检索结果-内蒙古大学图书馆

甘肃农业大学学报 2015年第3期50卷 35-39,48页

作者：龚真莉蒋韬祁淑芸陈国栋李勇刘艳红中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 中农威特生物科技股份有限公司甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

利用微波多肽合成仪Liberty,合成O型口蹄疫病毒VP1 140～160和200～213氨基酸序列的两条肽段,并用高压液相色谱仪及质谱分析仪就合成的多肽片段进行分析纯化和鉴定;将合成的多肽片段作为半抗原与载体蛋白BSA偶联,免疫小鼠,进行血清制备... 详细信息

利用微波多肽合成仪Liberty,合成O型口蹄疫病毒VP1 140～160和200～213氨基酸序列的两条肽段,并用高压液相色谱仪及质谱分析仪就合成的多肽片段进行分析纯化和鉴定;将合成的多肽片段作为半抗原与载体蛋白BSA偶联,免疫小鼠,进行血清制备和抗体效价测定.结果表明：成功合成了口蹄疫2条免疫功能短肽,其纯度均达到80%以上.半抗原成功与载体蛋白偶联;小鼠抗血清经过抗体效价检测证明半抗原与载体蛋白偶联组的抗体水平高于其余2个对照组,但是达不到免疫保护的水平.同时说明Liberty是一种操作简单、方便,合成效率高的多肽合成仪,可高效合成研究用多肽.

关键词：口蹄疫病毒微波多肽合成免疫功能肽段

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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因的克隆与序列分析

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甘肃畜牧兽医 2015年第8期45卷 33-34页

作者：王鼎元杜平刘学荣黄银君牟克斌甘肃农业大学甘肃兰州730070 中农威特生物科技股份有限公司甘肃兰州730046 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病督学重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

以期从结构上阐明猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的生物学特性,为研究病毒的基因功能和遗传变异提供资料。本文采用RT-PCR技术,对NV/Nx/2008猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF6基因进行了克隆,并对其序列进行比对,结果显示M蛋白在蓝耳病各血清... 详细信息

以期从结构上阐明猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的生物学特性,为研究病毒的基因功能和遗传变异提供资料。本文采用RT-PCR技术,对NV/Nx/2008猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF6基因进行了克隆,并对其序列进行比对,结果显示M蛋白在蓝耳病各血清型间高度保守;分子中含有2个糖基化位点及多个酪蛋白激酶II、蛋白激酶C磷酸化位点及N-豆蔻酰化位点和氨基化位点;空间结构和烟酰胺核苷酸转氢酶结构域III的空间结构相似。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF6基因克隆序列分析

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表达H120 S基因膜外区段的重组鸡传染性支气管炎病毒的拯救

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病毒学报 2014年第6期30卷 668-674页

作者：魏衍全郭慧琛王海明孙德惠韩世充孙世琪中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

为探索以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)Beaudette毒株为骨架表达H120纤突蛋白膜外区的可行性,本研究利用RT-PCR技术,扩增得到H120纤突基因膜外区段(1 302bp),将其置换到IBV Beaudette株全长cDNA克隆相应区段,... 详细信息

为探索以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)Beaudette毒株为骨架表达H120纤突蛋白膜外区的可行性,本研究利用RT-PCR技术,扩增得到H120纤突基因膜外区段(1 302bp),将其置换到IBV Beaudette株全长cDNA克隆相应区段,构建了含有上述区段的重组IBV cDNA克隆BeauR-H120(S1)。然后直接将BeauR-H120(S1)作为DNA模板在体外转录出病毒基因组RNA,该转录产物电转入Vero细胞后48h收获细胞继续传代,直至第4代时出现合胞体,拯救获得一株重组IBV(rBeau-H120(S1))。通过RT-PCR方法证明rBeauH120(S1)基因组中包含有完整的H120纤突基因膜外区段。Western-blot试验证实rBeau-H120(S1)的N蛋白有表达,表明重组病毒在Vero细胞内进行了增殖。经连续传代后测定rBeau-H120(S1)的TCID50和EID50,结果显示,该重组病毒在Vero细胞中的滴度可达到105.90±0.22 TCID50/mL,在9日龄SPF鸡胚中生长滴度为106.13±0.23EID50/mL。免疫保护实验表明,在接种重组病毒21d时,鸡群抗体阳性率达到90%,使用强毒株M41(103 EID50/只)攻毒时免疫保护率为85%。本研究采用反向遗传操作技术构建的重组IBV,为进一步研制IBV重组基因工程疫苗奠定了基础。

