检索结果-内蒙古大学图书馆

免疫学杂志 2020年第11期36卷 984-993页

作者：孙晶晶吴锦艳陈妍曹小安尹双辉周建华兰喜李学瑞刘永生尚佑军中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室730046

目的通过对不同布鲁氏菌疫苗免疫接种途径与免疫效果之间的关系来评价商品化布鲁氏菌疫苗免疫羊后非应答组与应答组之间细胞因子分泌水平的影响,进一步探索其合理的免疫方案。方法采用试管凝集试验(SAT)和虎红平板凝集试验(RBPT)方法检... 详细信息

目的通过对不同布鲁氏菌疫苗免疫接种途径与免疫效果之间的关系来评价商品化布鲁氏菌疫苗免疫羊后非应答组与应答组之间细胞因子分泌水平的影响,进一步探索其合理的免疫方案。方法采用试管凝集试验(SAT)和虎红平板凝集试验(RBPT)方法检测羔羊进行疫苗免疫后是否产生抗体分为非应答组和应答组,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测羊血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、MCP-1和IFN-γ细胞免疫水平。结果羔羊灌服接种S2疫苗免疫14 d内,非应答组细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、MCP-1和IFN-γ表达量均高于对照组,且IL-10表达量极显著升高(P<0.01),在免疫14 d时MCP-1的表达量显著升高(P<0.05);与非应答组相比,应答组IL-2、IL-4、IL-6和IL-10表达量均降低,MCP-1表达量升高,IFN-γ表达量则差异不大,且IL-2表达量极显著降低(P<0.01),在免疫7 d时IL-4和IL-6的表达量显著降低(P<0.05)。灌服接种M5疫苗免疫14 d内,非应答组与对照组相比,细胞因子IL-2、IL-4、IL-6和MCP-1的表达量先降低后升高,IL-10和IFN-γ表达量高于对照组;与非应答组相比,应答组IL-6和IFN-γ表达量升高,IL-4、IL-10和MCP-1先升高后降低,IL-2表达量则极显著降低(P<0.01),IL-4、IL-10、在免疫7 d时MCP-1和IFN-γ的表达量极显著升高(P<0.01)。皮下接种M5疫苗免疫14 d内,非应答组细胞因子IL-10、MCP-1和IFN-γ表达量均高于对照组,IL-2和IL-4,IL-6表达量先降低后升高,IFN-γ和MCP-1表达量显著升高(P<0.05);与非应答组相比,应答组IL-2、IL-6和IL-10的表达量均降低,IL-4的表达量升高,MCP-1和IFN-γ表达量则差异不大,且IL-2表达量极显著降低(P<0.01),在免疫14 d时IL-4的表达量显著升高(P<0.05)。皮下接种A19疫苗免疫14 d内,非应答组IL-4、IL-6、IL-10、MCP-1表达量均低于对照组,IL-2和IFN-γ表达量先升高后降低;与非应答组相比,应答组IL-4、IL-10、MCP-1和IFN-γ表达量均升高,IL-6表达量先升高后降低,IL-2的表达量则显著降低(P<0.05),在免疫7 d时IL-4和MCP-1的表达量显著升高(P<0.05),在免疫14 d时IL-4的表达量极显著升高(P<0.01),IL-10、MCP-1和IFN-γ的表达量显著升高(P<0.05)。结论 M5疫苗皮下注射接种免疫效果优于灌服接种;在灌服接种方面:S2疫苗免疫效果优于M5疫苗;在皮下注射接种方面:M5疫苗免疫效果优于A19疫苗。本研究为制定羊布鲁氏菌病合理的疫苗免疫方案提供了科学依据。

关键词：布鲁氏菌病绵羊布鲁氏菌疫苗细胞因子

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口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第10期24卷 975-978页

作者：高闪电常惠芸独军政王景锋周建华赵建勇谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD,并制备兔抗β6LBD多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体,构建的pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒... 详细信息

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD,并制备兔抗β6LBD多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体,构建的pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA方法测定抗体效价,并以Western blot鉴定其特异性。结果:SDS-PAGE电泳分析显示pGEX-4T-1-β6LBD诱导后表达一Mr约为42000的GST-β6LBD融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,用纯化GST-β6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性。结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白β6LBD多克隆抗体,为深入研究整联蛋白β6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础。

