检索结果-内蒙古大学图书馆

中国农业科学 2009年第2期42卷 688-693页

作者：李平花白兴文卢曾军孙普郭建宏李冬曹伟军陈应理刘湘涛殷宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的... 详细信息

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48h后出现致细胞病变(CPE),第4代10h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力(LD50)差异不显著,具有相似的生物学特征。共转染试验重复多次,均拯救到FMDV病毒。【结论】成功建立了基于质粒为基础的FMDV的体内拯救方法。

关键词：口蹄疫病毒感染性分子克隆病毒拯救 T7RNA聚合酶

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FMDV非结构蛋白2C主要表位区与3AB基因的组合表达与活性分析

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生物工程学报 2009年第1期25卷 10-15页

作者：张小丽田美娜卢曾军付元芳马小军刘在新谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

近年的研究表明,口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面具有潜在的价值,为了建立敏感性更高的鉴别诊断方法,将截取了2C蛋白N-端和C-端的主要B细胞表位区和完整3AB蛋白基因组合后,进行了原核表达,... 详细信息

近年的研究表明,口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面具有潜在的价值,为了建立敏感性更高的鉴别诊断方法,将截取了2C蛋白N-端和C-端的主要B细胞表位区和完整3AB蛋白基因组合后,进行了原核表达,得到了分子量约为47.6kD的目的蛋白2C′3AB。通过Westernblotting分析证明,表达产物能被FMDV感染动物阳性血清识别,具有很好的反应性。以通过电泳纯化的目的蛋白作抗原进行间接ELISA检测不同来源的动物血清,结果表明,该抗原仅与感染动物血清具有很好的反应活性,而与健康动物与免疫动物血清无反应,说明重组蛋白2C′3AB可作为区分灭活疫苗免疫动物与感染动物的鉴别诊断抗原。用2C′3AB和3ABC为抗原进行间接ELISA,对比检测田间血清样品,结果显示2C′3AB-ELISA敏感性比3ABC-ELISA高。说明以重组蛋白2C′3AB作为鉴别诊断抗原,能进一步提高对临界值血清的检出率,这对区分灭活疫苗免疫动物与FMDV隐性感染动物与带毒动物具有非常重要的意义。

关键词： FMDV 非结构蛋白 2C’3 AB 原核表达活性分析

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O型口蹄疫病毒蛋白酶编码序列及氨基酸序列变化的分析

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中国人兽共患病学报 2009年第7期25卷 645-649页

作者：周建华丛国正常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

目的与方法从GenBank中下载了19株O型口蹄疫病毒的Lab、3C、3D基因,结合本实验室收录的FMDVOA/58Lab、3C、3D的序列信息,分析比较了三种FMDV蛋白酶(Lpro,3Cpro,3Dpol)的编码序列和氨基酸序列。结果这FMDV具有的蛋白酶的编码序列在突变... 详细信息

目的与方法从GenBank中下载了19株O型口蹄疫病毒的Lab、3C、3D基因,结合本实验室收录的FMDVOA/58Lab、3C、3D的序列信息,分析比较了三种FMDV蛋白酶(Lpro,3Cpro,3Dpol)的编码序列和氨基酸序列。结果这FMDV具有的蛋白酶的编码序列在突变上没有显著差异(P>0.05),而在氨基酸序列的突变上存在着显著差异(P<0.01)。通过多重比较发现Lpro与3Cpro和3Dpol在氨基酸突变上存在差异(P<0.05),而3Cpro和3Dpol之间突变差异不显著。结论利用Swiss-pdbViewer蛋白质分析软件模拟三种蛋白酶中各个突变热点氨基酸残基的替换,发现突变热点不影响三种蛋白酶的空间结构。这表明病毒基因组在复制过程中的突变只是FMDV变异的原始动力,而FMDV变异的方向性进化动力是感染FMDV的宿主细胞对病毒蛋白酶功能造成的选择压力。