关键词：传染性支气管炎病毒重组病毒纤突蛋白膜外区 H120株

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牛浮舰蛋白-2在真核细胞中的表达与鉴定

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中国兽医科学 2014年第5期44卷 463-469页

作者：孙东杰赵峰张杰中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

采用基因重组法将牛浮舰蛋白-2(Flotillin-2)基因的整个开放阅读框(ORF)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His(B),通过脂质体法将重组质粒转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,利用Western-blot分析目的基因的表达情况。为确定35ku的小蛋白来源... 详细信息

采用基因重组法将牛浮舰蛋白-2(Flotillin-2)基因的整个开放阅读框(ORF)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His(B),通过脂质体法将重组质粒转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,利用Western-blot分析目的基因的表达情况。为确定35ku的小蛋白来源,采用融合PCR法构建突变体,分别利用标签抗体和针对浮舰蛋白-2的抗体鉴定突变体表达蛋白的特性。测序结果表明,成功构建了Flotillin-2基因的全长ORF及其突变体mFlotillin-2的重组质粒。Western-blot结果显示,Flotillin-2基因的全长ORF在CHO细胞中表达时除出现与预期大小相一致的48ku目的蛋白带外,还有1个35ku的条带。基因序列分析发现,在第430~438位核苷酸存在1个似Kozak序列(CGCATGGGC)。将ATG突变成GCT(丙氨酸)后,Western-blot结果显示,突变前后35ku的小蛋白始终存在。本研究以pcDNA3.1(-)/Myc-His(B)为载体,实现了牛Flotillin-2基因的全长ORF的真核表达,证明了35ku小蛋白并不是由于重新起始翻译导致的,而可能是浮舰蛋白-2在翻译过程中的裂解产物。

关键词：浮舰蛋白-2 中国仓鼠卵巢细胞突变体真核表达融合PCR

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口蹄疫病毒Asia 1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析

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中国兽医科学 2014年第8期44卷 771-780页

作者：仝燕许陈豪泰潘丽张永光王永录中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动... 详细信息

通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动子,在5′UTR内引入SpeⅠ酶切鉴定位点,在3′末端引入NotⅠ酶切位点,将融合片段和3′端长片段顺次连接到载体pSL1180。经T7体外转录系统获取的RNA转录本与脂质体共转染BHK21细胞。测序结果表明,构建的病毒基因组全长cDNA为8 197nt,分别包括1个长为1 095nt的5′UTR[含有1个17nt的ploy(C)];1个长6 990nt的ORF;1个长为93nt的3′UTR;之后是18nt的poly(A)尾巴。该全长cDNA克隆与Asia 1/Jiangsu/China/2005株基因组序列的同源性为98.4%。测序和酶切鉴定结果均表明,该口蹄疫病毒株全长cDNA克隆已构建成功,该方法极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。通过反转录聚合酶链反应、间接免疫荧光试验和蚀斑试验等鉴定,本试验获得了感染性分子克隆;体外拯救获得的基因工程病毒连续传代培养后,可致BHK21细胞产生病变。上述结果表明,构建的cDNA克隆可以作为基因操作的载体,为深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒Asia 1型感染性全长cDNA RNA体外转录本序列分析病毒拯救

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利用SMART技术构建猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库

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中国兽医学报 2014年第6期34卷 865-868页

作者：宋江伟田宏吴锦艳陈妍尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

本研究旨在建立猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库,进而为研究猪瘟病毒的基因功能及致病机理提供良好的试验体系。体外培养猪血管内皮细胞,提取细胞总RNA,并用Oligotex mRNA Mini Kit纯化PolyA+mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA... 详细信息

本研究旨在建立猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库,进而为研究猪瘟病毒的基因功能及致病机理提供良好的试验体系。体外培养猪血管内皮细胞,提取细胞总RNA,并用Oligotex mRNA Mini Kit纯化PolyA+mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。经CHROMA SPINTM TE-400Column纯化后的dsDNA与线性化的pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞Y187中,以同源重组的方式在酵母细胞内构建猪血管内皮细胞cDNA文库。结果获得的文库容量在6×106 CFU/mL,随机挑选24个克隆进行PCR检测,插入的片段大小集中在400~2 000bp之间,平均插入长度为1 000bp左右,文库重组率为100%。本研究为从文库中高通量地筛选出与猪瘟病毒互作的重组子,即寻找与该病毒相互作用的受体蛋白奠定了坚实的基础。

