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第九届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：李文卉张念章杨洋刘垠鞠闫鸿斌李立贾万忠付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

引言脑多头蚴病是由多头带绦虫的幼虫(脑多头蚴)寄生于绵羊等中间宿主的中枢神经系统引起的一种绦虫蚴病,该病引起感染宿主的最终死亡,对养羊业造成巨大的经济损失,而且人也能被感染,是一种被忽视的人兽共患寄生虫病。

关键词：多头带绦虫发育阶段原头节不同部位

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羊口疮病毒ORF019基因的克隆及表达

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甘肃农业大学学报 2019年第6期54卷 1-7页

作者：沈岩尔贾怀杰王晓霞陈国华何小兵房永祥薛慧文景志忠甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃兰州730046 兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所甘肃兰州730000

【目的】克隆、分析羊口疮病毒(ORFV)的ORF019基因,进而表达、纯化和鉴定重组表达产物.【方法】根据GenBank登录的ORFV OV-SA00株(AY386264)E2L基因序列设计1对引物,以提取的ORFV/QH02/2010株基因组DNA为模板,通过PCR获得该毒株的ORF01... 详细信息

【目的】克隆、分析羊口疮病毒(ORFV)的ORF019基因,进而表达、纯化和鉴定重组表达产物.【方法】根据GenBank登录的ORFV OV-SA00株(AY386264)E2L基因序列设计1对引物,以提取的ORFV/QH02/2010株基因组DNA为模板,通过PCR获得该毒株的ORF019基因,将该基因连接至原核表达载体pET-32a(+)上,获得重组质粒pET-32a-ORF019,并对其测序,测序结果与副痘病毒属及其脊椎动物痘病毒亚科代表毒株的E2L蛋白进行一致性分析;并转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导获得重组融合蛋白,用SDS-PAGE和Western-blot对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-32a-ORF019,读码框正确;生物信息学分析发现,ORF019基因在副痘病毒属各成员间高度保守,也在脊椎动物痘病毒亚科痘病毒的遗传进化过程中保留了相对稳定的氨基酸残基;获得了约100 ku的融合蛋白表达产物,并以包涵体的形式存在于宿主菌.【结论】成功对ORFV019基因进行系统的遗传演化分析,并利用原核表达系统获得了重组表达产物.

关键词：羊口疮病毒 ORF019基因进化分析,原核表达纯化

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羊传染性脓疱病毒ORF047基因表达及其蛋白在细胞中的定位分析

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中国人兽共患病学报 2018年第2期34卷 129-132页

作者：陈国华贾怀杰何小兵王春燕金启旺景志忠中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点实验室兰州730046

目的克隆羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)ORF047基因,并进行真核表达及亚细胞定位,为筛选与其相互作用的蛋白提供依据。方法提取羊传染性脓疱病毒分离株的DNA,以其为模板,参照OV-SA00毒株(NC-005336.1)基因ORF047序列,采用PCR技术扩增... 详细信息

目的克隆羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)ORF047基因,并进行真核表达及亚细胞定位,为筛选与其相互作用的蛋白提供依据。方法提取羊传染性脓疱病毒分离株的DNA,以其为模板,参照OV-SA00毒株(NC-005336.1)基因ORF047序列,采用PCR技术扩增ORFV ORF047基因片段,凝胶回收后将其插入pEGFP-N1载体,构建重组质粒pEGFPORF047,测序后重组质粒共转染293T细胞,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。后将重组质粒pEGFP-ORF047与pHcRed1-Nuc、pHCRed1-mito、pHcRed1-ER分别共转染Vero-E6细胞,通过激光共聚焦显微镜对融合蛋白进行亚细胞定位分析。结果 ORFV ORF047基因片段大小为735bp;重组质粒pEGFP-ORF047能够在293T细胞中明显表达融合有目的分子的绿色荧光蛋白,Western blotting检测表达的融合蛋白大小约54kD;亚细胞定位分析表明,ORF047蛋白主要定位于胞浆中,少量在线粒体中。结论成功分析了ORF047基因的表达与其蛋白在亚细胞定位。