关键词：口蹄疫病毒病毒蛋白酶突变

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持续感染黄牛体内口蹄疫病毒抗原性和血清中和特性分析

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畜牧兽医学报 2009年第5期40卷 697-705页

作者：沈小燕丛国正刘湘涛常惠芸林彤邵军军尚佑军谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

以口蹄疫病毒O/Akesu/58毒株感染黄牛获得口蹄疫病毒持续带毒动物,定期分离黄牛食道/咽喉部黏性液体(O/P液)和血清,研究病毒分离毒株抗原基因变异及其血清中和特性,从基因水平和血清学方面研究口蹄疫病毒持续感染分离株的抗原变异性。用... 详细信息

以口蹄疫病毒O/Akesu/58毒株感染黄牛获得口蹄疫病毒持续带毒动物,定期分离黄牛食道/咽喉部黏性液体(O/P液)和血清,研究病毒分离毒株抗原基因变异及其血清中和特性,从基因水平和血清学方面研究口蹄疫病毒持续感染分离株的抗原变异性。用RT-PCR扩增分离株抗原基因VP1,分析VP1基因变异情况;用微量血清中和试验检测了口蹄疫病毒持续感染血清与对应动物分离毒株的中和特性,并用液相阻断ELISA方法检测了口蹄疫病毒持续感染血清的抗体水平变化,并对其相关性进行了分析。结果发现所有持续感染分离毒株的VP1基因核苷酸和氨基酸同源性都在98%以上,没有碱基缺失或插入现象;与O/Akesu/58的核苷酸同源性仅为85%左右,氨基酸同源性也仅为90%。持续感染分离株VP1基因有多处位点发生突变,其中有16个核苷酸位点发生一致突变,但只有2个位点造成氨基酸突变(I 56→T、A 210→E);而持续感染分离毒株有4个核苷酸位点和3个氨基酸位点发生了颠换突变;同时证实不同时间分离株与对应血清都能相互中和,且中和作用能力随着时间延续呈下降趋势,最低为1∶80,具有较强的中和能力,这与LPB-ELISA检测结果基本一致。这说明口蹄疫病毒持续感染分离株抗原变异不显著,没有变异到动物自身血清不能识别的程度,而且分离毒株与自身动物血清具有较强的中和特性;在持续感染过程中,动物血清保持高水平抗体滴度,且持续感染毒株的分离与否与抗体水平没有显著相关性。

关键词：口蹄疫病毒抗原性持续感染血清抗体

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猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

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中国兽医科学 2009年第11期39卷 950-955页

作者：王光祥郑海学尚佑军刘艳红常艳燕田宏吴锦艳陈江涛刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2。将该质粒转染... 详细信息

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2。将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代,用PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV2核酸;间接免疫荧光可以检测到绿色荧光,表明有PCV2抗原存在。证明构建的双拷贝重组质粒具有感染性。

关键词：猪圆环病毒2型感染性克隆感染性

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病毒固有免疫识别受体研究进展

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第12期25卷 1217-1220页

作者：王景锋邵军军常惠芸高闪电李菁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

固有免疫应答是机体抵御病毒入侵的第一道防线,其前提则是病毒固有免疫识别受体对病毒感染相关模式分子的识别。目前病毒固有免疫识别受体主要是Toll样受体家族和RIG样受体家族的成员。现就这些受体的特征及其在识别病毒感染相关模式分... 详细信息

固有免疫应答是机体抵御病毒入侵的第一道防线,其前提则是病毒固有免疫识别受体对病毒感染相关模式分子的识别。目前病毒固有免疫识别受体主要是Toll样受体家族和RIG样受体家族的成员。现就这些受体的特征及其在识别病毒感染相关模式分子过程中的作用作一综述。

关键词：固有免疫病毒识别受体 TLR RLR

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含RGD受体结合位点口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株的拯救及初步鉴定

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微生物学报 2009年第7期49卷 943-948页

作者：李平花白兴文曹伟军卢曾军孙普殷宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

【目的】构建含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)受体结合位点口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JS/China/2005株的全长感染性cDNA克隆。【方法】采用定点突变方法,构建Asia1型FMDV含有预期突变的全长cDNA克隆pFMDV-RGD。pFMDV-RGD重组质粒经NotI线... 详细信息

