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中国兽医科学 2018年第7期48卷 811-817页

作者：冯倩吴锦艳王光祥陈妍杜国玉李玲霞尚佑军张志东刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室

为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a（＋）中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a（＋）-ORFV 112,... 详细信息

为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a（＋）中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a（＋）-ORFV 112,并转化到Rosetta（DE3）感受态细胞中,用IPTG进行诱导重组ORFV 112蛋白表达,并分别进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定,并运用生物信息学软件对口疮病毒112蛋白的性质和结构进行预测分析。结果表明,ORFV 112基因的大小约为861 bp;通过重组表达的融合蛋白大小约为40 ku;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该蛋白具有免疫反应原性。预测分析表明,ORFV 112蛋白分子式为C1357H2155N367O451S11,理论等电点（PI）为4.68,消光系数为23 295,脂肪指数为81.78,总平均疏水性（GRAVY）为-0.383,其二级结构主要以α-螺旋（29.37%）和无规则卷曲（40.56%）构成。本研究为深入研究口疮病毒112蛋白结构与功能及该蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

关键词：口疮病毒 ORFV 112基因原核表达生物信息学分析

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羊传染性脓疱病毒耐热冻干保护剂筛选及冻干曲线优化

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中国兽医学报 2018年第2期38卷 266-271页

作者：王光祥尚佑军王艳华宋成怡吴锦艳陈妍田宏刘湘涛张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室

采用冻干试验筛选出保护剂基础配方，再通过Plackett—Burman设计法筛选主要保护剂基质，然后通过Box-Behnken响应面分析法对羊传染性脓疱病毒（ORFV）耐热保护剂配方进一步优化，用冻干试验进一步验证筛选出1种针对ORFV保护效果最好的... 详细信息

采用冻干试验筛选出保护剂基础配方，再通过Plackett—Burman设计法筛选主要保护剂基质，然后通过Box-Behnken响应面分析法对羊传染性脓疱病毒（ORFV）耐热保护剂配方进一步优化，用冻干试验进一步验证筛选出1种针对ORFV保护效果最好的耐热冻干保护剂作为疫苗用候选配方。同时，依据前期试验获得的活疫苗冻干曲线，通过进一步优化，获得疫苗最佳冻千曲线。利用该冻干工艺冻干的疫苗，保护剂的保护率可达95．3％，且疫苗各项指标均达到《中华人民共和国兽用生物制品规程》要求。经37℃保存7，15，30d病毒滴度分别下降0．46，0．70，1．00；2～8℃保存3，6，12，24个月病毒滴度分别下降0．10，0．10，0．40，0．60，证明此配方制备的疫苗具有良好的热稳定性。本试验解决了ORFV细胞弱毒疫苗仅能在低温条件下保存和运输的瓶颈技术问题，使疫苗的储存、运输更为方便。

关键词：羊传染性脓疱病毒耐热冻干保护剂冻干曲线

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羊口疮病毒疫苗株与野毒株VIL-10基因的比较分析

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中国畜牧兽医 2018年第9期45卷 2368-2376页

作者：冯倩吴锦艳陈妍刘永杰张克山尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

试验旨在比较分析羊口疮病毒(orf virus,ORFV)VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的V... 详细信息

试验旨在比较分析羊口疮病毒(orf virus,ORFV)VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的VIL-10基因全序列并进行测序,应用生物信息学相关软件分析基因的核苷酸、氨基酸变异情况及蛋白结构。结果显示,本试验测定的疫苗株和野毒株VIL-10基因核苷酸序列同源性为94.4%,差异主要是单个碱基的突变,其中疫苗株在132~134bp核苷酸序列出现缺失;氨基酸序列同源性为92.5%,出现了15个氨基酸位点的突变,其中疫苗株第42位氨基酸天冬酰胺出现缺失;蛋白质在一级结构及理化性质、二级结构、三级结构、抗原表位参数及有无信号肽之间均存在一定程度的差异,而疫苗株和野毒株编码的蛋白质均无跨膜结构域。系统进化树分析结果表明,本试验测定的野毒株与疫苗株属于不同分支,遗传关系较远。研究结果提示,野毒株与疫苗株的VIL-10基因发生较明显的变异,这些变异可能与ORFV疫苗株的毒力致弱有关。

