRNA,为进一步从宿主miRNA层面揭示orfv感染和致病机制提供了参考依据。

关键词：羊传染性脓疱病毒山羊皮肤成纤维细胞病毒感染差异表达miRNA

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非洲猪瘟病毒MGF 360-9L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

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畜牧兽医学报 2020年第6期51卷 1371-1381页

作者：申超超李国丽张大俊徐国伟侯景李丹党文张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室、农业部畜禽病毒学重点开放实验室、国家口蹄疫参考实验室兰州730046

前期研究结果表明,非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答,故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列,进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法,分析该基因的一级结构并预测该基因的表... 详细信息

前期研究结果表明,非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答,故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列,进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法,分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构;根据GenBank公布的Georgia 2007/1(FR682468.1)序列,合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒,Western blot验证该基因表达后,将重组质粒转染至PK-15细胞,经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明,以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照,其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守,在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致,保守序列为3′末端378 bp片段,高级结构以α螺旋为主,核定位序列预测其定位于细胞核内;构建真核表达质粒,成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。

关键词：非洲猪瘟病毒 MGF 360-9L基因序列分析结构预测亚细胞定位

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PK-15细胞的TPL2基因敲除有利于口蹄疫病毒和塞内卡病毒复制

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畜牧兽医学报 2020年第5期51卷 1060-1073页

作者：闫鸣昊郝军红张大俊申超超徐国伟侯景张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

旨在构建TPL2(MAP3K8/COT)基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2^-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVA)复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一... 详细信息

旨在构建TPL2(MAP3K8/COT)基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2^-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVA)复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA(sg RNA),合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹(Western blot)方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID50评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2^-/-细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素(IFN)和IFN刺激基因(ISG)的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA感染的PK-15-TPL2^-/-细胞中干扰素途径的激活状态。TPL2基因敲除PK-15细胞系中TPL2基因发生了碱基插入突变和碱基缺失突变,构建的细胞系中均未检测到TPL2蛋白质表达。测定并比较了FMDV和SVA感染的PK-15和PK-15-TPL2^-/-细胞中病毒含量,表明TPL2基因敲除显著促进了FMDV和SVA的复制。同时,RT-qPCR进一步表明与FMDV和SVA感染期间的PK-15细胞相比,PK-15-TPL2^-/-细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达明显降低。综上所述,本研究成功构建了TPL2基因敲除的PK-15细胞系,与对照细胞相比,TPL2基因的敲除更利于FMDV和SVA的复制,这可能与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表达的抑制有关。本研究提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为在动物和疫苗开发过程中编辑细胞系以提高病毒产量的有效工具,本结果为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向,也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。

关键词： TPL2基因 PK-15细胞基因敲除口蹄疫病毒塞内卡病毒

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过表达TPL2蛋白PK-15细胞系的建立及其功能验证

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中国兽医学报 2020年第7期40卷 1319-1324页

作者：郝军红闫鸣昊张大俊张学刚申超超徐国伟李国丽张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

通过基因合成的TPL2(tumor progression locus 2)质粒,获得稳定表达TPL2的PK-15/TPL2细胞系。将慢病毒载体Lv-PCDH和TPL2(Pig)重组慢病毒载体Lv-TPL2(Pig)利用转染试剂将其转染至PK-15细胞。感染48 h后,加入嘌呤霉素进行药物筛选,通过... 详细信息

通过基因合成的TPL2(tumor progression locus 2)质粒,获得稳定表达TPL2的PK-15/TPL2细胞系。将慢病毒载体Lv-PCDH和TPL2(Pig)重组慢病毒载体Lv-TPL2(Pig)利用转染试剂将其转染至PK-15细胞。感染48 h后,加入嘌呤霉素进行药物筛选,通过筛选得到的阳性细胞株PK-15/TPL2即为稳定表达TPL2蛋白的PK-15细胞株。通过qRT-PCR法和琼脂糖凝胶电泳、IFA,TCID50技术验证PK-15/TPL2细胞系和对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和猪塞内加谷病毒(seneca valley virus,SVV)病原复制的影响。结果显示,细胞表达大量的TPL2的基因产物,用FMDV、SVV病毒感染稳定表达TPL2的PK-15细胞株时,明显抑制病毒的复制。结果表明,利用该技术可高效快速地建立了稳定高表达TPL2的PK-15细胞系,该细胞株的建立为病毒的分离及TPL2的生物学活性研究奠定理论基础。

