检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2009年第11期25卷 1646-1651页

作者：田占成刘光远殷宏罗建勋谢俊仁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株卵泡抑素基因的核苷酸序列(GenBank Accession ***248886)设计合成一对引物,从本实验室保藏的单克隆洁净长角血蜱饥饿成蜱中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出814bp的卵泡抑素基因,序列比对结果显示... 详细信息

参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株卵泡抑素基因的核苷酸序列(GenBank Accession ***248886)设计合成一对引物,从本实验室保藏的单克隆洁净长角血蜱饥饿成蜱中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出814bp的卵泡抑素基因,序列比对结果显示:与长角血蜱致病性Okayama株的核苷酸序列及氨基酸序列一致性分别为97.8%和99%,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1中进行表达,GST融合重组蛋白预期分子量为57kD。表达重组蛋白经MagneGSTTM蛋白纯化系统纯化后作为抗原分别与抗不同发育阶段长角血蜱(卵、幼蜱、若蜱、成蜱)多克隆抗体作为一抗进行免疫印迹,结果表明:与长角血蜱卵制备的多克隆抗体有很强的免疫反应,而与其他发育阶段(幼蜱、若蜱、成蜱)饥饿长角血蜱制备的多克隆抗体反应性很弱。以上结果表明:长角血蜱卵泡抑素蛋白在长角血蜱产卵及卵成熟发育时期的表达水平较其他发育阶段(幼蜱、若蜱、成蜱)的蛋白表达水平高。

关键词：长角血蜱卵泡抑素定性

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小反刍兽疫病毒基因组全长cDNA的构建及其序列的测定

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病毒学报 2010年第4期26卷 315-321页

作者：翟军军窦永喜张海瑞毛立蒙学莲骆学农才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

根据小反刍兽疫Nigeria75/1株全基因组序列设计并合成PPRV特异引物,进而应用RT-PCR技术分5段扩增了PPRV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段JF1、JF2、JF3、JF4和JF5分别克隆到载体上,建立了PPRV的初级cDNA克隆。在扩增5′末端时,引... 详细信息

根据小反刍兽疫Nigeria75/1株全基因组序列设计并合成PPRV特异引物,进而应用RT-PCR技术分5段扩增了PPRV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段JF1、JF2、JF3、JF4和JF5分别克隆到载体上,建立了PPRV的初级cDNA克隆。在扩增5′末端时,引入AscI酶切位点和T7启动子序列;在基因组3′末段引入PacI酶切位点,后者供cDNA模板的线性化之用。将扩增片段再依次连接,最后亚克隆到质粒pok12中,获得了PPRV全长基因组cDNA克隆pok12-PPRV。通过序列同源性和进化树分析,结果表明,Nigeria75/1与MV和RPV的遗传关系最近。Nigeria75/1株全长cDNA的序列测定及构建,为拯救PPRV和在分子水平进一步深入研究PPRV打下坚实的基础。

关键词：小反刍兽疫病毒 RT-PCR 全长cDNA克隆分子克隆

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猪囊尾蚴CE18重组蛋白的复性纯化及抗原性鉴定

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生物工程学报 2008年第8期24卷 1490-1495页

作者：张少华贾万忠骆学农景志忠吴国华郑亚东郭爱疆才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

猪囊尾蚴CE18重组蛋白(rCE18)在大肠杆菌表达后形成包涵体,为了获得高纯度的、有生物活性的rCE18,本研究采用超声破碎菌体,0.2%、2%DOC(脱氧胆酸钠)逐次洗涤包涵体及0.9%SKL(十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体后,利用透析与凝胶过滤层析技术... 详细信息