关键词：口蹄疫病毒受体整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体

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口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

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中国农业科学 2008年第11期41卷 3801-3808页

作者：蒋韬梁仲陈涓何继军吕律马维民刘在新刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/... 详细信息

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104LD50(1﹕128倍稀释乳鼠毒)的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。【结论】本试验研发的口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。

关键词： O、A、AsiaI型口蹄疫病毒胶体金免疫层析法

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慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立

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畜牧兽医学报 2019年第1期50卷 218-226页

作者：吴锦艳田宏蒙学莲惠小婷王耀杰关玉华尚佑军刘永生张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定... 详细信息

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID_(50)·0.1mL^(-1)由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。

关键词：小反刍兽疫病毒 SLAM Vero细胞系 Gateway技术慢病毒表达系统

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高致病性猪蓝耳病病毒GS/LZh/07株的分离、鉴定及其非结构蛋白Nsp2基因特性分析

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畜牧兽医学报 2009年第3期40卷 438-443页

作者：吴锦艳田宏尚佑军刘湘涛郑海学靳野尹双辉满自萍赵娜蔡承茹蔺芳谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,... 详细信息

将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,发现所扩增到的Nsp2基因有90个核苷酸的缺失。序列比对结果表明:该分离病毒Nsp2基因与经典毒株PRRSV-ch-1a核苷酸同源性为83.0%,氨基酸同源性为72.7%;与高致病性变异毒株NX和SD核苷酸同源性为95.5%,氨基酸同源性为90.9%,可见该毒来源于2006-2007年流行毒株,说明高致病性猪蓝耳病变异病毒已经在甘肃省存在。该毒株的成功分离为高致病性猪蓝耳病流行病学调查分析提供数据,也为预防控制该病积累了资料。Nsp2的特性分析为揭示高致病性猪蓝耳病PRRSV在甘肃省的流行特点提供参考。

关键词：高致病性猪蓝耳病病毒分离鉴定 Nsp2 特性分析

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小反刍兽疫病毒对鼠源树突状细胞成熟分化的影响

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免疫学杂志 2018年第5期34卷 369-377页

作者：李玲霞吴锦艳杜国玉冯倩王光祥陈研曹小安刘永生刘湘涛尚佑军中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

目的研究和探讨小反刍兽疫病毒(PPRV)对小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DCs)成熟和分化功能的影响。方法从小鼠骨髓中分离得到DCs,经过IL-4和GM-CSF诱导成熟;流式细胞术检测DCs表面共刺激分子表达及吞噬FITC-Dextran的能力;ELISA检测细胞... 详细信息

目的研究和探讨小反刍兽疫病毒(PPRV)对小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DCs)成熟和分化功能的影响。方法从小鼠骨髓中分离得到DCs,经过IL-4和GM-CSF诱导成熟;流式细胞术检测DCs表面共刺激分子表达及吞噬FITC-Dextran的能力;ELISA检测细胞因子IL-6、IL-12p40、IL-1β和IL-10的表达水平。结果利用LPS和PPRV处理DCs 24 h,发现与阳性对照LPS组相比,PPRV作用后显著抑制了CD40和MHC-Ⅱ的表达(P<0.05);滴度适度的PPRV可以显著增加CD40、CD80和CD86的表达,显著升高IL-6和IL-10的分泌(P<0.05),吞噬FITC-Dextran的能力并无显著差异,各组之间也无影响,且不同比例的PPRV对DC存活率无显著影响(P>0.05)。结论 PPRV在一定滴度范围内具有潜在的促进小鼠DC成熟的功能,为免疫学研究奠定基础。

关键词：小反刍兽疫病毒 BM-DC 细胞因子流式细胞术

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逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达

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畜牧兽医学报 2011年第4期42卷 527-532页

作者：吴锦艳田宏郑海学陈妍靳野尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞... 详细信息

本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性。用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性。结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱。免疫荧光检测发现所表达的T7RNAP蛋白具有良好的反应原性。本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具。

关键词： T7RNA聚合酶基因逆转录病毒载体 PK15细胞 SK6细胞稳定表达

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慢病毒介导稳定表达抑制PRRSV复制的shRNA细胞系的建立

