检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2019年第6期49卷 700-706页

作者：杜国玉吴锦艳曹小安李玲霞冯倩尹双辉周建华刘永杰尚佑军刘湘涛刘永生中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室

为了探讨羊口疮病毒ORFV129蛋白对小鼠骨髓树突状细胞(DCs)生物免疫学功能的影响,从小鼠骨髓腔中分离获得单核细胞,诱导分化为未成熟DCs并用不同浓度的ORFV129蛋白进行刺激,采用流式细胞术检测成熟DCs的表面标记物MHC-Ⅱ、CD40等表达及... 详细信息

为了探讨羊口疮病毒ORFV129蛋白对小鼠骨髓树突状细胞(DCs)生物免疫学功能的影响,从小鼠骨髓腔中分离获得单核细胞,诱导分化为未成熟DCs并用不同浓度的ORFV129蛋白进行刺激,采用流式细胞术检测成熟DCs的表面标记物MHC-Ⅱ、CD40等表达及吞噬FITC-dextran的能力,以及检测ORFV129蛋白作用DCs后分泌IFN-γ、IL-6等细胞因子的水平;采用CCK8法检测ORFV129蛋白对DCs刺激T细胞增殖的影响以及检测培养上清中IFN-γ、IL-5的水平。结果显示,经10μg与5μg浓度的ORFV129蛋白作用24 h后,DCs表面分子CD80、CD40的表达显著上调,与未处理组相比差异显著(P<0.05);经ORFV129蛋白刺激后DCs吞噬FITC-dextran的能力下降;10μg的ORFV129蛋白极显著地促进了IFN-γ、IL-6、IL-12p40等细胞因子的表达,与空白组相比差异极显著(P<0.01);另外,经ORFV129蛋白处理的DCs还可刺激T细胞增殖,以及使培养上清中IFN-γ的分泌量显著增加。ORFV129蛋白可上调DCs表面MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86分子表达,降低其吞噬能力,促进DCs分泌IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12p40等细胞因子,还可刺激T细胞增殖,表明ORFV129蛋白对DCs的成熟起到促进作用。

关键词： ORFV129蛋白树突状细胞细胞因子吞噬作用 T淋巴细胞

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靶向抑制PRRSV复制的Nsp9/shRNA的筛选及干扰

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中国兽医学报 2019年第1期39卷 14-20页

作者：吴锦艳田宏陈妍王光祥尚佑军张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,使机体具有抗病毒的功效,本试验针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp9基因设计多对shRNA序列,并从细胞水平验证其干扰效果,从中筛选可以使Nsp9基因沉默的优势shRNA序列。利用BLOCK-iTTM R... 详细信息

RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,使机体具有抗病毒的功效,本试验针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp9基因设计多对shRNA序列,并从细胞水平验证其干扰效果,从中筛选可以使Nsp9基因沉默的优势shRNA序列。利用BLOCK-iTTM RNAi Designer软件设计并合成shRNA对应的DNA序列-ds Oligo,构建入门载体pENTR/U6/shRNA;采用共转染技术,经荧光显微镜观察、流式细胞仪检测及Real-time RT-PCR分析等方法筛选优势干扰序列。结果显示:成功构建的6对pENTR/U6/Nsp9-shRNA均具有抑制Nsp9基因表达的效果,其中pENTR/U6/Nsp9-4和pENTR/U6/Nsp9-6的抑制效果更为突出,同时成功构建1对无意义对照pENTR/U6/con-shRNA。结果表明:pENTR/U6/Nsp9-4和pENTR/U6/Nsp9-6两株优势干扰序列的成功筛选可为构建具有干扰PRRSV复制效果的稳定细胞系以及靶向PRRSV的siRNA的转基因动物提供素材。

关键词： PRRSV Nsp9/shRNA RNA干扰筛选

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羊口疮病毒疫苗株和野毒株F1L基因的比较分析

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中国动物传染病学报 2019年第4期27卷 83-87页

作者：王文莉魏楠楠徐守兴卢炳洲张大俊张克山郑海学刘湘涛甘肃省动物疫病预防控制中心兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的人兽共患传染病,ORFV F1L基因编码肝素结合蛋白。为比较分析ORFV疫苗株和野毒株编码的F1L基因的特征,本试验对疫苗株和野毒株的F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学... 详细信息

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的人兽共患传染病,ORFV F1L基因编码肝素结合蛋白。为比较分析ORFV疫苗株和野毒株编码的F1L基因的特征,本试验对疫苗株和野毒株的F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学相关软件及方法,对两者的F1L基因在核酸水平和氨基酸水平的变异情况及其二、三级蛋白结构变化情况进行了比较分析。结果显示,此次测定的ORFV疫苗株与野毒株F1L基因核苷酸序列相似性为95.9%,氨基酸序列相似性为94.5%。本研究结果为揭示ORFV异源宿主致弱的机制积累了资料。