猪囊尾蚴CE18重组蛋白(rCE18)在大肠杆菌表达后形成包涵体,为了获得高纯度的、有生物活性的rCE18,本研究采用超声破碎菌体,0.2%、2%DOC(脱氧胆酸钠)逐次洗涤包涵体及0.9%SKL(十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体后,利用透析与凝胶过滤层析技术相结合对rCE18进行复性和纯化。同时,采用GST-FF亲和柱层析及SDS-PAGE胶回收蛋白两种方法纯化rCE18,比较三者的纯化效果。并通过间接ELISA检测复性蛋白的生物学活性。结果表明:经透析与凝胶层析复性纯化后的rCE18蛋白的纯度可达到60%以上,活性回收率为41.3%,间接ELISA证实,复性后的rCE18蛋白能特异性识别猪囊虫阳性血清,检测敏感性高达97.2%,与全囊虫抗原检测的符合率为100%。本试验初步建立了猪囊尾蚴rCE18包涵体纯化及复性的有效方法,为猪囊尾蚴rCE18蛋白的诊断应用奠定了基础。

关键词：猪囊尾蚴 CE18重组蛋白复性纯化透析凝胶过滤层析

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驽巴贝虫病间接ELISA检测方法的建立

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2010年第3期28卷 200-204页

作者：龚真莉刘光远谢俊仁柴慧萍张丽艳李知新田占成王路刘建刚中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫原病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

目的克隆表达驽巴贝虫诊断抗原基因BC48,建立间接ELISA诊断方法。方法从感染驽巴贝虫的毛驴血液中提取虫体基因组DNA,利用PCR技术扩增BC48基因,将其克隆入表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)... 详细信息

目的克隆表达驽巴贝虫诊断抗原基因BC48,建立间接ELISA诊断方法。方法从感染驽巴贝虫的毛驴血液中提取虫体基因组DNA,利用PCR技术扩增BC48基因,将其克隆入表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用镍柱亲和层析法纯化蛋白。以该蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA诊断方法 ,对反应条件进行优化,并对该方法的特异性和敏感性进行评价。结果扩增获得1272bp的BC48基因片段。重组表达质粒pET-28a-BC48诱导后获得大小约为Mr46000的可溶性融合蛋白,纯化后蛋白浓度为12.98mg/ml。间接ELISA方法条件优化的结果显示,最佳抗原包被浓度为65μg/ml,最适血清稀释度为1∶80,该融合蛋白可特异性地与驽巴贝虫感染血清结合,而不与马泰勒虫感染血清及阴性血清反应。使用该方法与镜检法检测17份散养毛驴血清样品,阳性检出率分别为3/17和2/17。结论以BC48重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于马属动物驽巴贝虫病的检测。

关键词：驽巴贝虫 BC48 表达纯化 ELISA

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羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性

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病毒学报 2008年第2期24卷 133-137页

作者：陈轶霞才学鹏景志忠丁军涛王颖蒙学莲张燕贾万忠乔军闫鸿斌房永祥陈国华骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)和已插入CpG序列的pcDNA3·1-CpG中,构建pcDNA3·1-P32、pcDNA3·1-CpG-P32和pcDNA3·1-CpG-MP32质粒;用脂质体法... 详细信息

通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)和已插入CpG序列的pcDNA3·1-CpG中,构建pcDNA3·1-P32、pcDNA3·1-CpG-P32和pcDNA3·1-CpG-MP32质粒;用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;经肌肉免疫注射健康BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测抗体;在免疫后的第3、5周取免疫小鼠的脾细胞,用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞亚群。结果所构建的真核表达载体在BHK-21细胞中都能表达P32蛋白;免疫小鼠血清在免疫第2周后均能检测到羊痘特异性IgG抗体;免疫组小鼠脾脏CD4+T细胞数目和CD4+/CD8+T细胞比值明显高于对照组。结果提示,所构建的真核载体可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,并能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答。

关键词：羊痘病毒 P32基因真核表达载体表达免疫原性

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猪带绦虫不同阶段45W-4BX和18kD基因联合表达及保护性分析

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中国农业科学 2007年第2期40卷 385-390页

作者：骆学农郑亚东窦永喜郭爱疆侯俊琳景志忠才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

【目的】获得不同发育阶段基因联合表达的具有良好免疫保护性的重组抗原,为研制高效的猪囊虫基因工程疫苗奠定基础。【方法】PCR扩增截去45W-4B基因的信号肽和C端17个疏水氨基酸序列,经BamH I和EcoR I酶切后与表达载体pGEX-4T-1连接转化... 详细信息