关键词：羊口疮病毒(ORFV) 疫苗株野毒株 VIL-10基因比较分析

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卵泡刺激素受体FSHR234纳米抗体的分离纯化及多克隆抗体的制备

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微生物学通报 2018年第11期45卷 2463-2469页

作者：李玲霞吴锦艳曹小安冯倩杜国玉尹双辉李江伟尚佑军中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 新疆大学生物资源基因工程重点实验室新疆乌鲁木齐830046

【背景】卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)在人体成熟破骨细胞及单核细胞表面表达,成为阻断卵泡刺激素(FSH)作用的潜在靶点,制备亲和力较高的FSHR抗体已成为靶向治疗FSH相关疾病的切入点。【目的】构建FSHR... 详细信息

【背景】卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)在人体成熟破骨细胞及单核细胞表面表达,成为阻断卵泡刺激素(FSH)作用的潜在靶点,制备亲和力较高的FSHR抗体已成为靶向治疗FSH相关疾病的切入点。【目的】构建FSHR重组载体获得表达量较高的可溶性蛋白,进一步制备骆驼多克隆抗体及其纳米抗体。【方法】利用XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切重组质粒p ET30a-FSHR234,将目的基因fshr构建于p GEX-4T-1载体并进行原核表达,利用Western blot及ELISA检测目的蛋白的配体结合能力。免疫新疆双峰驼制备骆驼多克隆抗体,并利用噬菌体展示技术筛选获得FSHR纳米抗体。细胞免疫化学法检测FSHR抗体在coav-3的表达情况。【结果】构建了pGEX-4T-1-FSHR234重组质粒,获得了表达量较高的FSHR234可溶性蛋白;并构建了5株FSHR纳米抗体,鉴定出一株结合能力较强的纳米抗体,命名为VHH-3F9。【结论】制备的骆驼FSHR多克隆抗体效价达1:128 000,筛选获得的VHH-3F9纳米抗体能与FSHR234具有较高的结合性,且两者均能表达于coav-3细胞表面。

关键词：卵泡刺激素受体 pGEX-4T-1 胞外区纳米抗体

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不同试剂盒检测接种FMDV的牛非结构蛋白抗体结果及分析

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畜牧与兽医 2018年第9期50卷 56-62页

作者：王文莉赵俊皓刘华南卢炳州魏南南张学刚郑海学胡永浩张克山甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室/国家口蹄疫参考实验室.甘肃兰州730046

选取国内外3家不同的研发公司的甲、乙、丙3种试剂盒,利用ELISA方法分别检测了接种A型与O型口蹄疫病毒的牛口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白3ABC抗体的变化规律。结果：接种A型与O型口蹄疫病毒的牛在感染后第3天发病,这与最早检测出阳性的... 详细信息

选取国内外3家不同的研发公司的甲、乙、丙3种试剂盒,利用ELISA方法分别检测了接种A型与O型口蹄疫病毒的牛口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白3ABC抗体的变化规律。结果：接种A型与O型口蹄疫病毒的牛在感染后第3天发病,这与最早检测出阳性的时间相一致,至第9天3ABC抗体全部为阳性;接种A型口蹄疫病毒的牛与接种O型口蹄疫病毒的牛3ABC非结构蛋白抗体应答有差异。选取的3种试剂盒检测显示,每2种试剂盒呈现不同程度的相关性,并且甲试剂盒显示出最大的灵敏度,而乙试剂盒显示最大的特异性,丙试剂盒的敏感性依可疑样品的处理方式而变化。因此,对3种试剂盒进行比较发现甲试剂盒更稳定,更适合于检测。

关键词：口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC抗体

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内生真菌链格孢菌醋酸乙酯提取物对大肠杆菌抑菌机制的研究

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中草药 2018年第2期49卷 374-381页

作者：王永刚杨光瑞马雪青王鸣刚冷非凡王帆马建忠陈吉祥兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 中国科学院青岛生物能源与过程研究所山东青岛266101 兰州理工大学能源与动力工程学院甘肃兰州730050

