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微生物学报 2008年第3期48卷 312-316页

作者：曹轶梅卢曾军孙普孙甲川刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本研究从AsiaⅠ型FMDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增3C基因,首先克隆到pGEM-T载体,再亚克隆到杆状病毒... 详细信息

口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本研究从AsiaⅠ型FMDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增3C基因,首先克隆到pGEM-T载体,再亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB中,构建出重组转移载体pMel-3C。最后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以10个MOI感染Sf9细胞,接种病毒72h后收获细胞,样品经SDS-PAGE和Westernblot证实3C蛋白获得表达,分子量约23kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。本研究为空衣壳的体外组装及新型抗病毒药物设计的研究奠定了基础。

关键词： FMDV 3C蛋白酶基因 Sf9细胞杆状病毒表达

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不同长度poly(C)对口蹄疫病毒基因工程毒的毒力影响

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微生物学报 2008年第12期48卷 1654-1658页

作者：白兴文李平花孙普李永亮包慧芳卢曾军曹轶梅郭建宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

【目的】研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)poly(C)区段的序列长度与FMDV毒力之间的关系。【方法】首先利用NheⅠ/NotⅠ线化FMDV pGEM-XJ/AKT/69全长重组质粒,制备体外转录本,借助Lipofectamine 2000转染BHK-21细胞,获得基因工程毒。随后,在细胞传代过程中,收取不同代数病毒培养液,提取总RNA进行poly(C)的长度测定,并进行乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID_(50)的测定。【结果】我们发现,基因工程毒在BHK-21上连续传代至第6代时,可见明显的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE);在经过一代乳鼠接种之后再重新适应到BHK-21细胞的过程中,poly(C)区段出现了缩短现象;乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID_(50)测定结果表明,尽管基因工程毒与母本毒相比毒力偏低,但含有不同长度poly(C)的基因工程毒之间并无显著差异。【结论】poly(C)区段的序列长度在12～17个C之间改变对FMDV基因工程毒的毒力无明显的影响。

关键词：口蹄疫病毒基因工程毒 poly(C) 毒力

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猪FMDV受体β3亚基配体结合域的基因克隆及其多克隆抗体制备

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第4期24卷 358-361页

作者：独军政高闪电常惠芸丛国正林彤邵军军刘湘涛才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEMT-easy载体相连构建pGEM/β3 L... 详细信息

目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEMT-easy载体相连构建pGEM/β3 LBD,经BamHⅠ/XhoⅠ酶切后回收β3LBD片段,与同样酶切处理的原核表达载体pGEX4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β3 LBD,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达β3LBD蛋白。纯化目的蛋白后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果:猪β3亚基的LBD基因含有507个核苷酸,编码169个氨基酸,猪β3 LBD基因与牛、人、黑猩猩、猕猴、马、犬、挪威大鼠、家鼠、和鸡的β3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90·3%、92·3%、92·1%、91·3%、90·5%、90·3%、87·8%、85·2%、79·5%。哺乳动物的β3亚基LBD基因同源性较高,与鸡的同源性较低。实现了重组猪β3LBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为44000,制备的兔多克隆抗体效价达1∶12800以上。结论:实现了猪FMDV受体β3 LBD的基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备,为深入研究受体β3亚基在FMDV感染过程中的作用机制奠定了基础。

关键词： FMDV病毒受体猪β3LBD基因原核表达多克隆抗体

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口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第10期24卷 975-978页

作者：高闪电常惠芸独军政王景锋周建华赵建勇谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD,并制备兔抗β6LBD多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体,构建的pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒... 详细信息

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD,并制备兔抗β6LBD多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体,构建的pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA方法测定抗体效价,并以Western blot鉴定其特异性。结果:SDS-PAGE电泳分析显示pGEX-4T-1-β6LBD诱导后表达一Mr约为42000的GST-β6LBD融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,用纯化GST-β6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性。结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白β6LBD多克隆抗体,为深入研究整联蛋白β6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础。

关键词：口蹄疫病毒受体整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体

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口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

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中国农业科学 2008年第11期41卷 3801-3808页

作者：蒋韬梁仲陈涓何继军吕律马维民刘在新刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/... 详细信息

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104LD50(1﹕128倍稀释乳鼠毒)的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。【结论】本试验研发的口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。

关键词： O、A、AsiaI型口蹄疫病毒胶体金免疫层析法

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抗原表位的研究方法及口蹄疫病毒抗原表位的研究进展

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微生物学通报 2008年第8期35卷 1302-1310页

作者：张中旺张永光中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

本文综述了近几年来用于B细胞表位及T细胞表位研究的常用方法及其在口蹄疫病毒抗原表位研究中的应用,并介绍了口蹄疫病毒抗原表位的研究进展。

关键词： B细胞表位 T细胞表位 FMDV

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偶蹄家畜FMDV受体通用亚基αv基因的分子特征及其进化关系

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畜牧兽医学报 2008年第11期39卷 1530-1536页

作者：独军政高闪电常惠芸赵建勇丛国正邵军军林彤刘湘涛才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

已发现至少有αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8 4种整联蛋白是FMDV的细胞受体,αv是4种受体的通用亚基。本试验中从FMDV实验感染猪和牛、健康羊和双峰驼等的肺组织中克隆到了受体通用亚基αv基因,并对其序列进行了比较和进化关系分析。... 详细信息

