检索结果-内蒙古大学图书馆

稳定表达T7RNA聚合酶IBRS-2细胞系的建立以及利用该细胞系对SVDV的体内拯救

生物化学与生物物理进展 2008年第4期35卷 449-456页

作者：郑海学田宏靳野吴锦艳尚佑军刘湘涛谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046 广东省农业科学院兽医研究所广州510640

利用PCR从!溶原性细菌DE3中扩增出T7RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pT7BABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉... 详细信息

利用PCR从!溶原性细菌DE3中扩增出T7RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pT7BABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉素进行传代筛选,形成细胞系IBRST7.对不同代次的IBRST7细胞基因组进行PCR和RT-PCR鉴定,结果表明,T7RNA聚合酶基因在细胞传代过程中能稳定存在,并能表达目的蛋白的mRNA.为了鉴定T7RNA聚合酶在IBRST7细胞内是否具有转录活性,扩增口蹄疫病毒(FMDV)的内部核糖体进入位点(IRES)片段和EGFP基因,定向克隆于原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了T7启动子控制下转录的具有非帽依赖性表达的重组质粒pIERS-EGFP-ET,把该质粒转染IBRST7细胞,能够在紫外显微镜下观察到绿色荧光,说明EGFP得到了表达,表明IBRST7细胞系内的T7RNA聚合酶具有转录活性.然后,利用该细胞系成功拯救出具有感染性的猪水泡病病毒(SVDV),并对其生物学功能进行了鉴定.该细胞系的建立为利用T7RNA聚合酶转录系统体内高效拯救病毒提供了基础.该拯救病毒的策略使RNA拯救简化为一步快速的拯救方法,为进一步探索SVDV病毒致病的分子机制及研制新型SVD疫苗奠定了良好的基础.

关键词： T7RNA聚合酶 IBRST7细胞系假型病毒 SVDV 病毒拯救逆转录病毒载体感染性克隆

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荧光光谱法和分子模拟技术研究考马斯亮蓝G-250与牛血清白蛋白的相互作用

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光谱学与光谱分析 2017年第8期37卷 2474-2479页

作者：王永刚杨光瑞马雪青冷非凡马建忠王晓力兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃兰州730050

采用多种光谱技术结合圆二色谱技术研究了考马斯亮蓝G-250(CBBG-250)相互作用于牛血清白蛋白(BSA),探究了两者之间的作用机理。荧光光谱结果表明BSA与CBBG-250结合形式是静态猝灭,随CBBG-250浓度增加,其形成常数随温度逐渐减小,结合比为... 详细信息

采用多种光谱技术结合圆二色谱技术研究了考马斯亮蓝G-250(CBBG-250)相互作用于牛血清白蛋白(BSA),探究了两者之间的作用机理。荧光光谱结果表明BSA与CBBG-250结合形式是静态猝灭,随CBBG-250浓度增加,其形成常数随温度逐渐减小,结合比为1∶1,根据Stern-Volmer曲线计算焓变值(ΔH)和熵变值(ΔS)分别为-4.38kJ·mol^(-1)和-6.16J·mol^(-1)·K^(-1),均小于零,证明该过程是一个自发过程。傅里叶红外光谱测定结果表明CBBG-250的加入引起BSA结构的变化,随着CBBG-250溶液浓度的增加,BSA中色氨酸微环境极性被改变,在1 600~1 700cm^(-1)(酰胺带Ⅰ)和1 600~1 500cm^(-1)(酰胺带Ⅱ)处的特征吸收带蓝移。其中1 650cm^(-1)移动至1 710cm^(-1),1 544cm^(-1)移动到1 573cm^(-1),显示BSAα-螺旋(1 650~1 658cm^(-1))和β-折叠(1 620~1 640cm^(-1),1 675cm^(-1))结构发生变化,且α-螺旋含量比结合前有所降低。圆二色谱分析结果表明,两者间通过氢键和范德华力为主的作用力使得BSA二级结构发生变化,α-螺旋含量由42.15%下降至1.27%,该结果进一步被分子建模对接技术证明。