【目的】获得不同发育阶段基因联合表达的具有良好免疫保护性的重组抗原,为研制高效的猪囊虫基因工程疫苗奠定基础。【方法】PCR扩增截去45W-4B基因的信号肽和C端17个疏水氨基酸序列,经BamH I和EcoR I酶切后与表达载体pGEX-4T-1连接转化BL21感受态细胞,酶切及PCR扩增鉴定阳性克隆。测序正确的质粒经EcoR I和Not I酶切处理后与截去信号肽的18 kD基因连接,构建双基因融合表达载体pGEX-4BX/18。用IPTG诱导的表达产物,进行SDS-PAGE电泳、Western blot分析活性。分别用300μg重组GST-4BX、GST-4BX/18蛋白免疫猪,间接ELISA测定抗体水平。感染后90 d剖检计算各组的减虫率,比较评价重组抗原的免疫保护性。【结果】4BX/18 kD在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为50 kD的融合蛋白,并能被人囊虫和感染初期的猪囊虫阳性血清所识别。重组抗原免疫猪后45 d抗体达到峰值,联合表达重组抗原的减虫率为97%,GST-4BX免疫组的减虫率为95%。【结论】重组抗原4BX和4BX/18kD均具有较好的免疫保护效果,有望利用它们研制出抗猪囊尾蚴病的高效疫苗。

关键词：猪带绦虫 45W-4BX 18kD 联合表达免疫保护性分析

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亚洲带绦虫45 kDa雌激素调节蛋白的表达及其杂交瘤细胞株的筛选与鉴定

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2019年第1期37卷 70-74页

作者：王立群梁盼红张少华侯俊玲王莉杰毛立骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

目的筛选并制备亚洲带绦虫45 kDa雌激素调节蛋白(Ta EP45)的杂交瘤细胞株。方法设计带有酶切位点的特异性引物,以亚洲带绦虫成虫总RNA为模板, RT-PCR扩增Ta EP45完整的开放阅读框(ORF),克隆至原核表达载体pET-30a (+),转化至大肠埃希菌B... 详细信息

目的筛选并制备亚洲带绦虫45 kDa雌激素调节蛋白(Ta EP45)的杂交瘤细胞株。方法设计带有酶切位点的特异性引物,以亚洲带绦虫成虫总RNA为模板, RT-PCR扩增Ta EP45完整的开放阅读框(ORF),克隆至原核表达载体pET-30a (+),转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),用1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达带组氨酸(His)标签的TaEP4蛋白,用亚洲带绦虫囊尾蚴阳性猪血清蛋白质印迹(Western blotting)分析Ta EP45的反应原性。以纯化的Ta EP45免疫BALB/c小鼠(100μg/鼠,首次免疫用等量弗氏完全佐剂,第2、第3次免疫用等量弗氏不完全佐剂),选择血清抗体效价高的小鼠,取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,用纯化的Ta EP45和His标签蛋白ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,用亚洲带绦虫全虫抗原Western blotting鉴定杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。结果 RT-PCR扩增获得的Ta EP45基因ORF长1 362 bp,编码453个氨基酸。重组融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为60 000,可被亚洲带绦虫囊尾蚴阳性猪血清识别。筛选获得5株稳定分泌Ta EP45抗体的杂交瘤细胞株,其抗体效价均≥1∶2 430,亚型分别为IgG2b或IgG1。Western blotting分析结果显示, 5株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体均能与亚洲带绦虫全虫抗原发生反应。结论表达纯化了Ta EP45,筛选出5株能稳定分泌高滴度Ta EP45单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体能与亚洲带绦虫全虫抗原发生反应。

关键词：亚洲带绦虫 45 kDa雌激素调节蛋白杂交瘤细胞株

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微小牛蜱唾液腺cDNA文库的构建

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2008年第5期26卷 389-391页

作者：田占成刘光远谢俊仁龚真莉中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

从微小牛蜱唾液腺中提取RNA,纯化mRNA,合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体的两臂之间。用噬菌体蛋白包装产物对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠埃希菌ER1647,构建成微小牛蜱唾液腺的cDNA表达文库。经测定,文库... 详细信息