目的研究分离自药用植物白毛蛇Humata tyermanni的内生真菌链格孢菌发酵产物醋酸乙酯提取物(B06e)对大肠杆菌的抑菌机制。方法采用倍比稀释法测定了B06e对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC);测定了B06e作用前后大肠杆菌培养液电导率、核酸和... 详细信息

目的研究分离自药用植物白毛蛇Humata tyermanni的内生真菌链格孢菌发酵产物醋酸乙酯提取物(B06e)对大肠杆菌的抑菌机制。方法采用倍比稀释法测定了B06e对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC);测定了B06e作用前后大肠杆菌培养液电导率、核酸和蛋白质的变化;结合流式细胞仪、扫描电子显微镜、凝胶阻滞实验、圆二色谱和荧光实时定量PCR的分析方法研究了B06e对大肠杆菌细胞膜结构、形态、DNA的影响。结果 B06e对大肠杆菌的MIC为25μg/m L,3×MIC处理组的电导率是对照组的1.01倍;3×MIC处理组的β-半乳糖苷酶活性是对照组的11.6倍;流式细胞仪分析表明3×MIC处理组被碘化丙啶(PI)染色的阳性细胞比是对照组的286.5倍;扫描电子显微镜结果显示,B06e处理后菌体表面变得粗糙,细胞膜大量塌陷;以上结果说明B06e能增大细胞膜的通透性,破坏细胞膜的完整性。凝胶阻滞、圆二色谱的结果表明,B06e能够以嵌插的方式与DNA结合,但不能降解DNA;实时定量PCR结果表明,经B06e处理后rec A和rec N基因的表达量分别是对照组的2.9和3.7倍,说明B06e能破坏DNA的结构,迫使大肠杆菌启动了SOS修复。结论 B06e通过破坏大肠杆菌细胞膜完整性和DNA的结构,使得细菌代谢紊乱,最终导致细菌丧失了生长繁殖的能力。

关键词：大肠杆菌白毛蛇内生真菌链格孢菌抗菌机制细胞膜通透性细胞膜结构 DNA损伤

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荧光光谱法和分子模拟技术研究考马斯亮蓝G-250与牛血清白蛋白的相互作用

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光谱学与光谱分析 2017年第8期37卷 2474-2479页

作者：王永刚杨光瑞马雪青冷非凡马建忠王晓力兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃兰州730050

采用多种光谱技术结合圆二色谱技术研究了考马斯亮蓝G-250(CBBG-250)相互作用于牛血清白蛋白(BSA),探究了两者之间的作用机理。荧光光谱结果表明BSA与CBBG-250结合形式是静态猝灭,随CBBG-250浓度增加,其形成常数随温度逐渐减小,结合比为... 详细信息

采用多种光谱技术结合圆二色谱技术研究了考马斯亮蓝G-250(CBBG-250)相互作用于牛血清白蛋白(BSA),探究了两者之间的作用机理。荧光光谱结果表明BSA与CBBG-250结合形式是静态猝灭,随CBBG-250浓度增加,其形成常数随温度逐渐减小,结合比为1∶1,根据Stern-Volmer曲线计算焓变值(ΔH)和熵变值(ΔS)分别为-4.38kJ·mol^(-1)和-6.16J·mol^(-1)·K^(-1),均小于零,证明该过程是一个自发过程。傅里叶红外光谱测定结果表明CBBG-250的加入引起BSA结构的变化,随着CBBG-250溶液浓度的增加,BSA中色氨酸微环境极性被改变,在1 600~1 700cm^(-1)(酰胺带Ⅰ)和1 600~1 500cm^(-1)(酰胺带Ⅱ)处的特征吸收带蓝移。其中1 650cm^(-1)移动至1 710cm^(-1),1 544cm^(-1)移动到1 573cm^(-1),显示BSAα-螺旋(1 650~1 658cm^(-1))和β-折叠(1 620~1 640cm^(-1),1 675cm^(-1))结构发生变化,且α-螺旋含量比结合前有所降低。圆二色谱分析结果表明,两者间通过氢键和范德华力为主的作用力使得BSA二级结构发生变化,α-螺旋含量由42.15%下降至1.27%,该结果进一步被分子建模对接技术证明。