关键词：光谱法分子模拟考马斯亮蓝G-250 牛血清白蛋白相互作用

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口蹄疫病毒VP1基因在番茄中的表达及转基因番茄对豚鼠诱导免疫保护

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微生物学报 2006年第5期46卷 796-801页

作者：潘丽张永光王永录王宝琴谢庆阁方玉珍王文秀蒋守田王炜孙元吕建亮刘力宽中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR检测目的基因的整合与转录,ELISA筛选约40%的卡那抗性植株... 详细信息

构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR检测目的基因的整合与转录,ELISA筛选约40%的卡那抗性植株阳性,分别提取两株ELISA和Western blot检测阳性的转基因番茄叶片蛋白与弗氏佐剂乳化,于0、15、30d经肌肉途径免疫豚鼠,第三次免疫后28d用100ID50的同源强毒攻击,根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行转基因植物疫苗免疫原性的评估。结果表明,双元表达载体pBin438/VP1构建正确,PCR、RT-PCR结果证实口蹄疫病毒VP1基因已整合到番茄基因组并在转录水平表达,ELISA和Western blot检测重组蛋白能够与FMDV阳性血清反应。转基因番茄第三次免疫豚鼠后21d血清效价最高可达1∶64,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80%和40%,证明转基因番茄表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性。

关键词：口蹄疫病毒 VP1基因转基因番茄豚鼠免疫原性

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表达H120 S基因膜外区段的重组鸡传染性支气管炎病毒的拯救

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病毒学报 2014年第6期30卷 668-674页

作者：魏衍全郭慧琛王海明孙德惠韩世充孙世琪中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

为探索以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)Beaudette毒株为骨架表达H120纤突蛋白膜外区的可行性,本研究利用RT-PCR技术,扩增得到H120纤突基因膜外区段(1 302bp),将其置换到IBV Beaudette株全长cDNA克隆相应区段,... 详细信息

为探索以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)Beaudette毒株为骨架表达H120纤突蛋白膜外区的可行性,本研究利用RT-PCR技术,扩增得到H120纤突基因膜外区段(1 302bp),将其置换到IBV Beaudette株全长cDNA克隆相应区段,构建了含有上述区段的重组IBV cDNA克隆BeauR-H120(S1)。然后直接将BeauR-H120(S1)作为DNA模板在体外转录出病毒基因组RNA,该转录产物电转入Vero细胞后48h收获细胞继续传代,直至第4代时出现合胞体,拯救获得一株重组IBV(rBeau-H120(S1))。通过RT-PCR方法证明rBeauH120(S1)基因组中包含有完整的H120纤突基因膜外区段。Western-blot试验证实rBeau-H120(S1)的N蛋白有表达,表明重组病毒在Vero细胞内进行了增殖。经连续传代后测定rBeau-H120(S1)的TCID50和EID50,结果显示,该重组病毒在Vero细胞中的滴度可达到105.90±0.22 TCID50/mL,在9日龄SPF鸡胚中生长滴度为106.13±0.23EID50/mL。免疫保护实验表明,在接种重组病毒21d时,鸡群抗体阳性率达到90%,使用强毒株M41(103 EID50/只)攻毒时免疫保护率为85%。本研究采用反向遗传操作技术构建的重组IBV,为进一步研制IBV重组基因工程疫苗奠定了基础。

关键词：传染性支气管炎病毒重组病毒纤突蛋白膜外区 H120株

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三种大肠杆菌表达的口蹄疫病毒A型多表位蛋白对猪的免疫原性比较

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微生物学报 2019年第4期59卷 711-718页

作者：曹轶梅王兴凯王省李坤付元芳李冬卢曾军刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

【目的】研制猪口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)A型多表位蛋白疫苗,为猪FMDV A型的防控提供安全有效的疫苗。【方法】根据前期试验结果及国内外FMDVA型流行病学信息,设计并合成了3种多表位免疫原基因A10、IA10和FA10。... 详细信息