从微小牛蜱唾液腺中提取RNA,纯化mRNA,合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体的两臂之间。用噬菌体蛋白包装产物对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠埃希菌ER1647,构建成微小牛蜱唾液腺的cDNA表达文库。经测定,文库的库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU/ml。用兔抗微小牛蜱唾液腺蛋白阳性血清,对文库进行初步免疫学筛选,获得一个细胞色素氧化酶第2亚基cDNA序列。将该基因序列与GenBank中的序列进行同源性比对,发现与已知的其他物种细胞色素氧化酶第2亚基的氨基酸序列同源性为60%～77%。微小牛蜱唾液腺cDNA表达文库构建成功。

关键词：微小牛蜱唾液腺 cDNA文库构建

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CpG DNA重组质粒对猪囊尾蚴抗原的免疫佐剂效应研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2006年第2期24卷 150-152页

作者：景志忠蒙学莲王佩雅窦永喜李辉骆学农郑亚东才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省动物寄生虫病重点实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

用CpG基序寡核苷酸的重组质粒(CpGDNA)与猪囊尾蚴抗原制备疫苗免疫小鼠,检测小鼠抗囊尾蚴总抗体和IgG2a抗体亚类以及体外诱导免疫脾细胞分泌白介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)的含量,观察其免疫佐剂效应。发现CpGDNA重组质粒中无论插入... 详细信息

用CpG基序寡核苷酸的重组质粒(CpGDNA)与猪囊尾蚴抗原制备疫苗免疫小鼠,检测小鼠抗囊尾蚴总抗体和IgG2a抗体亚类以及体外诱导免疫脾细胞分泌白介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)的含量,观察其免疫佐剂效应。发现CpGDNA重组质粒中无论插入CpG基序多或少都能增强小鼠抗囊尾蚴总抗体和IgG2a抗体亚类含量,都具有免疫佐剂效应,但其免疫强度有差别,其中CpG2的佐剂效应最强;此外,CpGDNA重组质粒能与铝胶、206佐剂配伍发挥免疫增强协同作用。

关键词： CpG DNA 佐剂效应 Th1型协同作用

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猪带绦虫TSO45W-4BX与猪CD58分子在大肠埃希菌中的联合表达

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2006年第4期24卷 285-289页

作者：骆学农郑亚东窦永喜侯俊琳景志忠才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

目的以猪CD58为分子佐剂,将CD58基因与猪带绦虫疫苗候选抗原基因TSO45W-4BX联合表达,寻找新型抗猪囊尾蚴疫苗。方法分别以重组质粒pGEM-4B和pGEM-CD58为模板,PCR扩增猪带绦虫TSO45W-4BX基因和猪CD58基因,将TSO45W-4BX与酶切处理的pGEX-4... 详细信息

目的以猪CD58为分子佐剂,将CD58基因与猪带绦虫疫苗候选抗原基因TSO45W-4BX联合表达,寻找新型抗猪囊尾蚴疫苗。方法分别以重组质粒pGEM-4B和pGEM-CD58为模板,PCR扩增猪带绦虫TSO45W-4BX基因和猪CD58基因,将TSO45W-4BX与酶切处理的pGEX-4T-1定向连接,转化大肠埃希菌JM109,重组质粒经鉴定正确后,在其下游酶切插入CD58基因,PCR扩增和测序证明阅读框正确后,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE))和蛋白质印迹法(Westernblotting)分析表达产物的免疫活性。结果pGEX-4BX和pGEX-4BX/CD58分别表达Mr41000和Mr69000的融合蛋白,pGEX-4BX表达产物主要以可溶性形式存在,而pGEX-4BX/CD58却以包涵体形式存在,但两者都能被囊尾蚴病患者血清识别。结论TSO45W-4BX与CD58基因联合表达,TSO45W-4BX仍具有免疫活性。

关键词：猪带绦虫 TS045W-4BX CD58 联合表达

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