已发现至少有αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8 4种整联蛋白是FMDV的细胞受体,αv是4种受体的通用亚基。本试验中从FMDV实验感染猪和牛、健康羊和双峰驼等的肺组织中克隆到了受体通用亚基αv基因,并对其序列进行了比较和进化关系分析。结果显示,羊、牛、猪、双峰驼的αv亚基基因的编码区分别含有3147、3147、3141、3165个核苷酸,分别编码1048、1048、1046、1054个氨基酸,信号肽均由氨基端30个氨基酸组成,跨膜区、胞浆区均分别由29、32个氨基酸组成;胞外区分别由957、957、955、963个氨基酸组成。羊、牛、猪、双峰驼αv亚基基因在Gen-Bank中的登录号分别为EU367989、DQ871215、EF474019、EU367990。同源性分析表明,信号肽变异最大,胞外区次之,跨膜区和胞浆区比较保守;进化树表明,与灵长类、啮齿类、奇蹄类、禽类、食肉类等口蹄疫非易感物种相比,口蹄疫易感动物羊、双峰驼、猪、牛等偶蹄家畜αv亚基的亲缘关系较近,处于同一进化分支。这表明受体αv亚基可能与FMDV的宿主范围和组织嗜性有关。

关键词：偶蹄家畜 FMDV受体 αv基因分子特征进化关系

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双重PCR快速鉴别羊痘病毒和羊口疮病毒

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中国人兽共患病学报 2008年第10期24卷 945-948页

作者：颜新敏张强吴国华李健朱海霞朱彩珠中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

根据羊痘病毒的P32基因和羊口疮病毒H2L基因序列设计合成两对引物,建立了一种快速鉴别诊断羊痘病毒和羊口疮病毒的双重PCR方法。该方法可对羊痘病毒和羊口疮病毒分别扩增出969bp和507bp的特异性片段,对痘苗病毒等其它病原和健康羊皮肤... 详细信息

根据羊痘病毒的P32基因和羊口疮病毒H2L基因序列设计合成两对引物,建立了一种快速鉴别诊断羊痘病毒和羊口疮病毒的双重PCR方法。该方法可对羊痘病毒和羊口疮病毒分别扩增出969bp和507bp的特异性片段,对痘苗病毒等其它病原和健康羊皮肤组织不能扩增出任何片段。敏感性试验表明该方法可分别扩增出101.66TCID50山羊痘病毒和102.33TCID50羊口疮病毒。对从甘肃境内采集的11份临床病料进行检测,其中8份可扩增出969bp的羊痘病毒特异性片段,3份可扩增出507bp的羊口疮病毒特异性片段,与病毒分离鉴定结果一致。

关键词：双重PCR 鉴别诊断羊痘病毒羊口疮病毒

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口蹄疫表位疫苗的研究进展

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中国人兽共患病学报 2008年第6期24卷 570-573,591页

作者：张中旺张永光中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

口蹄疫（Foot-and—Mouth Disease，FMD）是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，被国际兽疫局列为头号A类传染病。该病传播途径多、传播速度快，曾多次在世界发生大流行。

关键词：口蹄疫表位疫苗国际兽疫局传播途径传播速度传染病接触性大流行

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H9N2亚型禽流感病毒A／Chicken／Gansu／2／99株基因组的分子特征

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中国人兽共患病学报 2008年第6期24卷 543-547页

作者：独军政侯顺利易华山付生芳常惠芸才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

目的测定H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Gansu/2/99(CK/GS/2/99)分离株的基因组序列并与参考毒株进行同源性分析,阐明该毒株的遗传变异及分子特征。方法采集发病鸡泄殖腔样品,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,采用RT-PCR方法对CK/GS/2/99株的8... 详细信息

目的测定H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Gansu/2/99(CK/GS/2/99)分离株的基因组序列并与参考毒株进行同源性分析,阐明该毒株的遗传变异及分子特征。方法采集发病鸡泄殖腔样品,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,采用RT-PCR方法对CK/GS/2/99株的8个分节段基因进行扩增,分别将其克隆到pGEM-T easy载体后进行序列测定与同源性分析。结果CK/GS/2/99株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的开放阅读框分别由2280、2274、2151、1683、1497、1401、759、864个碱基组成,分别编码759、757、716、560、498、466、252/97、231/122个氨基酸残基。该毒株HA上HA1和HA2裂解位点序列为PARSSR↓GLF,具有典型的低致病性禽流感病毒的特征。同源性分析显示,CK/GS/2/99株与1998-2002年间大部分中国大陆分离株遗传关系较近,尤其与CK/NX/4/99和CK/HB/31/00株遗传关系密切。结论CK/GS/2/99与大部分流行于中国内陆的H9N2亚型毒株均来源于共同的祖先毒株CK/BJ/1/94,这为了解中国H9N2亚型禽流感病毒的分子流行病学提供了资料。

关键词：禽流感病毒 H9N2亚型 A/Chicken/Gansu/2/99 序列分析

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