关键词：猪血管内皮细胞 cDNA文库 SMART技术

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口蹄疫病毒O/CHN/Mya98/33-P株前导蛋白对病毒感染性的影响

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微生物学通报 2014年第10期41卷 2052-2060页

作者：张萌白兴文李平花范朋举包慧芳孙普卢曾军曹轶梅陈应理刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

【目的】研究口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)前导蛋白对于病毒感染性的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,以O/CHN/93现用疫苗株的感染性克隆为骨架,分别构建了含口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P和O/CHN/Mya98/... 详细信息

【目的】研究口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)前导蛋白对于病毒感染性的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,以O/CHN/93现用疫苗株的感染性克隆为骨架,分别构建了含口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P和O/CHN/Mya98/HN1前导蛋白的两株嵌合全长cDNA感染性克隆,采用实时荧光定量PCR检测两株不同的嵌合病毒感染猪肾原代细胞后细胞内IFNβ和OAS mRNA的转录情况。【结果】嵌合病毒rOHN1Lab增殖能力较弱,其对应诱导产生的IFNβ和OAS mRNA含量较高,而嵌合毒rO33Lab相对于rOHN1Lab增殖能力较强,他们诱导产生的IFNβ和OAS mRNA含量较低。【结论】研究表明口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P前导蛋白具有更强的抗IFNβmRNA转录的能力,该研究能够为进一步鉴定FMDV前导蛋白抗宿主先天性免疫的关键性位点奠定基础。

关键词：口蹄疫病毒嵌合病毒前导蛋白 IFNβ 转录影响

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口蹄疫病毒A型SAP突变毒株的构建及其生物学特性的测定

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中国兽医科学 2014年第10期44卷 1003-1007页

作者：杨洋杨帆杨波郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

为了获得对牛和猪低致病性或无致病性的口蹄疫(FMD)疫苗毒株,提高疫苗毒株的生物安全性,选择口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白酶编码基因SAP区域进行突变。利用反向遗传操作技术,构建FMDV SAP区域突变的A型病毒重组质粒prA-SAP-FMDV。利用脂质体... 详细信息

为了获得对牛和猪低致病性或无致病性的口蹄疫(FMD)疫苗毒株,提高疫苗毒株的生物安全性,选择口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白酶编码基因SAP区域进行突变。利用反向遗传操作技术,构建FMDV SAP区域突变的A型病毒重组质粒prA-SAP-FMDV。利用脂质体将构建的重组质粒转染BHK21细胞,重组质粒能够致细胞病变(CPE)。连续传代后,经RT-PCR鉴定和间接免疫荧光试验等,SAP突变的重组病毒rA-SAP-FMDV被成功拯救。另外,比较测定了该重组毒与亲本毒rA-WT-FMDV对BHK21细胞和乳鼠的致病性;结果显示,rA-SAP-FMDV的TCID50/mL为10-7.17,LD50为10-6.5/0.2mL,与亲本毒株的生物学特性相似。这一突变SAP域的A型FMDV的获得为研发生物安全性高的A型FMD疫苗奠定了基础。

关键词： A型口蹄疫病毒反向遗传操作 SAP突变病毒拯救

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猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

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西北农业学报 2014年第8期23卷 16-19页

作者：宋江伟田宏吴锦艳陈妍尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室兰州730046

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细... 详细信息

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。

关键词：猪瘟病毒 NS3蛋白表达定位

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猪瘟病毒酵母双杂交pGBKT7-NS3诱饵载体的构建与鉴定

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动物医学进展 2014年第8期35卷 40-43页

作者：宋江伟田宏吴锦艳陈妍尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

利用RT-PCR技术扩增获得猪瘟病毒NS3基因片段,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切,测序验证其正确插入后,将重组诱饵质粒转化酵母菌Y2HGold,检测其在酵母中毒性和自我激活作用,并利用Western blot分析诱饵载体在酵母中的... 详细信息

利用RT-PCR技术扩增获得猪瘟病毒NS3基因片段,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切,测序验证其正确插入后,将重组诱饵质粒转化酵母菌Y2HGold,检测其在酵母中毒性和自我激活作用,并利用Western blot分析诱饵载体在酵母中的转化情况。结果表明,pGBKT7-NS3诱饵载体在Y2HGold酵母细胞中可以表达,此载体在酵母细胞Y2HGold中无毒性和自我激活能力,研究结果为使用酵母双杂交技术筛选相互作用蛋白奠定了基础。

关键词：猪瘟病毒 NS3蛋白酵母双杂交系统诱饵载体

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