关键词： TPL2基因 PK-15细胞系 FMDV SVV 慢病毒表达系统

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HEK293T细胞敲除TPL2基因促进塞内卡病毒复制的研究

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中国兽医科学 2020年第9期50卷 1073-1082页

作者：闫鸣昊郝军红张大俊申超超徐国伟侯景张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

肿瘤进展位点2(TPL2)在不同病毒感染过程中扮演着不同角色。为探究TPL2对塞内卡病毒(SVA)复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TPL2基因敲除HEK293T细胞系,以PCR测序和Western-blot对TPL2敲除效率进行双重鉴定,同时检测TPL... 详细信息

肿瘤进展位点2(TPL2)在不同病毒感染过程中扮演着不同角色。为探究TPL2对塞内卡病毒(SVA)复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TPL2基因敲除HEK293T细胞系,以PCR测序和Western-blot对TPL2敲除效率进行双重鉴定,同时检测TPL2缺失对细胞形态和细胞增殖速度的影响。最后,用SVA感染细胞,采用IFA、RT-qPCR、Western-blot和TCID50方法检测病毒增殖水平,综合评价TPL2敲除对SVA复制的影响。结果,获得两株敲除TPL2基因的HEK293T细胞。随机选取B1细胞株(HEK293T-TPL2-/-)进行后续功能评价,发现TPL2敲除后细胞的增殖速度与对照HEK293T细胞无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态。SVA感染后与对照细胞相比,敲除TPL2基因显著增加病毒拷贝数,病毒mRNA的转录,病毒蛋白的翻译以及子代病毒的毒力。综上所述,本研究成功建立TPL2基因敲除HEK293T细胞系并证明TPL2在SVA感染过程中发挥着抗病毒作用,为进一步揭示TPL2相关免疫反应和SVA感染过程的具体作用机制奠定试验基础并提供良好的细胞模型,也为疫苗生产过程中提高病毒产量提供一种可行性策略。

关键词： CRISPR/Cas9 TPL2基因 HEK293T细胞基因敲除塞内卡病毒

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宿主Arf6通过阻止口蹄疫病毒入侵发挥抗病毒作用

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中国兽医科学 2020年第10期50卷 1207-1214页

作者：李国丽史喜绢张大俊徐国伟刘原子申超超张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业农村部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

本实验室前期i TRAQ技术研究发现母猪初乳中Arf6表达量显著高于常乳,现有文献报道Arf6在病原感染中扮演重要角色。为研究宿主Arf6在口蹄疫病毒(FMDV)感染中的作用,本研究构建Arf6真核表达质粒,应用Arf6抑制剂,利用RT-qPCR和Western-blo... 详细信息

本实验室前期i TRAQ技术研究发现母猪初乳中Arf6表达量显著高于常乳,现有文献报道Arf6在病原感染中扮演重要角色。为研究宿主Arf6在口蹄疫病毒(FMDV)感染中的作用,本研究构建Arf6真核表达质粒,应用Arf6抑制剂,利用RT-qPCR和Western-blot技术检测FMDV和Arf6的相互调控作用;构建Arf6系列突变体,评估Arf6调控FMDV复制的功能区或者功能位点;利用间接免疫荧光技术(IFA)分析Arf6对FMDV入侵的影响。结果表明,FMDV感染PK-15细胞后,内源性Arf6表达水平显著上调;过表达Arf6抑制FMDV在PK-15细胞中的复制;抑制Arf6能促进FMDV复制;Arf6(155-176 aa)不是Arf6抑制FMDV侵入的关键区域,第48位氨基酸是Arf6抑制FMDV入侵的关键位点。IFA结果显示,Arf6在细胞膜水平阻止了FMDV的入侵。结果表明,宿主Arf6在FMDV入侵层面发挥了抗病毒作用,本研究结果为揭示FMDV和宿主蛋白相互调控作用提供了理论依据。

关键词： Arf6 口蹄疫病毒病毒入侵抗病毒作用

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口蹄疫灭活疫苗的免疫效果及其对鉴别诊断的干扰

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畜牧兽医学报 2020年第10期51卷 2481-2489页