关键词：羊传染性脓疱病毒 ORF047基因定位

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山羊痘病毒L1R蛋白的原核表达及其免疫原性的研究

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中国兽医科学 2018年第4期48卷 450-455页

作者：牛贤云贾怀杰陈国华何小兵张君房永祥成温玉景志忠中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室

摘要：为探究山羊痘病毒LIR蛋白的免疫原性，将山羊痘病毒的LIR基因克隆到pET-30a（＋）原核表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取阳性克隆进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后进行纯化．将纯化的重组L1R蛋白免疫... 详细信息

摘要：为探究山羊痘病毒LIR蛋白的免疫原性，将山羊痘病毒的LIR基因克隆到pET-30a（＋）原核表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取阳性克隆进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后进行纯化．将纯化的重组L1R蛋白免疫BALB／c小鼠．通过间接ELISA、淋巴细胞增殖和微量中和试验研究重组LIR蛋白的免疫原性及其多克隆抗体的抗病毒作用。结果显示，成功表达出分子质量约为26ku的目的蛋白，其可被山羊抗绵羊痘阳性血清所特异性识别。重组LIR蛋白能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫，并且其多克隆抗体能够中和山羊痘病毒，从而证实山羊痘病毒LIR蛋白具有良好的免疫原性。

关键词：山羊痘病毒 LIR蛋白免疫原性

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羊口疮病毒青海QH02株ORF011基因的克隆、原核表达及鉴定

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中国病毒病杂志 2019年第3期9卷 188-194页

作者：耿嘉谦贾怀杰陈国华何小兵房永祥景志忠王晓霞兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所甘肃兰州730000 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃兰州730046

目的克隆羊口疮病毒QH02株ORF011基因并进行序列分析及原核表达、鉴定。方法提取羊口疮病毒QH02株的DNA,根据GenBank中(GU320351.1)的序列设计并合成引物,PCR扩增ORF011基因。将测序正确的序列用生物信息学软件对其基因及蛋白的结构进... 详细信息

目的克隆羊口疮病毒QH02株ORF011基因并进行序列分析及原核表达、鉴定。方法提取羊口疮病毒QH02株的DNA,根据GenBank中(GU320351.1)的序列设计并合成引物,PCR扩增ORF011基因。将测序正确的序列用生物信息学软件对其基因及蛋白的结构进行预测,并将基因构建至pET-32a(+)原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),挑取阳性克隆测序正确后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导表达,经十二烷基硫酸钠-十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)、Western-blot验证重组蛋白反应原性。结果 PCR扩增得到1 137 bp的ORF011基因片段,重组蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,重组蛋白相对分子质量为60×10~3,且纯度较高,Western-blot检测结果表明目的蛋白具有较好的反应原性。结论构建的原核表达系统可以成功表达B2L蛋白,经Western-blot验证具有良好的反应原性,可作为羊口疮防控产品研发的候选分子。

关键词：羊口疮病毒 ORF011基因克隆生物信息学分析原核表达

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新疆部分地区蜱传斑点热立克次体的分子流行病学研究

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甘肃农业大学学报 2019年第5期54卷 10-16页

作者：曲志强林汉亮许肖枫马力克·艾则孜罗毅马站孙晓林刘光远甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046 新疆维吾尔自治区动物卫生监督所新疆乌鲁木齐830011

【目的】调查新疆地区斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)在蜱虫中的感染情况及其分布.【方法】2018年4~5月,采用人工布旗法对新疆地区10个县(市)的游离蜱和寄生于家畜体表的蜱虫进行采集并鉴定.对采集的蜱虫提取... 详细信息