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畜牧兽医学报 2016年第11期47卷 2280-2287页

作者：吴锦艳田宏尚佑军陈妍王光祥刘湘涛张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

利用慢病毒表达技术将稳定持续抑制PRRSV复制的shRNA导入Marc-145细胞,建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆,并从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因的干扰效果。采用LR重组技术,将pENTR/U6/Nsp9-4、pE... 详细信息

利用慢病毒表达技术将稳定持续抑制PRRSV复制的shRNA导入Marc-145细胞,建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆,并从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因的干扰效果。采用LR重组技术,将pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6及pENTR/U6/-CON分别与pDEST载体进行LR重组,获得表达骨架,重组后的表达载体在转染试剂介导下与已经优化的辅助质粒Vira PowerTM Packaging Mix共转染293-FT包装细胞,获得慢病毒样粒子,并用其感染Marc-145细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过PCR、CPE、TCID50、Real-time PCR和间接免疫荧光试验等方法分别验证上述细胞株的稳定整合以及其表达的shRNA对PRRSV增殖的抑制效果。结果显示:优势干扰序列和无关序列被稳定整合在靶细胞基因组上,无论观察细胞病变效应、免疫荧光产生情况、致细胞半数感染量还是实时定量分析相对表达量,与正常Marc-145和整合有无关序列的两株阴性对照细胞相比,整合有NSP9-4和NSP9-6的两株细胞由于表达了靶向抑制PRRSV复制的shRNA,PRRSV对其易感性降低,而且差别显著,分别将其命名为Marc/pU6/NSP9-4和Marc/pU6/NSP9-6。经验证,本研究成功构建两株稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA细胞——Marc/pU6/NSP9-4、Marc/pU6/NSP9-6,同时获得一株表达无意义shRNA的Marc/pU6-CON辅助细胞,该细胞表达的shRNA具有明显抑制PRRSV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因,也为PRRSV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等研究提供资料。

关键词： PRRSV shRNA Marc-145细胞系慢病毒表达技术

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羊口疮病毒F1L蛋白二级结构分析与表位预测

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中国人兽共患病学报 2012年第12期28卷 1185-1190页

作者：王光祥尚佑军吕占禄张克山田宏刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

目的利用软件预测羊口疮病毒(ORFV)F1L蛋白的二级结构和细胞表位。方法利用SOPMA服务器预测ORFV F1L蛋白的二级结构,以DNAStar软件单参数(二级结构、亲水性、可及性、柔韧性及抗原性)预测结果为基础,通过二级结构预测初步筛选,并以ABCp... 详细信息

目的利用软件预测羊口疮病毒(ORFV)F1L蛋白的二级结构和细胞表位。方法利用SOPMA服务器预测ORFV F1L蛋白的二级结构,以DNAStar软件单参数(二级结构、亲水性、可及性、柔韧性及抗原性)预测结果为基础,通过二级结构预测初步筛选,并以ABCpred方案作为最终验证,预测羊口疮病毒(ORFV)F1L蛋白的B细胞表位;运用神经网络+量化矩阵法(ANNs+QM法)预测ORFV F1L蛋白的CTL细胞表位;使用MHC-II类分子结合肽在线程序预测ORFV F1L蛋白的Th细胞表位。结果 ORFV F1L蛋白含有α-螺旋34.71%、β-片层18.82%、β-转角5.88%、无规则卷曲40.59%;没有信号肽,可能存在7个B细胞表位,2个CTL表位,3个Th细胞表位。结论该研究结果将为建立ORFV诊断方法、制备单克隆抗体及合成肽疫苗提供理论依据。

关键词：羊口疮病毒 F1L基因二级结构细胞表位预测

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抗原表位的研究方法及口蹄疫病毒抗原表位的研究进展

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微生物学通报 2008年第8期35卷 1302-1310页

作者：张中旺张永光中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

本文综述了近几年来用于B细胞表位及T细胞表位研究的常用方法及其在口蹄疫病毒抗原表位研究中的应用,并介绍了口蹄疫病毒抗原表位的研究进展。

关键词： B细胞表位 T细胞表位 FMDV

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