【目的】研制猪口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)A型多表位蛋白疫苗,为猪FMDV A型的防控提供安全有效的疫苗。【方法】根据前期试验结果及国内外FMDVA型流行病学信息,设计并合成了3种多表位免疫原基因A10、IA10和FA10。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化复性后,制苗免疫猪。分别于免疫前和免疫后14和28d采血分离血清,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)方法检测血清IgG抗体滴度。免疫28d后用FMDV强毒攻毒,以评估免疫保护效果。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果证实A10、IA10和FA10三种蛋白均获得表达,分子量分别为35、57和64 kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。LPB-ELISA结果表明,A10+201免疫组IgG滴度低于灭活疫苗组,但高于其他免疫组。攻毒后A10+201免疫组和灭活疫苗免疫组全部猪(5/5)获得保护,IA10+201和FA10+201免疫组80%(4/5)猪保护,A10和FA10免疫组只有20%(1/5)猪保护,而PBS+201组所有猪均未保护。【结论】A10+201免疫保护效果较好,可作为候选疫苗进行进一步评价。

关键词：口蹄疫病毒 A型多表位蛋白疫苗猪

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检测AsiaⅠ型口蹄疫病毒的胶体金免疫层析法的建立及应用

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第11期23卷 1021-1024页

作者：蒋韬梁仲陈涓何继军吕律马维民刘在新刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

目的:建立一种快速、简便的检测AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)的胶体金免疫层析法(GICA)。方法:采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,用其标记纯化的AsiaⅠ型口蹄疫抗体后包被在玻璃纤维素膜上,另外将纯化的AsiaI型口蹄疫抗体和纯化的羊抗豚... 详细信息

目的:建立一种快速、简便的检测AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)的胶体金免疫层析法(GICA)。方法:采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,用其标记纯化的AsiaⅠ型口蹄疫抗体后包被在玻璃纤维素膜上,另外将纯化的AsiaI型口蹄疫抗体和纯化的羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜按顺序组装成胶体金快速诊断试纸条,通过系列实验验证其灵敏度、特异性、重复性及稳定性。结果:研制的AsiaⅠ型口蹄疫快速检测试纸条对AsiaⅠ型口蹄疫病毒的检测灵敏度为0.116mg/L,对阳性样品进行重复性试验3次检测结果完全相同。交叉反应证实该方法与其他血清型口蹄疫抗原和猪水疱病抗原(SVD)无交叉反应。检测田间样品,GICA与反向间接血凝的定型的符合率为96.87%。稳定性实验证实试纸条可保存12个月。结论:建立的GICA是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。

关键词： Asia I型口蹄疫病毒胶体金免疫层析法

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组织蛋白酶S抑制塞内卡病毒在IBRS-2细胞中的复制

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微生物学报 2021年第10期61卷 3305-3314页

作者：史喜绢张婷杨博申超超张大俊陈学辉崔卉梅袁兴国赵登率张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

【目的】本研究旨在探究猪源组织蛋白酶S(cathepsinS,CTSS)对塞内卡病毒(SenecaValley virus,SVV)复制的影响。【方法】SVV感染IBRS-2细胞,采用RT-qPCR在转录水平探究SVV感染对内源性CTSS表达的调控;采用ELISA测定SVV感染对CTSS酶活性... 详细信息

【目的】本研究旨在探究猪源组织蛋白酶S(cathepsinS,CTSS)对塞内卡病毒(SenecaValley virus,SVV)复制的影响。【方法】SVV感染IBRS-2细胞,采用RT-qPCR在转录水平探究SVV感染对内源性CTSS表达的调控;采用ELISA测定SVV感染对CTSS酶活性的影响;通过Western blotting(WB)和RT-qPCR检测过表达CTSS对SVV复制及SVV诱导的抗病毒细胞因子的调控作用;合成针对CTSS的特异性siRNA,利用WB和RT-qPCR检测siRNA对CTSS的干扰效果以及CTSS被干扰后对SVV复制的影响。【结果】结果表明SVV感染IBRS-2细胞能显著上调内源性CTSS表达并增强CTSS酶活性;过表达CTSS能显著抑制SVV在IBRS-2细胞中的复制,同时促进宿主抗病毒细胞因子的表达;siRNA-2947下调内源性CTSS表达进而促进SVV复制。【结论】CTSS通过增强宿主抗病毒细胞因子上调表达而抑制SVV复制,本研究为进一步深入探究宿主CTSS在抗SVV免疫应答中的作用及机制提供参考依据。