关键词：羊口疮病毒疫苗株野毒株 F1L基因

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不同ELISA试剂盒检测感染猪口蹄疫病毒3ABC抗体效果比较

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动物医学进展 2019年第2期40卷 39-44页

作者：王文莉刘华南卢炳州赵俊皓徐守兴胡永浩郑海学张克山刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗... 详细信息

为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗体全部转为阳性;3种试剂盒检测最早3ABC抗体与症状对应关系有差异,每两种商业试剂盒呈现不同程度的相关性。其中A试剂盒显示出最大的灵敏度,而B试剂盒显示最高的特异性,C试剂盒的敏感性依可疑样品的处理方式而变化,因此对3种试剂盒进行比较,发现A试剂盒更稳定,更适合于猪FMDV非结构蛋白抗体检测。

关键词：口蹄疫病毒 3ABC抗体酶联免疫吸附试验猪

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小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2019年第10期49卷 1277-1282页

作者：周岩岩李玲霞吴锦艳余树芳李娇阳刘丹冯倩孙晶晶何苗魏凡华尚佑军宁夏大学农学院宁夏银川750021 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化... 详细信息

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。

关键词：小反刍兽疫病毒 N基因原核表达

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TPL2促进口蹄疫病毒在BHK-21细胞复制

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畜牧兽医学报 2018年第6期49卷 1204-1211页

作者：魏南南徐守兴史喜娟卢炳州张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

为研究肿瘤进行性位点2(TPL2)在仓鼠肾细胞(BHK-21)中对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,使用FMDV感染BHK-21细胞,通过qRT-PCR技术检测FMDV感染对内源性TPL2转录水平的影响;根据GenBank公布的TPL2基因序列(NM007746.2)设计构建TPL2的真核表... 详细信息

为研究肿瘤进行性位点2(TPL2)在仓鼠肾细胞(BHK-21)中对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,使用FMDV感染BHK-21细胞,通过qRT-PCR技术检测FMDV感染对内源性TPL2转录水平的影响;根据GenBank公布的TPL2基因序列(NM007746.2)设计构建TPL2的真核表达质粒以及设计并合成宿主TPL2的RNAi序列,利用脂质体方法转染BHK-21细胞,通过qRT-PCR和Western blotting技术分析TPL2在BHK-21细胞过表达和干扰对FMDV复制的影响。结果表明,FMDV感染BHK-21细胞后,TPL2转录水平显著上调;过表达TPL2能够促进FMDV在BHK-21细胞中复制,而下调表达内源性TPL2后FMDV的复制受到抑制,表明TPL2促进FMDV在BHK-21细胞中进行复制,本结果进一步拓展了我们对FMDV与天然免疫机制之间关系的认识,同时为TPL2的相关研究积累了科学资料。

关键词： TPL2 口蹄疫病毒 FMDV BHK-21细胞天然免疫复制

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小反刍兽疫病毒对鼠源树突状细胞成熟分化的影响

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免疫学杂志 2018年第5期34卷 369-377页

作者：李玲霞吴锦艳杜国玉冯倩王光祥陈研曹小安刘永生刘湘涛尚佑军中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

目的研究和探讨小反刍兽疫病毒(PPRV)对小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DCs)成熟和分化功能的影响。方法从小鼠骨髓中分离得到DCs,经过IL-4和GM-CSF诱导成熟;流式细胞术检测DCs表面共刺激分子表达及吞噬FITC-Dextran的能力;ELISA检测细胞... 详细信息

目的研究和探讨小反刍兽疫病毒(PPRV)对小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DCs)成熟和分化功能的影响。方法从小鼠骨髓中分离得到DCs,经过IL-4和GM-CSF诱导成熟;流式细胞术检测DCs表面共刺激分子表达及吞噬FITC-Dextran的能力;ELISA检测细胞因子IL-6、IL-12p40、IL-1β和IL-10的表达水平。结果利用LPS和PPRV处理DCs 24 h,发现与阳性对照LPS组相比,PPRV作用后显著抑制了CD40和MHC-Ⅱ的表达(P<0.05);滴度适度的PPRV可以显著增加CD40、CD80和CD86的表达,显著升高IL-6和IL-10的分泌(P<0.05),吞噬FITC-Dextran的能力并无显著差异,各组之间也无影响,且不同比例的PPRV对DC存活率无显著影响(P>0.05)。结论 PPRV在一定滴度范围内具有潜在的促进小鼠DC成熟的功能,为免疫学研究奠定基础。