【目的】调查新疆地区斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)在蜱虫中的感染情况及其分布.【方法】2018年4~5月,采用人工布旗法对新疆地区10个县(市)的游离蜱和寄生于家畜体表的蜱虫进行采集并鉴定.对采集的蜱虫提取基因组,利用SFGR特异引物对提取的基因组进行PCR扩增及测序分析,用MEGA 6.0软件构建分子系统进化树.【结果】共采集蜱虫2 079只,经鉴定分析,采集的蜱种包括革蜱属、璃眼蜱属和扇头蜱属3属的7个种.扩增得到了包括拉欧蒂立克次体(Rickettsia raoultii)、斯洛伐克立克次体(Rickettsia slovaca)等在内的4种已知SFGR和2株未定种.对其阳性率进行统计结果表明,不同地区的蜱虫阳性率为40%~80%,平均阳性率为51.5%;不同蜱种间的感染率为1.1%~80%.【结论】通过对新疆地区SFGR病原的流行病学调查表明,被检地区SFGR病原阳性率较高,存在2种病原交叉感染现象,且扩增到的病原多属我国少见的人兽共患病病原.

关键词：蜱斑点热立克次体阳性率系统进化分析

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猪瘟C株疫苗诱导PBMCs中SLA等位基因差异性表达分析

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动物医学进展 2018年第2期39卷 7-13页

作者：李守杰贾怀杰成温玉王春燕金启旺景志忠中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃兰州730046

猪主要组织相容性复合体(SLA)广泛参与机体免疫应答与调节,具有重要的免疫学研究意义。在转录水平上对猪瘟C株疫苗免疫后猪外周血单个核细胞(PBMCs)中SLA的表达情况进行了初步研究。猪瘟C株疫苗免疫试验猪后,在0、3、5、9d分别采集4头... 详细信息

猪主要组织相容性复合体(SLA)广泛参与机体免疫应答与调节,具有重要的免疫学研究意义。在转录水平上对猪瘟C株疫苗免疫后猪外周血单个核细胞(PBMCs)中SLA的表达情况进行了初步研究。猪瘟C株疫苗免疫试验猪后,在0、3、5、9d分别采集4头猪的抗凝血分离外周血单个核细胞,通过逆转录荧光定量PCR技术(RT-qPCR)对外周血单个核细胞中的SLA进行转录水平的相对定量检测;并对试验猪SLA上调表达明显的cDNA模板进行了SLAⅡ类分子的克隆、测序及其系统发育树分析。结果显示,猪瘟C株疫苗免疫后,PBMCs中SLAⅠ、SLAⅡ类分子在短时间内均出现上调表达,一段时间后发生回降;测序分析发现,上调表达的SLA-DRA、SLA-DRB分子中存在高频表达序列。结果提示,猪瘟C株疫苗能够刺激机体产生猪瘟病毒相关的免疫应答,并存在SLA等位基因优势选用现象,这种优势选用可为猪瘟表位肽疫苗的研制提供理论依据。

关键词：猪主要组织相容性复合体猪瘟C株疫苗差异表达

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基于serpin重组蛋白的豆状囊尾蚴病间接ELISA诊断方法的初步建立

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中国兽医科学 2018年第4期48卷 443-449页

作者：王莉杰张少华毛立梁盼红王力王立群骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

为检测兔豆状囊尾蚴（Cysticercus pisiformis）感染，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增豆状囊尾蚴serpin基因，并对其开放阅读框（ORF）及编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。构建pET-30a（＋）-Cpserpin重组表达载体，并在大... 详细信息