关键词：组织蛋白酶S 塞内卡病毒 IBRS-2细胞抗病毒功能

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猪FMDV受体β3亚基配体结合域的基因克隆及其多克隆抗体制备

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第4期24卷 358-361页

作者：独军政高闪电常惠芸丛国正林彤邵军军刘湘涛才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEMT-easy载体相连构建pGEM/β3 L... 详细信息

目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEMT-easy载体相连构建pGEM/β3 LBD,经BamHⅠ/XhoⅠ酶切后回收β3LBD片段,与同样酶切处理的原核表达载体pGEX4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β3 LBD,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达β3LBD蛋白。纯化目的蛋白后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果:猪β3亚基的LBD基因含有507个核苷酸,编码169个氨基酸,猪β3 LBD基因与牛、人、黑猩猩、猕猴、马、犬、挪威大鼠、家鼠、和鸡的β3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90·3%、92·3%、92·1%、91·3%、90·5%、90·3%、87·8%、85·2%、79·5%。哺乳动物的β3亚基LBD基因同源性较高,与鸡的同源性较低。实现了重组猪β3LBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为44000,制备的兔多克隆抗体效价达1∶12800以上。结论:实现了猪FMDV受体β3 LBD的基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备,为深入研究受体β3亚基在FMDV感染过程中的作用机制奠定了基础。

关键词： FMDV病毒受体猪β3LBD基因原核表达多克隆抗体

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口蹄疫病毒Asia1/YNBS/58株全基因组序列分析

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病毒学报 2007年第5期23卷 407-411页

作者：常惠芸独军政丛国正邵军军林彤谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

The full-length genomic sequence of foot-and-mouth disease virus(FMDV) Asia1/YNBS/58 strain was determined by RT-PCR and compared with other 17 reference *** results showed that the complete genome of Asial/YNBS/58 was 8164nt long including a 1061-nt 5′untranslated region(UTR),a 6990-nt open reading frame(ORF),and a 113-nt 3′*** homology analysis indicated that the UTR regions and non-structural proteins were more conserved than the structural proteins in ***1 exhibited the lowest conservation and VP4 was exceptionally *** VP1-,VP2-,and VP3-based phylogenetic trees were divided into distinct clusters according to different serotypes,while the other gene-based phylogenetic trees exhibited some degree of intercross among *** study is the first description of the full-length genomic sequence of FMDV Chinese serotype Asia1.

关键词：口蹄疫病毒 Asia1/YNBs/58株基因组序列分析

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口蹄疫病毒非结构蛋白3AB的原核表达及应用(英文)

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生物工程学报 2011年第2期27卷 180-184页

作者：邵军军常惠芸林彤丛国正独军政高闪电中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

旨在建立一种检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的敏感、特异的ELISA方法。克隆、表达了口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因,原核表达的重组蛋白经亲和层析法纯化及Western blotting鉴定后作为包被抗原,建立检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的3AB间接... 详细信息

旨在建立一种检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的敏感、特异的ELISA方法。克隆、表达了口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因,原核表达的重组蛋白经亲和层析法纯化及Western blotting鉴定后作为包被抗原,建立检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的3AB间接ELISA方法,通过与商品化试剂盒3ABC-ELISA的比对试验对其进行评价。结果显示,重组蛋白3AB以包涵体形式表达;能与口蹄疫病毒感染血清发生特异性反应,而不能与疫苗免疫动物血清发生反应;在检测田间样品时,与3ABC-ELISA具有同样的特异性和敏感性(P>0.05)。因此,认为重组蛋白3AB是一种十分有用的分子标记物,能有效区分口蹄疫病毒感染动物和疫苗免疫动物。

关键词：口蹄疫病毒蛋白反转录聚合酶链反应(RT-PCR) 酶联免疫反应(ELISA)

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