关键词：小反刍兽疫病毒 BM-DC 细胞因子流式细胞术

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口疮病毒112基因的原核表达及生物信息学分析

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中国兽医科学 2018年第7期48卷 811-817页

作者：冯倩吴锦艳王光祥陈妍杜国玉李玲霞尚佑军张志东刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室

为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a（＋）中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a（＋）-ORFV 112,... 详细信息

为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a（＋）中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a（＋）-ORFV 112,并转化到Rosetta（DE3）感受态细胞中,用IPTG进行诱导重组ORFV 112蛋白表达,并分别进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定,并运用生物信息学软件对口疮病毒112蛋白的性质和结构进行预测分析。结果表明,ORFV 112基因的大小约为861 bp;通过重组表达的融合蛋白大小约为40 ku;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该蛋白具有免疫反应原性。预测分析表明,ORFV 112蛋白分子式为C1357H2155N367O451S11,理论等电点（PI）为4.68,消光系数为23 295,脂肪指数为81.78,总平均疏水性（GRAVY）为-0.383,其二级结构主要以α-螺旋（29.37%）和无规则卷曲（40.56%）构成。本研究为深入研究口疮病毒112蛋白结构与功能及该蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

关键词：口疮病毒 ORFV 112基因原核表达生物信息学分析

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羊传染性脓疱病毒耐热冻干保护剂筛选及冻干曲线优化

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中国兽医学报 2018年第2期38卷 266-271页

作者：王光祥尚佑军王艳华宋成怡吴锦艳陈妍田宏刘湘涛张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室

采用冻干试验筛选出保护剂基础配方，再通过Plackett—Burman设计法筛选主要保护剂基质，然后通过Box-Behnken响应面分析法对羊传染性脓疱病毒（ORFV）耐热保护剂配方进一步优化，用冻干试验进一步验证筛选出1种针对ORFV保护效果最好的... 详细信息

采用冻干试验筛选出保护剂基础配方，再通过Plackett—Burman设计法筛选主要保护剂基质，然后通过Box-Behnken响应面分析法对羊传染性脓疱病毒（ORFV）耐热保护剂配方进一步优化，用冻干试验进一步验证筛选出1种针对ORFV保护效果最好的耐热冻干保护剂作为疫苗用候选配方。同时，依据前期试验获得的活疫苗冻干曲线，通过进一步优化，获得疫苗最佳冻千曲线。利用该冻干工艺冻干的疫苗，保护剂的保护率可达95．3％，且疫苗各项指标均达到《中华人民共和国兽用生物制品规程》要求。经37℃保存7，15，30d病毒滴度分别下降0．46，0．70，1．00；2～8℃保存3，6，12，24个月病毒滴度分别下降0．10，0．10，0．40，0．60，证明此配方制备的疫苗具有良好的热稳定性。本试验解决了ORFV细胞弱毒疫苗仅能在低温条件下保存和运输的瓶颈技术问题，使疫苗的储存、运输更为方便。

关键词：羊传染性脓疱病毒耐热冻干保护剂冻干曲线

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羊口疮病毒疫苗株与野毒株VIL-10基因的比较分析

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中国畜牧兽医 2018年第9期45卷 2368-2376页

作者：冯倩吴锦艳陈妍刘永杰张克山尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

试验旨在比较分析羊口疮病毒(orf virus,ORFV)VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的V... 详细信息

试验旨在比较分析羊口疮病毒(orf virus,ORFV)VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的VIL-10基因全序列并进行测序,应用生物信息学相关软件分析基因的核苷酸、氨基酸变异情况及蛋白结构。结果显示,本试验测定的疫苗株和野毒株VIL-10基因核苷酸序列同源性为94.4%,差异主要是单个碱基的突变,其中疫苗株在132~134bp核苷酸序列出现缺失;氨基酸序列同源性为92.5%,出现了15个氨基酸位点的突变,其中疫苗株第42位氨基酸天冬酰胺出现缺失;蛋白质在一级结构及理化性质、二级结构、三级结构、抗原表位参数及有无信号肽之间均存在一定程度的差异,而疫苗株和野毒株编码的蛋白质均无跨膜结构域。系统进化树分析结果表明,本试验测定的野毒株与疫苗株属于不同分支,遗传关系较远。研究结果提示,野毒株与疫苗株的VIL-10基因发生较明显的变异,这些变异可能与ORFV疫苗株的毒力致弱有关。

关键词：羊口疮病毒(ORFV) 疫苗株野毒株 VIL-10基因比较分析

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