作者：孙普何伟付元芳李冬杨林魏德陇曹轶梅李平花白兴文马雪青李坤包慧芳张婧朱新荣刘在新卢曾军中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 甘肃农业大学兰州730070 甘肃荷斯坦奶牛繁育示范中心兰州730086

灭活疫苗免疫是防控口蹄疫的重要措施,但是灭活疫苗的免疫效果及其对感染与免疫鉴别诊断的干扰一直是口蹄疫免疫无疫区建设评估需要明确的重要问题。本研究中选择了3个企业(代号A、B与C)的4组口蹄疫O型与A型二价灭活疫苗,分别免疫口蹄... 详细信息

灭活疫苗免疫是防控口蹄疫的重要措施,但是灭活疫苗的免疫效果及其对感染与免疫鉴别诊断的干扰一直是口蹄疫免疫无疫区建设评估需要明确的重要问题。本研究中选择了3个企业(代号A、B与C)的4组口蹄疫O型与A型二价灭活疫苗,分别免疫口蹄疫抗体阴性健康未成年牛,免疫3~4次,测定免疫前后结构蛋白和非结构蛋白抗体的应答水平。结果显示:(1)结构蛋白抗体合格率:a1组(A企业多批次疫苗)4次免疫后O型和A型均为100%;a2组(A企业同批次疫苗)一~三免O型为36.7%、98.3%与100%,A型为15%、86.7%与100%;b组(B企业疫苗)一~三免O型为18.3%、97%与100%,A型为1.7%、45%与53.3%;c组(C企业疫苗)一~三免O型为26.7%、96.7%与100%,A型为21.7%、71.7%与100%。(2)非结构蛋白3ABC抗体阳性率(两种方法复核结果):a1组一~四免分别为0.7%、1.4%、9.5%与4.8%;a2组和c组三次免疫均未检测到阳性;b组仅三免后阳性率为0.6%。3组灭活疫苗首次免疫牛的抗体合格率远不及70%,但加强免疫后抗体合格率均显著提高;非结构蛋白抗体检测结果表明有3组疫苗的抗原纯净度符合OIE的要求,但a1组灭活疫苗免疫后,仍然对感染与免疫鉴别诊断存在干扰;采用两种非结构蛋白抗体检测方法进行复核检验,可以提高感染与免疫鉴别诊断的准确性。本研究为口蹄疫免疫无疫评价方案的制定提供了科学依据。

关键词：口蹄疫灭活疫苗免疫效果抗原纯净度鉴别诊断

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口蹄疫病毒前导蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2020年第10期50卷 1215-1219页

作者：李娜袁红李平花孙普白兴文龚婷余琼朱国强李坤马雪青卢曾军包慧芳刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 河南牧业经济学院河南郑州450000

前导蛋白(Lpro)是口蹄疫病毒(FMDV)编码的重要毒力因子,在拮抗宿主抗病毒反应中发挥多种功能。为了获得抗Lpro的抗体以研究Lpro的功能,本研究将L基因克隆到pET-28a(+)原核表达质粒中,构建了重组表达质粒pET-28a-L,转化至大肠杆菌BL21中... 详细信息

前导蛋白(Lpro)是口蹄疫病毒(FMDV)编码的重要毒力因子,在拮抗宿主抗病毒反应中发挥多种功能。为了获得抗Lpro的抗体以研究Lpro的功能,本研究将L基因克隆到pET-28a(+)原核表达质粒中,构建了重组表达质粒pET-28a-L,转化至大肠杆菌BL21中进行重组蛋白的诱导表达,所获得重组His-Lpro主要以包涵体形式存在,利用Ni-NTA柱纯化获得了高纯度的His-Lpro,将His-重组Lpro与弗氏佐剂混合乳化后免疫新西兰大白兔,制备了高效价的Lpro兔多克隆抗体血清。通过免疫荧光试验(IFA)、免疫印迹试验(WB)检测Lpro兔多克隆抗体血清的反应原性。结果显示,该多抗血清能够特异性识别FMDV感染BHK21细胞后表达的Lpro,表明本研究制备的Lpro多抗血清具有很好的反应原性,为深入研究Lpro功能及其拮抗宿主天然免疫的作用机理奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒前导蛋白原核表达多克隆抗体

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