关键词：光谱法分子模拟考马斯亮蓝G-250 牛血清白蛋白相互作用

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山羊CLAⅠα链基因的克隆及生物信息学分析

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中国畜牧兽医 2017年第7期44卷 2065-2070页

作者：邓阳吴国华颜新敏赵志荀李杨李健窦永喜张志东张强中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室兰州730046

为探究山羊CLAⅠα链基因的多态性,本试验根据GenBank中山羊CLAⅠα链基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从10个品系山羊白细胞中克隆山羊CLAⅠα链基因,测序后进行生物信息学分析。结果表明,CLAⅠα链基因长度为1 074bp,编码357个氨基酸... 详细信息

为探究山羊CLAⅠα链基因的多态性,本试验根据GenBank中山羊CLAⅠα链基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从10个品系山羊白细胞中克隆山羊CLAⅠα链基因,测序后进行生物信息学分析。结果表明,CLAⅠα链基因长度为1 074bp,编码357个氨基酸。经核苷酸序列分析发现,10个品系山羊CLAⅠα链基因同源性集中在82.8%~99.5%之间。将10个品系山羊CLAⅠα链基因核苷酸推导的氨基酸序列进行比对,发现突变集中在α1区域(22—110位氨基酸)与α2区域(111—203位氨基酸)。遗传进化分析表明,GenBank中山羊CLAⅠα链基因与红寺湖绒山羊、河西绒山羊、陕北绒山羊、阿尔巴斯绒山羊的CLAⅠα基因遗传关系较近,与其他6个品系山羊,即简阳大耳山羊、金堂黑山羊、西农萨能奶山羊、美姑山羊、大足黑山羊、努比亚山羊的CLAⅠα基因遗传关系较远。本试验结果为进一步研究CLAⅠα链基因的多态性奠定了理论基础。

关键词：山羊 CLAⅠα链基因克隆生物信息分析

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MHC四聚体技术研究进展

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黑龙江畜牧兽医 2017年第9期 74-79页

作者：邓阳高顺平吴国华张强中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室兰州730046

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)-四聚体(tetramer)技术是模拟生物体内抗原提呈原理,将4分子的生物素化的MHC-抗原肽单聚体与1分子荧光标记的链霉亲合素连接成四聚体复合物,定向、定量对抗原特异性T细胞进... 详细信息

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)-四聚体(tetramer)技术是模拟生物体内抗原提呈原理,将4分子的生物素化的MHC-抗原肽单聚体与1分子荧光标记的链霉亲合素连接成四聚体复合物,定向、定量对抗原特异性T细胞进行分析及检测。该技术已被用于疾病诊断、疾病防控和相关科学研究,尤其在病毒、癌症、自身免疫疾病方面具有广阔的应用前景,是当今免疫学和分子生物学领域研究的热点之一。文章就MHC的分子结构基础,四聚体的制备、优化及其应用做一综述。

关键词： MHCⅠ类分子 MHCⅡ类分子抗原特异性T细胞抗原肽四聚体

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针对境外口蹄疫疫情的疫苗储备毒株的构建和生物学特性分析

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中国兽医科学 2017年第8期47卷 988-992页

作者：寻广谨李平花孙普马雪青白兴文卢曾军陈应理包慧芳李冬曹轶梅付元芳张婧刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子... 详细信息

针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子显微镜、蚀斑表型及一步生长曲线鉴定和分析重组病毒。结果显示,成功拯救到含O/PanasiaⅡ和A/Iran05型毒株P1基因的嵌合口蹄疫病毒,且嵌合基因可以随病毒在细胞上稳定传代,但P1基因的替换在一定程度上影响了两嵌合病毒在BHK21细胞上的复制能力,使得嵌合病毒在BHK21上完全CPE时间长达19 h左右。2株嵌合病毒的成功拯救可为未来我国边境地区口蹄疫的有效防控提供坚实的技术储备。

关键词：口蹄疫病毒 P1基因构建生物学特性分析

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