【目的】构建含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)受体结合位点口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JS/China/2005株的全长感染性cDNA克隆。【方法】采用定点突变方法,构建Asia1型FMDV含有预期突变的全长cDNA克隆pFMDV-RGD。pFMDV-RGD重组质粒经NotI线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行FMDV-RGD病毒拯救。【结果】序列测定结果表明成功构建了FMDV含有RGD受体位点的Asia1/JS/China/2005全长cDNA克隆。共转染试验获得拯救病毒,对拯救的病毒分别进行序列测定、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析,表明成功拯救了含有RGD受体结合位点的Asia1/JS/China/2005株FMDV。【结论】该试验为进一步研究含有RGD和RDD受体结合位点2个拯救病毒生物学特性的差异奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 RGD受体结合位点感染性cDNA克隆病毒拯救

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口蹄疫病毒反向遗传学研究进展

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微生物学通报 2009年第1期36卷 106-112页

作者：白兴文李平花刘在新刘湘涛谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

反向遗传学操作技术在口蹄疫病毒(FMDV)病原学基础研究领域的应用,使得人们能够在基因组整体水平上研究病毒基因的功能。得益于反向遗传学系统的不断完善和发展,目前人们对FMDV分子病原学也有了更加深入的认识和理解。本文结合实验室在F... 详细信息

反向遗传学操作技术在口蹄疫病毒(FMDV)病原学基础研究领域的应用,使得人们能够在基因组整体水平上研究病毒基因的功能。得益于反向遗传学系统的不断完善和发展,目前人们对FMDV分子病原学也有了更加深入的认识和理解。本文结合实验室在FMDV反向遗传学方向上所开展的探索性研究工作,综述了国内外利用反向遗传学操作技术在研究FMDV分子致病机制、病毒毒力与变异的关系、病毒复制的影响因素、新型FMD基因疫苗的研制等领域所取得的进展,展望FMDV反向遗传学研究新动向。

关键词：口蹄疫病毒反向遗传学感染性分子克隆

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口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株基因组全长感染性克隆的构建

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畜牧兽医学报 2009年第5期40卷 706-711页

作者：李平花白兴文卢曾军孙普郭建宏曹伟军刘湘涛殷宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 甘肃农业大学兰州730070

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3′端覆盖口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBluescriptSK+载体上。利用融合PCR扩增到基因组5′端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp)... 详细信息

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3′端覆盖口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBluescriptSK+载体上。利用融合PCR扩增到基因组5′端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体。最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆。以构建的FMDV Asia1/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒。该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 Asia1/JS/China/2005株全长cDNA 转录物RNA 病毒拯救

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抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体相对亲和力的测定

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中国免疫学杂志 2009年第4期25卷 333-335页

作者：宋帅林彤邵军军常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

目的:对3株O型口蹄疫病毒单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力进行测定。方法:用纯化的O型口蹄疫病毒作为包被抗原建立一种检测方法,将3株单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)制备腹水并纯化,并用建立的检测方法测定3株单克隆抗体(4A9、4C3... 详细信息

目的:对3株O型口蹄疫病毒单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力进行测定。方法:用纯化的O型口蹄疫病毒作为包被抗原建立一种检测方法,将3株单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)制备腹水并纯化,并用建立的检测方法测定3株单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力。结果:检测方法中抗原、酶标抗体的最佳稀释度分别为1∶800和1∶10000,单抗的相对亲和力分别为:4A9约在5.242μg/ml(1∶600),4C3约在0.763μg/ml(1∶5000),9F12约在0.127μg/ml(1∶40000),即9F12>4C3>4A9。结论:用建立的ELISA方法测定了3株O型口蹄疫病毒单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力,将为进一步研究口蹄疫病毒而选取合适的单抗提供理论依据。

关键词： O型口蹄疫病毒单克隆抗体相对亲和力

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