为检测兔豆状囊尾蚴（Cysticercus pisiformis）感染，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增豆状囊尾蚴serpin基因，并对其开放阅读框（ORF）及编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。构建pET-30a（＋）-Cpserpin重组表达载体，并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。以纯化的重组蛋白（rCpserpin）为包被抗原．优化反应条件，建立检测兔豆状囊尾蚴病血清抗体的间接ELISA方法。结果表明，Cpserpin基因的完整ORF长为l149bp，含有serpin家族保守基序（DEEGAE）、serpin标签序列（FKVDHPFIFFI）以及serpin特有的反应中心环结构域（RCL）；rCpserpin主要以包涵体形式表达，且能被家兔豆状囊尾蚴阳性血清所识别。所建立的间接ELISA的最佳反应条件包括：rCpserpin包被质量浓度为2μg／mL，待检血清和酶标二抗的稀释度分别为1：100和1：2500，包被液和封闭液分别为pH9．6碳酸盐缓冲液和10g/L牛血清白蛋白。利用上述条件检测60份家兔豆状囊尾蚴阳性血清和108份阴性血清，证实该方法的临界值为0．368，敏感性和特异性分别为96．7％和93．5％。结果表明，基于Cpserpin重组蛋白的间接ELISA方法可用于家兔豆状囊尾蚴病的血清学诊断。

关键词：豆状囊尾蚴 Cpserpin 原核表达间接ELISA

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禽滑液囊支原体诊断与防控技术研究进展

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黑龙江畜牧兽医 2018年第9期 31-34,245页

作者：王昆宫晓炜陈启伟郑福英中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室/草食动物细菌病创新团队

禽滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）感染是一种以亚临床型上呼吸道感染为最常表现特征的禽支原体感染,一经发病,会给养殖户带来严重的经济损失。MS感染引起的滑膜炎可引起鸡关节肿大,同时累及气囊、腱鞘和胸骨。肿胀的足垫和关... 详细信息

禽滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）感染是一种以亚临床型上呼吸道感染为最常表现特征的禽支原体感染,一经发病,会给养殖户带来严重的经济损失。MS感染引起的滑膜炎可引起鸡关节肿大,同时累及气囊、腱鞘和胸骨。肿胀的足垫和关节可作为MS感染进展的指标,会导致鸡进行性消瘦。文章从MS诊断方法、药物治疗、疫苗免疫及净化鸡群等方面综合阐述了实验室检测MS所涉及的相关技术要点、鸡场MS防治所采取的相关措施及研究进展,旨在为鸡场MS清除计划提供最佳方案。

关键词：滑液囊支原体(MS) 流行病学诊断方法耐药性疫苗防控措施

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禽滑液囊支原体WF224株的分离鉴定及其致病性的研究

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中国兽医科学 2018年第4期48卷 472-478页

作者：王昆宫晓炜郑福英陈启伟刘永生杜晓华甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃兰州730046

摘要：用禽支原体16SrRNA引物对山东省潍坊市某养鸡场疑似禽滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）感染的气管棉拭子病料进行了PCR鉴定。结果可扩增到特异性条带。通过分离纯化获得MS分离株CHN—WF224—2016；低倍显微镜观察到，菌... 详细信息

摘要：用禽支原体16SrRNA引物对山东省潍坊市某养鸡场疑似禽滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）感染的气管棉拭子病料进行了PCR鉴定。结果可扩增到特异性条带。通过分离纯化获得MS分离株CHN—WF224—2016；低倍显微镜观察到，菌落呈典型的“荷包蛋”状；生化鉴定结果表明，该分离株能发酵葡萄糖，不水解精氨酸，不利用尿素。然后，将测序后的16SrRNA序列上传GenBank。MEGA分析和构建的系统发育树表明，CHN—WF224—2016分离株与其他MS菌株在同一进化分支上，为禽滑液囊支原体；其中与MS标准菌株（WVU1853）和河南商丘分离株（CHN-SQ27—2017）的相似性分别为99％和98％。用MS分离株CHN-WF224—2016感染21日龄的鸡．攻毒后第11天和第21天进行实验室解剖，观察临床症状及气管粘膜病理形态学改变：结果表明．分离株CHN—WF224-2016能引起典型的足垫肿胀和关节滑液囊炎。本研究结果证实。CHN—WF224—2016分离株致病性强，可作为今后疫苗研究的候选菌株。

关键词：禽滑液囊支原体 16sRNA 系统发育树致病性

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